COVID-19大流行对全球公共卫生构成了前所未有的威胁。但是，人们对COVID-19，SARS-CoV-2病毒病原体与宿主先天免疫之间的相互作用了解甚少。在这里，我们显示SARS-CoV-2诱导明显但延迟的I型干扰素（IFN）反应。通过筛选23种病毒蛋白，我们发现SARS-CoV-2 NSP1，NSP3，NSP12，NSP13，NSP14，ORF3，ORF6和M蛋白抑制仙台病毒诱导的IFN-β启动子激活，而NSP2和S蛋白发挥相反的作用。进一步的分析表明，ORF6同时抑制I型IFN的产生和下游信号传导，并且ORF6的C端区域对其拮抗作用至关重要。最后，我们发现IFN-β治疗有效阻断SARS-CoV-2复制。综上所述，
截至2020年6月8日，一种新型人类冠状病毒（SARS-CoV-2）出现并造成6,931,000例病例，其中400,857例死亡涉及185个国家，地区或领地（https://covid19.who.int/），对全球公共卫生构成巨大威胁。世界卫生组织（WHO）已于2020年3月11日宣布COVID-19成为大流行病（www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/events-as-they-happen）。SARS-CoV的-2属于冠状家族，Orthocoronavirinae亚科，Betacoronaviruses属，Sarbecovirus亚属1。继SARS-CoV之后，SARS-CoV-2是第二种起源于蝙蝠的病毒，可以感染人类的蝙蝠。Sarbecovirus 1，2，3。SARS-CoV-2的发病机理仍然未知。
在其他病毒类似Sarbecovirus，SARS-CoV的-2的基因组是大约29.7 kb的长与短非翻译区（UTR）中5'和3'末端1，3。SARS-CoV-2基因组编码刺突（S），包膜（E），膜（M），核衣壳（N）蛋白，辅助蛋白3、6、7a，7b，8和9b，并包含较大的开放阅读框架（ORF）编码1ab 1，其木瓜蛋白酶样蛋白酶（NSP3）和3C样蛋白酶（NSP5）4进一步切割成15种非结构蛋白（NSP1-10、12-16）。与SARS-CoV不同，SARS-CoV-2基因组编码完整的ORF8，但不编码8b。SARS-CoV的-2的基因组中具有与SARS-CoV的79％核苷酸同一性1。
先天免疫是针对病毒感染的宿主防御的第一线和通过识别病原体相关的分子模式（PAMP）经由主机模式识别受体（PRR）发起的5，6，7，8。I型干扰素系统是先天免疫反应的重要组成部分。双链RNA（dsRNA的），该冠状基因组复制和转录过程中产生的9，10，可以由RIG-I样受体（RLRS），包括视黄酸可诱导的基因被识别I（RIG-I）和/或黑色素瘤分化基因5（MDA5）在细胞质中11，12在核内体，或通过toll样受体（TLR）13，14。RIG-I和MDA5的两个胱天蛋白酶活化募集结构域（CARD）可与适配器线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS，也称作IPS-1，VISA，和CARDIF）相互作用15，16，17，18，其随后新兵两种与IKK相关的激酶，TANK结合激酶1（TBK1）和可诱导的IκB激酶（IKKi），两者均磷酸化干扰素调节因子3/7（IRF3 / 7）19。磷酸化和二聚化后，IRF3 / 7转移到细胞核中以激活IFN-α/β的表达20，21。同时，MAVS通过TRAF6募集TANK1并激活NF-κB信号通路，这可能会促进细胞因子的产生15。可替代地，可以的PAMP通过Toll样受体（TLR），和下游衔接蛋白TRIF或MyD88的识别可能预示以诱导细胞因子和趋化因子生产13，22，23。
