血管内皮细胞（BEC）通过调节淋巴组织中的血流量和免疫细胞募集来控制免疫反应。然而，尚不清楚BEC的多样性及其在免疫血管生成过程中的起源。在这里，我们从周围淋巴结中分析BEC的转录组，并将表型映射到脉管系统。我们确定了多个子集，包括一个髓质静脉群，其基因特征可预测在髓样细胞（与淋巴细胞）募集到髓质中的选择性作用，并通过视频显微镜证实。我们定义了五个毛细管子集，包括显示干细胞和迁移基因签名的毛细管驻留前体（CRP），并有助于体内BEC稳态和免疫后高内皮细胞的新生。细胞排列显示了从CRP到成熟的静脉和动脉群体的发展计划的保留。我们的单细胞图谱提供了淋巴结血液脉管系统的分子路线图，并定义了白细胞募集和血管稳态的亚组专长。
血管内皮衬里血管调节血管腔室和组织之间的氧气和代谢产物的交换。另外，在淋巴结（LN）中，内皮在控制免疫细胞的通路中起着至关重要的作用。LN中脉管系统的组织具有良好的特征：在肺门处进入的动脉通向LN皮质的毛细血管。毛细血管链接到“高内皮小静脉”（HEV），即从血液中募集淋巴细胞的毛细血管后小静脉1；脉管系统从处的淋巴结流出。在免疫淋巴结可在体积增加10倍或更多天之内，并且血管内皮大致成比例从本地扩展前体1，2。血管扩张涉及毛细血管和高内皮细胞（HEC）3的广泛增殖，而没有血源祖细胞的参与4。并通过肠套叠（分裂）血管生成增加了血管数量5。但是，LN内的内皮细胞多样性的性质和程度仍未完全了解。
单细胞RNA谱分析是用于鉴定细胞多样性以及阐明发育和物理关系的一种转化技术。在这里，我们提供了来自小鼠外周淋巴结（PLN）的血管内皮细胞（BEC）的调查。我们确认高内皮的已知特征6，7，确定内皮细胞亚群，描述毛细血管细胞之间意想不到的多样性，并展示髓静脉在选择性骨髓细胞募集中的独特作用。我们定义这些子集的基因签名和转录调控因子，并将关键子集映射到脉管系统。我们还确定了一个引发的毛细血管居民再生人口（CRP），其显示出血管生成内皮标记物Apln，富含经历细胞分裂的细胞，并具有干细胞和迁移基因签名。遗传谱系追踪表明，CRP充当祖细胞，有助于血管内皮的新生，包括免疫血管生成中的高内皮。
我们对成年小鼠的PLN进行了分类的BEC的单细胞RNA测序（scRNAseq，10倍铬）（图 1a）。分析了四个队列，包括一组一起处理并通过计算机解析的雄性和雌性Balb / c小鼠（PLN1）（PLN1_m和PLN1_f），另一组雌性Balb / c小鼠（PLN2）和一只雌性Balb / c小鼠。混合背景（PLN3）（补充图 1a）。无监督分析（方法）定义了8个BEC子集，它们具有不同的基因表达。2个静脉EC亚群，高内皮细胞（HEC）和非HEC静脉（Vn）；和五个毛细管表型EC亚组，包括过渡表型毛细管EC（TrEC）和引发的EC，包括毛细管常驻再生种群（CRP）（图 1b–d）。动脉和静脉种群的注释是由已知的基因标记物被引导6，8，9。使用tSpace 10通过轨迹推断可以可视化最近的邻居比对，该比对可以模拟细胞的发育关系或空间比对，它揭示了连续的细胞表型以及分支的毛细血管内皮细胞和静脉亚群的分支（图 1e）。进一步扩展了延伸至动脉，CRP和HEV分支末端的簇，以区分与大部分EC最为不同（沿轨迹相距远）的细胞（暗阴影，图 1e）：这些细胞富含相关基因具有成熟的动脉（例如，Gkn3，Bmx）或HEV（Chst4，Glycam1）分化，或者在CRP的情况下，用于与早期发育过程中的内皮功能相关或与干细胞（例如Ets2，Cxcr4，Nes）相关的基因（图 1f）。雄性和雌性小鼠以及独立处理的样品共享簇和轨迹对齐方式（补充图 1b–d）。使用组合的scRNAseq数据集（方法；补充数据1）为每个子集生成基因表达签名 。补充图中显示了整个队列中已识别亚组的平均基因表达谱的相关性。 1e。图1f中描述的标记基因的表达 在所有生物学重复中显示出总体一致性（补充图 2）。