IFN-α/β一经分泌，便充当自分泌和旁分泌因子，通过Janus激活激酶（Jak）信号转导子和转录激活子（STAT1）信号转导通路诱导IFN刺激基因（ISG）的表达。ISG是干扰素介导的抗病毒反应的主要效应物24。因此，病毒已经开发出多种策略来抵抗干扰素应答。冠状病毒例如SARS冠状病毒可通过（1）避免通过的PRR被识别干扰素产生抑制25，26，（2）影响RIG-I或TLR的信号传导27，和（3）阻止IRF3活化28。此外，SARS-CoV可以通过阻断STAT1 29的核易位而拮抗IFN产生下游的信号通路。但是，SARS-CoV-2是否以及如何拮抗IFN的产生和信号尚不清楚。
几种SARS-CoV蛋白已被鉴定为IFN拮抗剂。附件开放阅读框6（ORF6）在抵抗宿主抗病毒反应和病毒复制30中起关键作用。ORF6通过抑制IRF3 31的磷酸化和核易位来抑制仙台病毒（SeV）介导的IFN诱导。ORF6还可以通过与KPNA2相互作用来抑制STAT1核转运而不影响其磷酸化31，它介导KPNAB结合ORF6-KPNA2复合物29。
在这里，我们调查了SARS-CoV-2与宿主抗病毒应答之间的相互作用。我们证明了宿主固有的免疫反应是由多种病毒蛋白靶向的，其中ORF6会强力干扰IFN产生上游和下游的信号通路。此外，我们显示SARS-CoV-2对IFN治疗敏感。我们的结果提供了对SARS-CoV-2与宿主之间相互作用的机械性见解。
为了了解SARS-CoV-2与宿主抗病毒应答之间的相互作用，我们首先检查了SARS-CoV-2感染是否诱导IFN-β和IFN诱导基因56（ISG56）的表达。气道上皮细胞系Calu-3被模拟感染或被SARS-CoV-2感染。并行地，分别用SeV和poly（I：C）感染或转染细胞，这两种细胞通常都用于刺激抗病毒信号通路。在感染后的不同时间点（hpi），收获细胞以通过定量PCR分析确定宿主和病毒RNA的水平，并收集上清液并进行TCID 50测定病毒滴度的方法。从病毒转录物和复制病毒的数量增加，感染时间延长的情况来看，SARS-CoV-2在Calu-3细胞中复制良好（图 1a，b）。SARS-CoV-2感染后，IFN-β和ISG56的表达仅略微升高直至12 hpi，但在24 hpi时被强烈诱导（图 1c，d）。相反，即使SeV RNA的产量比SARS-CoV-2少得多，SeV感染最早可在4 hpi时刺激IFN-β和ISG56的表达，并在8 hpi达到峰值（图 1e–g）。此外，聚（I：C）诱导IFN-β和ISG56表达的动力学模式与SeV感染中检测到的相似（图 1h，）。这些观察结果表明，SARS-CoV-2感染刺激了大量但延迟的IFN产生，表明SARS-CoV-2感染减弱了宿主的抗病毒反应。
将 Calu-3细胞模拟感染或以MOI为0.5感染SARS-CoV-2。感染后第4、8、12和24小时，使用SYBR green方法通过定量实时PCR（qRT-PCR）评估从细胞中提取的总RNA。数据表示为相对于GAPDH对照的病毒N基因的RNA水平的倍数变化。bCalu-3细胞被模拟感染或被SARS-CoV-2感染，MOI为0.5。感染后第4、8、12和24小时，收集上清液，并使用TCID 50分析检测病毒滴度。来自a的c，d个细胞收集细胞，并使用SYBR green方法通过qRT-PCR评估从细胞中提取的总RNA。数据表示为相对于GAPDH对照的IFNB mRNA c和ISG56 mRNA d水平的倍数变化。e– g Calu-3细胞被模拟感染或被仙台病毒感染。如c和d中所述收获细胞并进行分析。^ h，我用高分子量聚（I：C）（聚（I：C）-HMW）转染Calu-3细胞。在指定的时间收获细胞并通过qRT-PCR进行分析。所有实验至少进行了两次，并显示了一位代表。误差棒表示技术三次重复的SD。* P <0.05，** P <0.01和*** P <0.001，两尾学生t检验。源数据作为源数据文件提供。