一个工作流程示意图。合并成年小鼠的淋巴结并解离成单个细胞。荧光激活细胞分选术（FACS）用于分离血液内皮细胞。scRNAseq（×10 Chromium）用于分析细胞。代表性的FACS图。b淋巴结示意图，描绘了通过scRNAseq分析鉴定的八个主要子集。c显示了每个子集的前50个差异表达基因和特异表达基因的表达热图。子集，样本和队列在顶部注释，右侧选择基因。d来自三个样本（四个队列）的8832个单细胞的UMAP图。按类型区分细胞：动脉EC（先发），高内皮细胞（HEC），非HEC静脉（Vn）和五个毛细管表型EC（CapEC1，CapEC2，毛细管驻留祖细胞（CRP），过渡性EC（TrEC） ），干扰素刺激的富含基因的CapEC（CapIfn）e。使用PLN1中的细胞在轨迹空间中对齐的细胞的PCA投影中以计算机预测的关系可视化，延伸到动脉，CRP和HEV分支末端的簇进一步细分为区分小区最截然不同从散装EC（CRP（早期），艺术，HEC（晚期的（沿轨迹远）;暗阴影）交互呈现可用的：https://stanford.io/2qzJ8Hl。˚F为每个指示的簇和簇的组合选择标记和特征基因（上图）。来自三个样本和四个队列（色标）的平均表达值。g每个子集中每个单元格的总转录本计数（UMI；唯一的分子标识符）。小提琴显示所有细胞的UMI分布。还绘制了四个独立群组（灰色点）中每一个的平均表达值以及该群组平均值的均值和标准误（SEM）（黑菱形，条形）。
通过表达Gja5和Gja4（分别编码连接蛋白37和40）和Bmx（图 1f）来识别BEC中的动脉簇。与先前的报道描述Gkn3是成熟动脉的标志物8一致，它在成熟Art中有选择地表达，而在Art Art中则不存在，后者更靠近轨迹空间中的毛细血管子集（图 1e）。相比之下，Depp1在先有技术中优先表达，这与先前的研究一致，该研究表明Depp1在发育中的动脉内皮细胞中瞬时表达，并随后在成熟血管11中下调（图 1f）。）。预艺术与艺术明示KLF2和KLF4，通过层流诱导的基因剪切流和优先与线性段相关联相比分支血管9，12。
包括HEC和非HEC（Vn）子集的静脉EC共享静脉特异性转录因子Nr2f2（Coup-TFII）13和静脉相关趋化因子拦截器Ackr1（DARC 14；图 1f）的表达。HEC表达淋巴细胞募集所需的基因，包括Chst4和Glycam1 15，在tSpace远端的HEC上表达更为明显（HEC晚期；图 1e，f）。与它们的大尺寸和饱满的形态以及先前对全基因组6的全基因组表达研究相一致，它们的基因标记丰富了糖蛋白的合成（补充数据 1），并且每个单元格的转录物数量都很高（图 1g）。
Vn亚群的细胞在tSpace投影中从近端HEC和TrEC显着分支（图 1e）。为了鉴定LN脉管系统中的这些细胞，我们对静脉注射荧光标记抗体后不久去除的整个LN进行了成像（方法）：抗Ly6c，特异于动脉和毛细血管；MECA79到定义HEV的周围节点血管寻址蛋白（PNAd）；以及抗PLVAP，可染色毛细血管和静脉EC，但不染色动脉（图 2a）。子集标记允许从LN hilus看到动脉进入，并链接到皮层中的毛细血管，而毛细血管又连接到HEC。我们确定PNAD -静脉和作为HEV的淋巴结中的髓质（图的延续下游。 2a中）：他们将注射的抗体与VE-钙黏着蛋白，PLVAP和ICAM1结合（图 2b），但对毛细血管标记Ly6c和podocalyxin（PODXL;补充图4）阴性 ，如基因表达所预测（图 2c）。
使用静脉注射（iv）注射的抗体对PLN血管进行免疫荧光可视化：抗Ly6c（绿色），抗PLVAP（红色）和抗PNAd（蓝色）。虚线，淋巴结包膜（一）；抗VE-钙黏着蛋白（绿色），抗ICAM-1（白色），抗PLVAP（红色）和抗PNAd（蓝色）（b）。箭头，动脉（的Ly6C +全国住户抽样调查-，PLVAP -，ICAM1 低）。箭头，髓静脉（PNAD -，ICAM1 +，PLVAP +，的Ly6C - ）。延髓静脉位于HEC的下游。星号，HEV（PNAd +）。条，100μm。虚线，髓静脉。代表三个独立实验的图像。c小提琴图显示了对应于免疫染色标记蛋白的基因Ly6c1，Plvap，Podxl和Icam1的表达；和塞莱，SELP和VCAM1示出了由非HEV静脉选择性表达。请注意，在下降PODXL从动脉预艺术毛细EC子集的表达，并且在染色Ly6c1的强度的相应下降，因为动脉分叉成毛细管原位一个。在小提琴图中，还绘制了四个独立群组（灰色点）中的每个的平均表达值以及该群组平均值的平均值和SEM（黑色菱形）。
Vn基因标记包括与中性粒细胞活化的调节（GO：1902563；图3a）和血小板脱粒（GO：0002576；补充图 3）相关的基因 。Vn表示Von Willebrand因子（Vwf），该因子存储在Weibel-Palade体内，在炎症过程中释放以促进血小板粘附和止血16。出乎意料的是，Vn缺乏用于幼稚淋巴细胞募集的HEC相关基因（Chst4，Fut7，Ccl21），而是表达血管E-和P-选择蛋白（Sele和Selp）以及粘附受体ICAM1和VCAM1的基因（图 2c）。），介导骨髓细胞的募集。中性粒细胞和单核细胞通常被排除在LN归巢之外，但它们会因急性炎症而大量进入LN，并在防止病原体扩散中起重要作用。此前的研究中，其特征在于炎性HEC的变化，这与淋巴细胞一起使髓样细胞的募集17，18，19 ; 但髓质Vn的作用尚未检查。我们由细菌病原体的足垫注射引起的炎症金黄色葡萄球菌 与绿色荧光蛋白（GFP）表达嗜中性粒细胞的小鼠（LysM结构GFP老鼠）。一小时后，将CMTPX标记的淋巴细胞输注小鼠，并通过live神经LN的实时两光子成像对募集进行定量。PNAD -髓样小静脉表现出GFP的大规模和独家招募+髓样细胞，既淋巴细胞和髓样诱导细胞相互作用在HEV（图对比 3B-E ）。与依赖PNAd的HEV招募相反18，即使在存在抗PNAd阻断浓度的情况下，骨髓招募也很稳定。抗P-选择素可显着抑制GFP +在Vn上的蓄积，而对血管E-选择素和P-选择素的联合抑制作用则大大消除了髓样细胞的髓静脉相互作用（图 3f）。），而HEV招募不受影响18。因此，延髓环境中的小静脉具有独特的表型和功能，在急性炎症中选择性地将髓样细胞募集到延髓。结果说明了用于差异性白细胞募集的令人惊讶的局部BEC程序。
HEV与金黄色葡萄球菌感染的LysM GFP小鼠的延髓静脉相比，HEV中的原位淋巴细胞和骨髓细胞募集。沿图1e的tSpace投影绘制的指定GO项（色标）中基因的合并表达值 。b 金黄色葡萄球菌注射实验方案以及LN中淋巴细胞和髓样细胞运输的可视化。LysM GFP受体的足垫接受了2.5×10 7 金黄色葡萄球菌。一小时后，给小鼠静脉内注射CMTPX标记的淋巴细胞（红色）。感染后2-4小时，使用双光子视频显微镜对引流的LN成像。C 示意图显示了HEV和髓静脉的位置。d来自根据（b）处理的小鼠的LN的2光子视频显微镜的代表性视野。髓样细胞（绿色）和淋巴细胞（红色；箭头）停滞在HEV（上图）或髓静脉（下图）中。HEV中，在非阻断浓度牺牲前立即由红色荧光抗PNAD的注射识别，容易从迁移淋巴细胞和从PNAD区分-髓静脉。Dylight-680标记的白蛋白（青色）突出了静脉腔。酒吧，20微米。e量化附着在HEV和髓静脉上的淋巴细胞和髓样细胞。ñ =总共四只小鼠的HEV的34个视野（FOV）和静脉的8个FOV。数据显示为平均值±SEM。使用经Tukey校正的双向ANOVA测试确定统计学上的显着差异。f通过抗体阻断P-和E-选择素抑制髓样细胞中髓样细胞的积聚。在LysM GFP小鼠的足垫金黄色葡萄球菌感染之前，静脉注射受试或同种型对照抗体20分钟，感染后2 h观察引流的LN。在成像的2小时内，从pop神经LN的24–47 FOV定量测定髓样细胞（GFP +）对髓样静脉的粘附。每个点代表从一只小鼠收集的值的平均值。n = 5只同型小鼠，n 对于所有其他组，= 3只小鼠。数据显示为平均值±SEM。一尾t检验用于与同种型的比较。使用两尾t检验比较抗P-选择蛋白和抗E + P-选择蛋白。
五个毛细血管种群共享Cdh13，Emcn，Gja1和Gpihbp1的表达，先前描述为PLN 6中毛细血管EC的基因标记（图 1f）。过渡表型亚群（TrEC）表达典型的毛细管基因以及一些HEC基因，尽管与真正的HEC相比水平较低（图 4a，b）。TrEC将其他CapEC桥接至tSpace投影中的静脉分支（图 1e），进一步表明与HEC密切相关。他们表达Chst2和HEC基因St3Gal6和Fut7，其编码用于合成唾液酸化的LewisX（SLex）和6磺基SLex的糖基转移酶，可以在剪切流15下引发淋巴细胞束缚的碳水化合物。定义HEV的淋巴细胞归巢的成熟多价L-选择素配体PNAd的合成也涉及Chst4，并需要由Gcnt1编码的核心2分支酶。在TrEC中几乎检测不到Chst4和Gcnt1，这表明TrEC和HEC可能显示不同的糖基。因此，我们使用了针对SLex和PNAd的抗体来原位鉴定TrEC。影像学检查发现大量的BEC被SLex和毛细管抗原共同染色（图 4c，补充图 5）。），但缺少成熟的PNAd。它们的形态很薄，发现在HEV的上游，与其在轨迹空间中的位置相关（图 1e）。
一张细胞散点图，显示了毛细血管EC的Fut7表达，毛细血管特异性基因的富集得分定义了Fut7表达。按主要细胞类型上色的细胞。b静脉注射抗SLex（红色），抗PNAd（蓝色）和抗毛细管（EMCN；绿色）抗体的PLN的免疫荧光图像。比例尺100 µm。箭头指向Slex + EMCN + PNAd - TrEC。代表三个独立实验的图像。Ç的表达Chst2，FUT7，Gcnt1，ST3GAL6，B4GALT6在BEC子集中。小提琴显示所有细胞的表达分布。还绘制了四个独立群组（灰色点）的平均值表达值以及群组平均值的均值和SEM（黑菱形）。