探讨其中的蛋白质SARS-COV-2能够调节先天免疫反应，我们克隆了SARS-COV-2基因密码子优化后，包括非结构基因NSP1-10，NSP12 - 16，结构基因S，E，M，和ñ，以及辅助蛋白基因ORF3，ORF6，ORF7a和ORF8（图 2a）。由于43个氨基酸（aa）的大小较小，因此未包含ORF7b。由于难以合成5835 bp的全长NSP3，克隆了一个编码木瓜蛋白酶样2结构域的NSP3片段（核苷酸序列2250-3183）。蛋白质印迹显示所有基因都可以表达，尽管表达水平不同（图2）。 2b）。接下来，我们评估了单个SARS-CoV-2蛋白对IFN-β启动子激活的影响。293T细胞用载体质粒或表达SARS-CoV-2蛋白的质粒，以及IFN-β启动子驱动的荧光素酶报道质粒（pIFN-β-Luc）和对照pRL-TK质粒瞬时转染。24小时后，用SeV刺激细胞12小时，并测定荧光素酶活性。我们发现SARS-CoV-2蛋白对SeV诱导的IFN-β启动子激活产生了不同的影响。NSP1，NSP3，NSP12，NSP13，NSP14，ORF3，ORF6和M的表达显着抑制了SeV介导的IFN-β激活，而NSP2和S蛋白则表现出相反的作用（图 2c）。此外，当RIG-IN过表达刺激IFN-β启动子活性时，NSP1，NSP3，NSP12，NSP13，NSP14，ORF3，ORF6，E和M能够概括其抑制活性（组成性活性N端结构域RIG-I）或MDA5（图 2d，e）。SeV蛋白，RIG-IN和MDA5的表达水平如图 2f–h所示。这些结果表明SARS-CoV-2蛋白可能在调节宿主固有免疫反应中发挥多效性作用。
a SARS-CoV-2基因组的示意图。基因组依次包括5'UTR-ORF1a-ORF1b-S-ORF3-EM-ORF6-ORF7（7a和7b）-ORF8-N-3'UTR。描绘了十五个非结构蛋白，四个结构蛋白和四个辅助蛋白。b SARS-CoV-2基因的蛋白表达。将HEK293T细胞用500ng质粒转染到24孔板中。通过蛋白质印迹检测蛋白质表达。β-肌动蛋白用作负载对照。c SARS-CoV-2蛋白对SeV诱导的IFN-β启动子激活的影响。用IFN-β报告质粒，对照质粒或表达指定的SARS-CoV-2蛋白的质粒转染HEK293T细胞。转染后24小时，将细胞用SeV感染12小时，并测量荧光素酶活性。d，e SARS-CoV-2蛋白对RIG-IN和MDA5诱导的IFN-β启动子激活的影响。HEK293T细胞用IFN-β启动子的质粒，以及对照质粒或用表达质粒显示SARS-CoV的-2蛋白转染，连同表达RIG-IN的质粒d或MDA5 Ë。转染后24小时，收获细胞并测量荧光素酶活性。f – h SARS-CoV-2蛋白，RIG-IN和MDA5的表达水平。c – e细胞的裂解液进行蛋白质印迹分析。箭头指示SARS-CoV-2蛋白的印迹残留物。所有实验至少进行了两次，并显示了一位代表。误差棒表示技术三次重复的SD。* P <0.05，** P <0.01和*** P <0.001，两尾学生t检验。源数据作为源数据文件提供。
考虑到SARS-CoV的-2 ORF6股SARS-CoV的ORF6（补充图的至少序列相似 1A，B）1，其显示出在多个步骤抵消宿主抗病毒反应29，31，我们针对SARS的功能-CoV-2 ORF6。免疫荧光实验表明，ORF6主要位于细胞质中，并与高尔基体和内质网标记物部分共定位（补充图 1c）。ORF6以剂量依赖性方式抑制SeV和高分子量poly（I：C）诱导的IFN-β启动子激活，这被认为分别刺激RIG-1和MDA5信号通路（图 3a，b）。此外，我们检查了ORF6在信号级联反应的哪一步阻断了抗病毒先天免疫应答。我们共转染越来越多的ORF6表达质粒与编码参与先天抗病毒应答的关键信号蛋白的质粒，并确定了IFN-β启动子的激活。如图 3c-f所示，ORF6的过量表达以剂量依赖的方式抑制了RIG-IN，MDA5，MAVS和IRF3-5D（组成性IRF3突变体）触发的IFN启动子激活。这些结果证明ORF6在IRF3激活的水平或下游抑制IFN-β的产生。此外，SARS-CoV-2 ORF6和SARS-CoV ORF6对MAVS和IRF3诱导的IFN-β启动子激活具有相似的抑制作用（图 3g，h）。最后，免疫荧光分析表明，SeV诱导的IRF3核移位在过表达ORF6的细胞中得到了阻止（图 3i），证实了ORF6阻断了IRF3的激活。