CapEC1和CapEC2是两个最丰富的毛细血管群（图 1c），位于轨迹空间中的EC中部，作为枢纽，从中出现分化的静脉和动脉分支（图 1e）。CapEC1基因标记丰富了IV型胶原三聚体（GO：0005587; Col4a1，Col4a2）以及参与维持血管张力和血压的Igfbp3 20。它们具有高的血管内皮生长因子受体活性（GO：0005021），还表达了血管生成的负调控因子（Hlx和Igfbp3），并增强了基因Id1和Id3的表达。编码分化蛋白，的bHLH转录调节其抑制细胞分化和延迟细胞衰老的抑制剂21，22（图 1F）。
CapEC2表达Egr1，Cxcl1和反映NFkB激活（Nfkbia，Nfkbid，Nfkbiz）和JNK激活（Jun，Junb，Jund，Fos，Fosb，Atf3）的基因。这些基因和途径是通过在流体剪切应力的空间梯度诱导的23，24，25。与CapEC1相比，CapEC2还显示Gja4和Id1减少，并且MAPK级联（GO：0000165）和WNT信号（GO：0060070;补充图3）中的基因富集 ），从基于ChIP-seq的分析中发现的平行特征，这些分析是由不平稳的振荡剪切应力响应26引起的。这些CapEC2功能建议暴露于梯度或扰动的剪切应力下。
第三个相对罕见的人群CapIfn具有干扰素信号的显着特征（GO：0060337），其中转录因子Irf7，干扰素应答基因Ifit1，Ifit2和趋化因子CXCL9和10的表达较高（图 1f）。CapIfn还表达Isg15和Gadd45a，这些基因与其他单细胞研究中描述的“细胞凋亡样”签名相关27。
无监督的聚类确定了活化的毛细血管内皮细胞（CRP）的独特种群，它们在轨迹空间中占据了自己的分支，并与CapEC1、2和TrEC连接（图 1e）。他们的基因表达特征揭示了祖细胞样的表型。它们具有独特的Ets2和Sox7高表达，编码在发育过程中涉及内皮细胞早期规格的转录因子，并且在其他系统中显示干细胞或祖细胞的基因和特征28。这些发育EC基因在其沿tSpace分支的细胞位置所定义的早期和晚期CRP中另外富集。CRP还表达与神经和造血干细胞或祖细胞相关的基因，包括Cxcr4 29，Nes 30，试剂盒31，Lxn 32和Sox4 33 ; 并且它们富含剪接体基因（GO：0097525），包括Snrpa1和Snrpd1（图 5a），这些基因参与了胚胎干细胞中多能性的获得和维持34。像胚胎和神经干细胞一样，CRP独特地缺乏Neat1的表达，Neat1是在分化细胞中广泛表达的长非编码基因，用于干细胞命运选择期间的散斑组装和双链RNA处理35（图 5a））。多能干细胞和祖细胞比其分化后代具有更多的基因和蛋白质信号传导，反映了它们的发育可塑性。这些特性可以通过使用SCENT算法36计算“信号熵率”来量化。早期的CRP表现出比其他EC子集更高的熵，而Art和晚期的HEC子集表现出最低的熵（图 5b）。在CapEC1之间划分细胞共享一些这样的效能相关性，包括高熵。然而，具有最高熵的细胞趋向于映射到轨迹空间中CRP分支的“起源”（图 5c）。最后，CRP表达Angpt2，Apln，Esm1，Nid2，PDGFB，和PGF（图 1F），血管生成基因尖端细胞的特征，前体新血管萌芽血管生成过程中形成的37，38。这些观察结果共同表明，CRP包含激活的或灌注的毛细血管群，具有促进血管维持和血管生长的潜力。与此相一致，CRP富含具有细胞分裂基因的细胞（图 5d）。尽管仅约10％的CRP具有分裂的细胞特征，但在静止的LN中，具有细胞分裂的基因特征的所有细胞中约60％与CRP一致，其余大部分分布于CapEC1和TrEC（图 5e）。有趣的是，随着Apln的增加从早期CRP到晚期CRP以及到TrEC的过渡过程中，其表达下降，而ApEC表达却缺乏（见下文）。
一个的选择的干细胞或祖细胞相关基因表达的影响。b每个BEC子集的信令熵率（熵）。虚线框表示所有BEC中最高的1％。高熵细胞富含早期CRP。c补充图1d中所有单元的tSpace投影 。CRP，绿色。高熵细胞（（b）中门控的前1％）是黑色的。其他细胞，灰色。可用的交互式渲染：https : //stanford.io/2WXR811 d每个BEC子集的百分比根据细胞周期基因的汇集表达被划分为划分。点代表单个样本的值。钻石，所有样本的平均值。误差线，平均值的标准误差。n = 3个生物学独立的样本。Ë分裂细胞的表型表示为具有所示BEC表型的分裂细胞的百分比。误差线，平均值的标准误差。n = 3个生物学独立的样本。f（g）和（h）的实验时间表。g通过静息（第0天）PLN和皮肤发炎后5天PLN中的免疫荧光组织学定量ER +内皮。表示为ER +毛细血管（PODXL +或MCAM + PNAd - EC）或ER +HEV（PNAd +），表示为扫描的毛细管EC或HEC单位（长度的任意单位）的百分比。没有ER +在静止状态扫描的5000多个扫描的PLN和5000多个炎症的PLN中检测出HEC。95％CL显示为误差线或指示。对于每组，列举了来自两只小鼠的九个淋巴结。每个数据均来自给定的LN。使用Kruskal-Wallis检验和Dunn的多重比较检验确定了统计学上的显着差异。95％置信限显示为误差线或在HEC上方指示。h来自Apln CreER小鼠的静止PLN的代表性图像，分别用抗PNAd（黄色），抗PODXL（红色），抗ER（绿色）和静脉注射的抗MCAM（蓝色）染色。箭头指向ER + CRP。条形，50μm。代表三个独立实验的图像。i来自Apln的静止PLN（4-OHT后72小时）的图像CreER，mTmG小鼠被注射的抗CXCR4（蓝色），抗CD276（白色）和抗EMCN（红色）染色。箭头指向毛细血管中的GFP +细胞。棒，20 µm。代表三个独立实验的图像。
由于CRP选择性表达Apln（图 5a），因此我们通过对人类雌激素受体（ER）染色来将CRP定位在Apln CreER小鼠的LN脉管系统内（图 5f），这是这些小鼠中Apln表达的替代物39。ER + EC很容易观察到毛细管中的薄壁内皮细胞。HEC未被抗ER染色，重要的是，免疫激发后可通过免疫荧光组织学检测到的ER表达仍然局限于毛细管EC（图 5g，补充图 6）。ER +通过静脉内注射针对表面抗原的抗体快速标记CapEC，这与腔内接触和整合到毛细血管内皮中一致（图 5h）。CD276 40和Cxcr4 38是EC中血管生成潜能的已知标志物，也可以通过CRP选择性表达（图 5a）。静脉注射的抗CD276和CXCR4抗体标记了仅限于毛细血管的一部分EC。在Apln CreER x Rosa26 mTmG（Apln CreER; mTmG）小鼠中，三天前用4-羟基他莫昔芬（4-OHT）脉冲，以诱导AplnER +细胞，GFP +CapEC对注射的抗CD276和CXCR4显示异质染色（图 5i）。
为了评估其命运，我们在注射短效他莫昔芬代谢物4-羟基他莫昔芬（4-OHT;血清半衰期6 h 41）后24小时用完全弗氏佐剂（CFA）免疫了Apln CreER×R26 mTmG小鼠。三个半星期后，许多HEC和毛细管EC呈阳性，证实了表达AplnERTCre的前体的EC新生（图 6）。在重复实验中获得了相似的结果，在该实验中，一只小鼠的免疫前3天施用4-OHT（补充图 7）：GFP的表达即使在3周后仍集中在对照LN的分散CapEC中，而大量GFP +后代在免疫结节中纳入HEV。最后，与即使在免疫后CapEC中Apln启动子驱动的ERTCre的检测仍然受到限制相一致（图5f，g），我们发现即使在免疫后24小时施用4-OHT，在毛细血管EC中选择性诱导了报告基因 ：12天后在HEV中观察到报告基因+后代的数目（补充图 8）。结合其参与胚胎血管发育的基因的表达及其在经历基底细胞分裂的细胞中的富集，结果表明CRP是蓄势的再生子集或祖细胞，有助于稳定状态下的血管维持和EC的新生，包括HEC。 LN血管生成。
一个实验方案。b在静止（上）和用CFA免疫三周半后，来自Apln-CreER x R26-mTmG小鼠的PLN 中Apln驱动的报道基因表达（GFP）的代表性图像（下图）。在处死前10–20分钟，通过静脉注射指示的抗体标记EC亚群：PNAd（蓝色），MCAM（品红色）。箭头，毛细管。箭头，HEV。条形，50 µm。