a SARS-CoV-2 ORF6对SeV诱导的IFN-β启动子激活的影响。用IFN-β报道的质粒，对照质粒或增加量的表达ORF6的质粒转染HEK293T细胞。用SeV感染细胞12小时，并测定荧光素酶活性。b SARS-CoV-2 ORF6对聚（I：C）诱导的IFN-β启动子激活的影响。如在描述的转染HEK293T细胞一个。感染后24小时，将细胞用高分子量聚（I：C）（聚（I：C）-HMW）转染12小时，并测定萤光素酶活性。c– fORF6对RIG-IN，MDA5，MAVS或IRF3诱导的IFN-β启动子激活的影响。将HEK293T细胞用IFN-β报告质粒，对照质粒或表达ORF6的逐渐增多的质粒以及表达RIG-IN（c），MDA5（d），MAVS（e）或IRF3-5D的质粒转染（f）。转染后24小时，测量荧光素酶活性。g，h SARS-CoV ORF6和SARS-CoV-2 ORF6对MAVS和IRF3-5D诱导的IFN-β启动子激活的影响。293T细胞用IFN-β报告质粒，对照质粒或表达SARS-CoV ORF6或SARS-CoV-2 ORF6的质粒以及表达MAVS的质粒转染（g）或IRF3-5D（h）。转染后24小时，测量荧光素酶活性。iIRF3和SARS-CoV-2 ORF6的共聚焦免疫荧光成像。用对照质粒或表达SARS-CoV-2 ORF6的质粒转染HEK293细胞。感染后24小时，细胞被SeV感染。感染后4小时，将细胞用指定的抗体染色并进行免疫荧光分析。红色：IRF3抗体信号；绿色：ORF6信号；蓝色：DAPI（细胞核染色）。合并1和合并2分别指示合并的红色和绿色通道以及合并的红色，绿色和蓝色通道。比例尺，10μm。所有实验至少进行了两次，并显示了一位代表。误差棒表示技术三次重复的SD。* P <0.05，**P <0.01和*** P <0.001，两尾学生t检验。源数据作为源数据文件提供。
由于SARS-CoV ORF6的C末端对于其拮抗活性至关重要，因此29我们随后检查了SARS-CoV-2的C末端在IFN抑制中的作用。生成了三个带有C末端突变的ORF6变体，包括ORF6-M1（用丙氨酸取代的aaa 49-52），ORF6-M2（用丙氨酸取代的aaa53-55）和ORF6-M3（用丙氨酸取代的aaa 56-61）。 （图 4a）。然后，测定了野生型和ORF6突变体对IFN启动子激活的影响。我们发现，ORF6-M1的过表达抑制了RIG-IN，MDA5，MAVS和IRF3-5D触发的IFN-β启动子激活，其水平与野生型ORF6的过表达相当或更低（图 4b–e）。相反，ORF6-M2和ORF6-M3表现出严重削弱的抑制活性。而且，SeV诱导的IRF3核易位受到野生型和ORF6的M1形式的过表达的阻碍，而ORF6-M2和ORF6-M3没有影响（补充图 2）。因此，我们得出结论，SARS-CoV-2 ORF6的C末端尾部从aa 53到61对于其拮抗活性是必不可少的，而aa 49到52则是必需的。
SARS-CoV-2 ORF6变体的示意图。ORF6-WT：野生型； ORF6-M1：第49-52位氨基酸被丙氨酸取代； ORF6-M2：第53-55位氨基酸被丙氨酸取代；ORF6-M3：56至61个氨基酸被丙氨酸取代。b – e ORF6突变体对IFN-β启动子激活的影响。HEK293T细胞用IFN-β报告质粒，对照质粒或表达野生型ORF6或所示ORF6变体的质粒以及表达RIG-IN（b），MDA5（c），MAVS（d）或IRF3的质粒转染-5D（e）。转染后24小时，测量荧光素酶活性。通过蛋白质印迹检测蛋白质表达水平。所有实验至少进行了两次，并显示了一位代表。误差棒表示技术三次重复的SD。* P <0.05，** P <0.01和*** P <0.001，ns不显着，两尾学生t检验。源数据作为源数据文件提供。