我们最近在成年骨髓中鉴定了一个表达Apln的干phy端EC亚型，它有助于造血干细胞的生态位42：Apln CreER ×Rosa26 mTmG小鼠的命运定位表明，Apln + EC有助于内皮稳态和骨髓血管新生，如此处显示的LN CRP。因此，我们试图确定CRP状EC在BM和其它组织，同时从塔布拉缪里斯（TM）的联盟的BEC型材scRNAseq优点43和基因表达总括（GEO）44，45。我们对参考PLN1样本的细胞进行了约38,000 BEC的全局比对，包括我们的PLN2的样本和三个样本（补充图 9a）。我们将候选CRP样细胞定义为基因表达谱（1）与CRP的平均基因谱比与其他CapEC或分化亚群相关性更高的细胞；（2）在UMAP投影中与PLN CRP对齐。在大多数组织中，一小部分（0.3–13％）BEC符合这些标准（补充图 9b）：大多数表达的Apln以及其他CRP基因，包括Cd276，Cxcr4，Lxn，Mcam和Trp53i11（补充图）。 。 9C; 补充数据 2）。CRP样EC表达许多与血管生成的端细胞相关的基因，与LN CRP一样，与各自组织中分化的BEC相比，熵高（补充图 9c，d）。除了与LN毛细管CRP对齐外，大多数CRP样细胞还表达与毛细血管相关的基因标记，包括Gphibp1，Ly6c1和Cdh13，并且缺乏静脉和动脉基因。但是，BM CRP样细胞的Ly6c1比其他部位的细胞低。肝脏中极为罕见或缺乏CRP样EC。在肺中，Apln和Ptp4a3在毛细血管细胞（也称为I型肺泡毛细血管）中高表达46和Car4高EC 47）。这些细胞位于肺泡间隙，是肺血管系统所独有的，否则与CRP无关。结果表明，CRP很少见，但分布广泛的毛细管表型EC，可能参与稳态BEC转换，并充当诱导血管生成的蓄势祖细胞。
接下来，我们研究了沿着细胞轨迹的基因和细胞特征的变化。我们从早期CRP到动脉或HEC，或从CapEC到通向Vn的静脉分支的路径中分离细胞（图 7a），并通过细胞沿轨迹显示基因或基因模块的表达（图 7b-e，补充图 10）。该热图说明了从早期CRP到CapEC和TrEC的路径之间或沿其方向具有高细胞周期分数的细胞富集，对应于晚期CRP或向TrEC的过渡达到峰值（图 7b，补充图 10a）。相反，从早期到晚期CRP和TrEC的过渡过程中，Apln迅速下降，与此相符的CRP降低了Apln表达与早期CRP相比（图 7b，补充图 10a）。CapEC在Art轨迹上表达与发育性动脉生成有关的基因48。这些包括Sox17，Nrp1，Gata2，Klf2，以及骨形态发生蛋白（BMP），Notch和Ephrin信号转导成分和下游靶标（Acvrl1，Tmem100，Msx1，Notch4和Notch1，Jag1，Jag2，Hey1，Efnb2）的基因。成熟的动脉表型（图。 7e）。反映层流切应力的特征（Klf2，Klf4，GO：0034616；图 7e）沿着到达Art的轨迹增加，而毛细管EC中的振荡或梯度切应力特征峰达到峰值，尤其是轨迹的CapEC2富集区域导致动脉。 EC（Cxcl1，Egr1，OSS；图 7b，d，e）。参与气体和代谢物交换的基因（Aqp1 49，Car2和Car4）在CapEC中较高，并在发展为Art的过程中丢失。出乎意料的是，动脉EC表达弹性蛋白纤维装配的关键基因（Fbln5，Eln，Ltbp4和Lox），提示动脉EC可能直接参与EC和平滑肌细胞之间的内部弹性层的组装（图 7d）。从CRP到Art的轨迹还显示了参与发育中的动脉EC祖细胞迁移的基因，如下所述。
一个沿基于KNN-轨迹将细胞分离（方法）。b – e从成熟的CRP到Art（沿左图），从CRP到HEC或Vn（向右）沿细胞轨迹选择基因的表达和基因集富集得分。沿着轨迹的单元格在轨迹空间的前五个主要组成部分中手动进行门控，并根据距早期CRP的距离进行对齐。沿轨迹的细胞类型表示在顶部。使用高斯核对作为轨迹距离函数绘制的归一化计数数据进行平滑处理。轨迹距离按比例缩放到最长轨迹（从CRP到HEC）。根据生物学类别或功能将基因分组。独立计算所有细胞（无重复）的估算基因表达值，并将其用于每个基因组内的层次聚类。Cxcr4，Cxcl12和Ackr3在c的顶部显示为单独的组（请参见结果）。最小和最大子集的平均归一化表达式值显示在每个热图的右侧。OSS：振荡剪切应力基因的集合表达：Egr1，Nfkbia，Junb，Cxcl1。细胞分裂：细胞周期基因的汇集表达74。
相反，沿着从CRP到Vn或HEC的轨迹的细胞表达静脉命运和表型的决定因素。Nr2f2编码CoupTF2，CoupTF2是发育中的静脉分化所需的TF：Nr2f2首先在TrEC中表达，并沿静脉轨迹保持。Notch在静脉分化过程中受到抑制13，并且Notch信号成分沿静脉轨迹提前下调（图 7d）。淋巴毒素受体LTBR是HEV发展和维持所必需的。Lbtr广泛表达，但淋巴毒素beta（Ltb），是HEV特异性淋巴毒素二聚体的组成部分，出现在静脉轴的HEC晚期，提示自分泌信号可能维持HEC表型（图 7b）。除了将已知的介质和动脉和静脉规格的机制映射到细胞轨迹外，该分析还鉴定了可能有助于大血管（例如Ebf1，Klf9），动脉（例如Tsc22d1），HEC（例如， ，XBP1，MEOX1），HEC和静脉（Aebp1）或静脉（Lhx6，Csrnp1，GATA6）（图 7D）。例如，Gata6增强了肿瘤坏死因子-α诱导的EC培养物50中 VCAM1的表达，TrEC和Vn的表达可能因此有助于Vcam1的选择性Vn表达。