我们进一步检查了SARS-CoV-2蛋白是否影响I型IFN的下游信号传导。为此，将细胞与载体质粒或表达SARS-CoV-2蛋白的质粒以及干扰素刺激的反应元件（ISRE）报告质粒一起共转染。24小时后，将细胞用800U / mlIFN-β处理12小时，然后进行双重荧光素酶测定。该测定法揭示了NSP1，NSP3，NSP13，NSP14，ORF6，ORF8，N和S蛋白抑制IFN-β诱导的ISRE启动子活性，而NSP6，NSP9，NSP12和E蛋白显示出刺激作用（图 5a）。接下来，我们关注ORF6。ORF6的过表达以剂量依赖的方式抑制了ISRE和ISG56启动子的荧光素酶表达（图 5b，c）。由于IFN-β处理后ISRE或ISG56启动子的表达取决于IFN受体信号，因此这些数据证明ORF6拮抗IFN下游的信号。此外，SARS-CoV ORF6和SARS-CoV-2 ORF6对IFN-β诱导的ISRE或ISG56启动子激活表现出相当的抑制作用（图 5d，e）。
a SARS-CoV-2蛋白对ISRE启动子激活的影响。用ISRE报告质粒，对照质粒或表达指定SARS-CoV-2蛋白的质粒转染HEK293T细胞。转染后24小时，将细胞用800U / ml的人IFN-β处理12小时，并测量荧光素酶活性。b，c SARS-CoV-2 ORF6对ISRE和ISG56启动子活性的影响。HEK293T细胞用ISRE报告质粒（b）和ISG56报告质粒（c），控制质粒或表达SARS-CoV-2 ORF6的质粒数量增加。转染后24小时，将细胞用800U / ml的人IFN-β处理12小时，并测量荧光素酶活性。d，e SARS-CoV ORF6和SARS-CoV-2 ORF6对ISRE和ISG56启动子的影响。用ISRE报道质粒（d）或ISG56报道质粒（e）以及表达SARS-CoV ORF6或SARS-CoV-2 ORF6的对照质粒转染HEK293T细胞。转染后24小时，将细胞用800U / ml的人IFN-β处理12小时，并测量荧光素酶活性。所有实验至少进行了两次，并显示了一位代表。误差棒表示技术三次重复的SD。*P <0.05，** P <0.01和*** P <0.001，两尾学生t检验。源数据作为源数据文件提供。
然后，我们研究了ORF6抑制IFN信号转导的机制。结合其受体后，IFN-β激活Jak-STAT通路，其中Jak1和Tyk2激酶使STAT1和STAT2磷酸化，从而触发其二聚化和核转运24。在293T细胞中，在SARS-CoV和SARS-CoV-2 ORF6存在下，IFN诱导的STAT1磷酸化保持完整（图 6a）。相反，成熟的Jak激酶抑制剂SOCS1的表达基本上抑制了STAT1的磷酸化（图 6a）。这些数据表明ORF6不会干扰STAT1磷酸化上游的信号级联。在Vero细胞中观察到了相似的结果，它们缺乏I型IFN基因但保留了IFN受体（补充图。 3）。
一个 SARS-CoV的ORF6和SARS-CoV的-2 ORF6的影响IFN-β诱导的STAT1的磷酸化。用对照质粒或表达SARS-CoV ORF6，SARS-CoV-2 ORF6或SOCS1的质粒转染HEK293T细胞。转染后24小时，将细胞不处理或用1000 U / mlIFN-β处理30分钟。通过蛋白质印迹分析检测STAT1的磷酸化。bSARS-CoV ORF6和SARS-CoV-2 ORF6对IFN-β诱导的STAT1核易位的影响。用表达SARS-CoV ORF6和SARS-CoV-2 ORF6的质粒转染Vero细胞。转染后24小时，将细胞用1000 U / mlIFN-β处理30分钟，并用所示抗体染色。合并1和合并2分别指示合并的红色和绿色通道以及合并的红色，绿色和蓝色通道。比例尺，10μm。c定量STAT1的核易位。所有实验至少进行了两次，并显示了一位代表。误差棒表示技术三次重复的SD。*** P <0.001，两尾学生t检验。源数据作为源数据文件提供。