G蛋白连锁受体（GPCR）充当环境传感器。GPCR通过其配体来调节血管发育，内皮功能和迁移。我们检查了沿对齐轨迹的GPCR表达。血管扩张流量传感器基因Gpr68 51首先出现在先有技术的毛细管EC中，并保留在Art中（图 7b）。Cysltr1编码髓样细胞衍生的白三烯52的传感器，在向Vn的过渡过程中被上调（图 7b）。编码凝血酶基因和促红细胞生成素受体（F2R和EPOR），传感器，其驱动血管生成和血管53，54通过CRP选择性地表达α-β，表明对局部血栓形成或炎性蛋白酶活性和氧缺乏敏感（图 7b）。Cxcl12（在CapEC和Pre-Art中）及其趋化受体Cxcr4（由CRP以及CapEC1和2的子集沿Art的轨迹表达）的基因表达模式提示，保留了沿端细胞迁移的发育程序毛细血管进入显影动脉（图 7C），视网膜动脉中所观察到的55。Ackr3尾随细胞中的表达需要在斑马鱼发育的生殖细胞的CXCR4 / CXCL12依赖性迁移56。Ackr3由CRP和一些CapEC在动脉分支中表达，提示其平行作用。这些观察结果表明，CRP可能适合迁移。与此相一致，CRP富含细胞运动，细胞外基质重塑，肌动蛋白组装和拆卸以及lamellipodium形成的基因（图 7e）；但是它们还表达已知的迁移和发芽行为抑制剂的基因，包括Arhgap18 57和Csnk2b 58（补充数据 1）。
血管内皮在淋巴组织的发育和功能中起着核心作用。我们对LN血管内皮细胞的调查定义了EC表型的多样性，并确定了先前未描述的细胞亚群和功能。我们发现具有不同基因表达的毛细血管内皮细胞的多个子集，包括TrEC，在基因表达中以及在其他CapEC和HEC之间的物理位置之间的过渡表型子集。我们显示该子集表达糖基15用于流下的淋巴细胞束缚。紧靠HEC上游的毛细管EC呈现的束缚糖基可能使淋巴细胞在进入HEV之前启动与内皮的相互作用。我们确定了髓静脉EC的独特配置文件，并显示它们响应急性细菌攻击，向LN髓质明确募集了髓样细胞，而不是淋巴细胞。中性粒细胞阻止病原体扩散超出初始组织引流LN 18，并且募集进入延髓的嗜中性粒细胞可能在拦截细菌进入传出的淋巴管之前处于良好的位置。最后，我们确定了一个有免疫力的毛细血管常驻种群，CRP，其显示与多能祖细胞相关的特征，并参与基础内皮的增殖和免疫反应中的血管新生。
新的内皮在生理性血管新生中被认为主要来自局部EC 59，而循环的内皮祖细胞在免疫的LN 4中对新的内皮没有贡献。之前的研究已经在大血管强调多能容器驻留EC祖细胞群60，61和肺62和前体在显影骨63可以分化成不同的EC表型。CRP似乎与这些人群不同：它们缺乏Bst1和Procr，这是在肝脏60和脂肪61的大血管中描述的内皮祖细胞的标记。他们表达Kit，是肺部克隆性EC祖细胞的标志物64 ; 但已发表的肺血管内皮细胞单细胞数据集仅包含极为罕见的具有CRP样基因图谱的EC。CRP也不同于血管生成尖端细胞，因为CRP与内腔直接接触并与血管内壁成一体，而尖端细胞缺乏管腔接触，而是导致侵入性芽的盲端 65。但是，CRP与尖端细胞共享基因表达和前体潜能，因此可以引发尖端细胞行为或肠套叠（分裂）血管生成。CRP似乎与我们在成年骨髓中观察到的表达Apln的EC密切相关，其命运映射表明有助于辐射诱导的EC新生，包括骨髓腔中的动脉EC 42。。此外，我们在许多组织中鉴定出罕见的CRP样毛细管表型EC。因此，CRP可能广泛地促进血管动态平衡，为局部血管的维持和补充提供了一个分布式的再生细胞池。与这一观点一致的是，最近的scRNAseq研究也注意到正常组织中罕见的Apln + “血管生成” EC 66。
有趣的是，在PLN和大多数组织中，Apln表达谱对CRP或CRP样EC表现出相当高的选择性。在基因水平上，其在“早期” CRP中的表达最高，这在此处描述的BEC中也显示出最高的熵。从早期到晚期CRP和CapEC，Apln在细胞中的轨迹逐渐下降。并且通过Apln启动子驱动的Cre-ERT2表达评估其向蛋白质的翻译，即使在许多HEV和其他BEC正在活跃增殖的免疫淋巴结中，也仍然局限于毛细管。因此，Apelin不是EC激活或增殖的一般标记。这些注意事项强调了在新生血管生成模型中早期CRP与尖端细胞之间的相似性：诸如早期CRP的尖端细胞的Apln高，主要是细胞迁移的非分裂和显示特征；而细胞分裂主要发生在尾部的“茎”细胞中67。