观察到ORF6抑制了ISRE / ISG56启动子的激活，同时不影响STAT1的磷酸化，然后我们询问ORF6的过表达是否调节STAT1从细胞质到细胞核的转运。用表达SARS-CoV或SARS-CoV-2 ORF6的质粒转染细胞。24小时后，将细胞用IFN-β处理30分钟，并分析STAT1的定位。免疫荧光分析表明，表达SARS-CoV ORF6或SARS-CoV-2 ORF6的细胞显示出罕见的STAT1核定位，而ORF6缺失的细胞则显示出大量的STAT1核分布（图 6b，c），表明SARS-CoV和SARS-CoV-2 ORF6抑制了IFN-β触发的STAT1核易位。最后，我们检测到SARS-CoV-2 ORF6 C末端变异体对STAT1激活的影响。我们发现，在相当的程度上，ORF6-M1和野生型ORF6均抑制IFN诱导的ISRE / ISG56启动子的激活和易位（图 7a–c），而未能影响IFN刺激的STAT1磷酸化（补充图 4）。 。ORF6-M2和ORF6-M3在那些测定中没有作用。此外，用针对磷酸STAT1的特异性抗体进行的免疫荧光分析显示了与图7c相同的结果 （补充图 4b））。总之，这些数据表明，C末端尾氨基酸53–61对于ORF6拮抗STAT1核转运而不是磷酸化的活性至关重要。
a，b SARS-CoV-2 ORF6及其突变体对IFN-β诱导的ISRE和ISG56启动子激活的影响。将HEK293T细胞用ISRE报告质粒（a）或ISG56报告质粒（b）以及表达野生型或所示SARS-CoV-2 ORF6变体的对照质粒转染。转染后24小时，将细胞用800U / mlIFN-β处理12小时，并测量荧光素酶活性。通过蛋白质印迹分析检测蛋白表达水平。CSARS-CoV-2 ORF6及其变体对IFN-β诱导的STAT1核易位的影响。用表达野生型ORF6或指定的ORF6变体的质粒转染Vero细胞。转染后24小时，将细胞用1000U / ml的人IFN-β处理30分钟，并用所示抗体染色。合并1和合并2分别指示合并的红色和绿色通道以及合并的红色，绿色和蓝色通道。比例尺，10μm。所有实验至少进行了两次，并显示了一位代表。误差棒表示技术三重复的SD，** P <0.01和*** P <0.001，ns不显着，两尾学生t检验。源数据作为源数据文件提供。
最后，我们检查了IFN-β治疗对SARS-CoV-2感染的影响。将Calu-3细胞用100或500 U / ml重组人IFN-β预处理18小时以触发IFN反应，然后通过ISG基因ISG54和ISG56的上调表达来验证其激活（图 8a，b）。然后，以0.5的MOI用SARS-CoV-2感染细胞24小时。我们发现，IFN-β处理以剂量依赖的方式减少了病毒转录物的数量和复制病毒的产生（图 8c，d）。总体而言，结果表明SARS-CoV-2对IFN-β治疗敏感。
一个，b的表达ISG54和ISG56在IFN-β治疗。将Calu-3细胞未经处理或用100或500 U / ml重组人IFN-β处理18小时。提取总RNA，并通过qRT-PCR检测ISG54和ISG56 mRNA。c SARS-CoV-2对IFN-β治疗的敏感性。将Calu-3细胞未经处理或用100或500 U / ml人IFN-β预处理18小时，然后以0.5的MOI模拟感染或感染SARS-CoV-2细胞。感染后24小时后，使用SYBR green通过qRT-PCR检测到SARS-CoV-2 RNA。d病毒滴度评估。c的上清液收获并进行TCID 50分析以测量病毒滴度。所有实验至少进行了两次，并显示了一位代表。误差棒表示技术三次重复的SD。*** P <0.001（***），两尾学生t检验。源数据作为源数据文件提供。
宿主先天免疫应答的病毒拮抗作用对于病毒复制至关重要，通常决定感染的结果。逃避宿主免疫监视将导致不受抑制的病毒复制，这可能会导致过度活跃的宿主促炎反应，称为高细胞血症或细胞因子风暴，并最终导致有害的结果32。在COVID-19的严重的情况下，高细胞因子血症和急性呼吸窘迫综合征（ARDS），观察到33，34，35，但其基本机制仍不清楚。在当前的研究中，我们揭示了SARS-CoV-2在培养细胞中诱导了异常的I型IFN反应，因为在病毒感染的早期几乎不诱导IFN-β和ISG56的表达，而在后期则激增。这种延迟的抗病毒反应可能为病毒复制提供一个窗口。实际上，在SARS-CoV-2感染的细胞中，在IFN诱导之前观察到大量的病毒转录物。这个辅音，是在COVID-19案件症状出现后不久检测病毒载量高36。因此，我们推测缺乏及时和充分的抗病毒反应可能是COVID-19发病机制的核心。
众所周知，SARS-CoV已经开发出多种对抗宿主抗病毒反应的策略37。在这些，ORF6被认为是这种蛋白质限制都IFN生产和下游信号发挥了关键作用29，31。值得注意的是，SARS-CoV-2的ORF6与SARS-CoV的序列相似性最低（〜66％），并且差异主要在C端序列中观察到。此外，与SARS-CoV相比，SARS-CoV-2在其ORF6末端有两个氨基酸截短。考虑到SARS-CoV ORF6的C末端尾巴具有拮抗作用29，我们推断ORF6在SARS-CoV-2中保持等效功能。在当前的研究中，我们揭示了SARS-CoV-2和SARS-CoV的ORF6在抑制IRF3激活和STAT1核易位方面表现出相似的细胞分布和相当的能力。因此，尽管发生了基因改变，SARS-CoV-2 ORF6仍具有拮抗宿主固有免疫反应的全部能力，这表明这种拮抗作用在进化上很重要。值得注意的是，SARS-CoV中ORF6 C末端尾部的最后几个氨基酸DEEPMELDYP 29，以及SARS-CoV-2中的DEEQPMEID，对于ORF6阻止IRF3和STAT1激活的功能是必不可少的。因此，我们假设这些富含负电荷残基的氨基酸可能提供介导ORF6与宿主蛋白相互作用的界面，从而发挥其拮抗活性。该序列可能是治疗靶标，因为针对该基序的小封闭肽可能会缓解SARS-CoV-2的毒力。最近，为了绘制SARS-CoV-2-人蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的图谱，Gordon等人。确定ORF6与NUP98和RAE1相互作用，形成核孔复合体38。ORF6可能通过与这些核孔蛋白相互作用来阻止IRF3和STAT1核易位。该假设有待进一步研究。
除ORF6外，几种SARS-CoV蛋白，包括NSP1，ORF3b，M，N和其他蛋白，都可以充当IFN拮抗剂37。在这里，我们发现SARS-CoV-2的NSP1和M也抑制了SeV诱导的IFN产生。此外，观察到过表达NSP12和NSP13，其负责冠状基因组复制酶时此抑制作用39。值得注意的是，在PPI研究中38NSP13被确定与TBK1及其适配器TBKBP1交互。因为TBK1在先天抗病毒反应中起着重要作用，所以我们推测NSP13可以减轻IFN产生抑制TBK1活性的作用。有趣的是，SARS-CoV-2的NSP2和S对IFN的诱导具有明显的刺激作用。这一出乎意料的观察结果混淆了SARS-CoV蛋白对先天抗病毒免疫反应的总体作用。最近的研究表明，SARS-CoV的-2可以诱导多ISG的表达35，40，其在SARS-CoV感染几乎检测不到41 ; 我们推测SARS-CoV-2蛋白的免疫刺激作用可能有助于这种诱导。
在最近的调查结果一致42，43，我们发现，SARS-COV-2是IFN预处理敏感，这表明IFN治疗可能是COVID-19处理的选项。鉴定直接和特异性抑制SARS-CoV-2感染和复制的ISG是令人感兴趣的。总的来说，我们的研究表征了SARS-CoV-2与宿主先天免疫之间的相互作用，并为病毒蛋白介导的SARS-CoV-2的免疫逃逸提供了机理上的见解。这些发现可以促进我们对SARS-CoV-2发病机理的了解。
人293T（ATCC，＃CCL-11268;）细胞，293（ATCC，＃CRL-1573），Calu-3（ATCC，＃HTB-55;），HeLa（ATCC，＃CCL-2;）和Vero（在补充了10％热灭活胎牛血清（FBS）（HyClone，Logan，UT），100 U / ml青霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA）中培养ATCC＃CCL-81细胞和100 U / ml链霉素在37°C和5％CO 2湿润的气氛中。使用直接从ATCC购买的低传代HeLa和Vero细胞，并对所有细胞进行了无支原体测试。通过接种到Vero细胞上，从确诊的COVID-19患者的呼吸道样本中分离出SARS-CoV-2病毒1并在Vero细胞中繁殖并用于本研究。用SARS-CoV-2以0.5的感染复数（MOI）感染细胞。1小时后将未结合的病毒洗掉，然后用添加了2％FBS的新鲜培养基培养细胞。SARS-CoV-2病毒的所有实验均在BSL-3实验室中进行。
通过基因设计器1.0优化了SARS-CoV-2的23个基因（IPBCAMS-WH-01 / 2019菌株，编号EPI_ISL_402123），并将其克隆到在C-端带有FLAG标签或HA标签的载体pCMV6-entry表达载体总站。质粒Flag-RIG-I，Flag-RIG-IN，Flag-MDA5，HA-MAVS，pGL3-IFN-β-Luc，IRF3-5D-Flag和pRL-TK已在其他地方进行了描述42。通过使用定点诱变试剂盒（Stratagene，La Jolla，CA）构建SARS-CoV-2 ORF6标记的Flag的突变变体。通过随后的测序确认所有变体。
本研究中使用的抗体是：来自Sigma-Aldrich的Flag抗体（1：4000，目录号F3165）；来自Sigma–Aldrich的β-肌动蛋白抗体（1：4000，目录号A5441）；来自Sigma–Aldrich的HA抗体（1：10,000，目录号H9658）；来自Cell Signaling技术的STAT1抗体（1：1000，Cat＃9172）; 来自Thermo Fisher的P-STAT1抗体（1：1000，Cat＃700349）；Sev抗体，来自MBL（1：2000，PD029C1）。Dual-Luciferase®Reporter分析系统购自Progema（威斯康星州麦迪逊）。IRDye 800标记的IgG和IRDye 680标记的IgG二抗购自Li-Cor Biosciences（内布拉斯加州，林肯）。
将样品存储在-80°C并重复冻融3次，然后再进行测定。将96孔板中的Vero细胞在80％汇合的情况下培养过夜。使用稀释块，将样品在opti-MEM中从10 -1到10 -8连续稀释10倍。将100μl/孔的每种稀释液一式八份置于Vero细胞上，并在37°C和5％CO 2下孵育1小时。然后将培养上清液替换为1％BSA的opti-MEM，孵育4天。然后在显微镜下评估并记录细胞病变效应（CPE）。
用对照质粒或表达RIG-IN，MDA5，MAVS或IRF3-5D的对照质粒以及荧光素酶报道质粒或表达病毒蛋白的质粒转染24孔板中培养的293T细胞。收获细胞，并使用双重萤光素酶报告基因测定系统（Promega）将细胞裂解物用于测定萤光素酶。萤火虫萤光素酶活性被标准化为海肾萤光素酶活性44。
用PBS缓冲液洗涤细胞，并用4％福尔马林固定。然后用0.5％Triton X-100透化细胞。用PBS洗涤细胞后，将其封闭并用一抗染色，然后用Alexa Fluor 488二抗45染色。细胞核用DAPI（Sigma）染色。本研究中使用的抗体是：来自Cell Signaling技术的IRF3抗体（1：200，目录号11904）；来自Cell Signaling技术的STAT1抗体（1：400，Cat＃14994）; 来自Cell Signaling技术的P-STAT1抗体（1：400，Cat＃9167）; 来自细胞信号技术的Calnexin抗体（1:50，Cat＃2679）; 来自Sigma-Aldrich的GolgiB1抗体（1：500，目录号HPA011008）。使用激光扫描共聚焦显微镜（Leica TCS SP5）获得并分析了荧光图像。
通过使用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）提取总RNA，并通过M-MLV逆转录酶（Promega，Madison，WI）逆转录成cDNA。使用TB Green Premix Ex（宝酒，草津，滋贺县）制备用于实时PCR的cDNA。补充表1提供了SeV 的IFNB，ISG56，ISG54，P基因 的引物序列。对于SARS-CoV-2特异的引物序列可应要求从JW获得。
两尾学生t检验用于两组比较。* P <0.05，** P <0.01和*** P <0.001被认为是显着的。ns代表不重要。
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