CRP的迁移特征表明它们可能具有在毛细血管内爬行以促进新血管形成的能力。我们显示，CRP表达运动的基因，包括Cxcr4趋化性程序，具有驱动前体向前动脉表达的Cxcl12进行动脉生成的潜力，如在视网膜发育中观察到尖端细胞后代68。我们还表明的CRP表达Ackr3编码CXCL12拦截Ackr3（CXCR7）：CXCR7内化CXCL12，和在发育中的细胞系统可以通过在一个人口迁移的“后”减少趋化水平提高CXCR4驱动定向迁移69。
CRP显示血管生成信号的感觉受体，包括凝血酶，促红细胞生成素和VEGF，因此表现出良好的程序设计，可以响应内皮增殖的要求。与此相符的是，我们表明具有基础细胞分裂特征的所有BEC中有近一半与CRP一致，如前所述，主要为晚期CRP。CRP可能代表了激活的毛细管EC的暂时状态，这可以通过分裂细胞的富集以及与顶端细胞基因表达的相似性来表明。或者，它们可以代表常驻祖细胞库，类似于其他环境（即肠上皮和造血系统）中的再生干细胞或祖细胞。它们体现了高熵，并表达了多能祖细胞和干细胞的特征基因。需要串行细胞转移或克隆培养来评估其克隆祖细胞的潜力和自我更新的能力。我们的数据并未解决此处定义的其他EC子集对新血管形成的贡献的前体潜能。在我们的样本中，CapEC1，TrEC和早期HEC显示的信号熵高于最分化的动脉和静脉EC，这表明它们也可能保留发育可塑性。实际上，据报道，当注射入受体小鼠LN中时，HEC有助于HEC和毛细血管细胞的新合成 和早期HEC在我们的样本中显示出比最分化的动脉和静脉EC高的信号熵，表明它们也可能保留发育可塑性。实际上，据报道，当注射入受体小鼠LN中时，HEC有助于HEC和毛细血管细胞的新合成 和早期HEC在我们的样本中显示出比最分化的动脉和静脉EC高的信号熵，表明它们也可能保留发育可塑性。实际上，据报道，当注射入受体小鼠LN中时，HEC有助于HEC和毛细血管细胞的新合成4。在肠上皮中，最近分化的细胞甚至可以响应损伤或干细胞耗竭而重新获得多能性并更新干细胞库 70：BEC的某些子集也可以做到这一点。不同的BEC子集对特定EC的新合成的相对贡献可能取决于它们所处的组织以及所经历的挑战。
我们还观察到主要的CapEC池之间的差异，定义了两个相关的集群CapEC1和CapEC2。两者共享规范的CapEC基因以及气体和代谢物运输的基因，这些基因在动脉前和终末动脉亚群中被下调。CapEC1具有高表达的DNA结合蛋白（Id1，Id3）抑制剂，这些蛋白可作为细胞分化的抑制剂。CapEC2表达由振荡或梯度剪切应力诱导的基因（例如Egr1，Cxcl1）和途径（NFkB，JNK，WNT，MAPK级联），其可能发生在血管分叉处。有趣的是，这些基因沿着从CapEC2到动脉EC的轨迹下降，而层流相关基因Klf2和Klf4递增。因此，现有技术可以对应于小动脉并且潜在地对应于LN中衬在动静脉通信中的细胞。
髓静脉选择性募集骨髓细胞的能力，以及血管选择素在该过程中的选择性表达和作用，显着地揭示了局部血管的专一性。先前的研究表明，炎性刺激可诱导从头开始单核细胞和中性粒细胞募集至LN，但集中于HEV和HEV L-选择素配体PNAd的作用，后者优先将细胞募集至深皮层（T细胞区）。例如，我们最近显示，嗜中性粒细胞通过HEV进入金黄色葡萄球菌，在PNAd依赖性，血管选择素非依赖性过程中挑战LN 18。相反，我们在这里发现髓静脉缺乏幼稚淋巴细胞归巢的机制，而是使用血管选择素选择性地募集了髓样细胞。淋巴结的髓质包含捕获病原体的淋巴内皮细胞网络，我们最近在单细胞水平上对其进行了表征71：在急性细菌攻击中，嗜中性粒细胞募集到髓质可能有助于髓样细胞在减少病原体转移入肾中的重要作用传出的淋巴管和感染的全身扩散。
我们的结果表明，由基因签名定义的主要EC子集映射到稳态脉管系统中的特定位置。确实，沿最近的相邻轨迹排列的细胞重新概括了EC在血管系统中的总体结构安排。成像证实了TrEC在CapEC和HEV之间的计算预测位置；毛细管段内的CRP 和戊型肝炎的PNAd负静脉分支。轨迹分析还显示，毛细管EC沿着轨迹与成熟的动脉EC对齐，表达在发育中支持动脉生成的转录程序。类似地，沿静脉分支保留了编程静脉发育规范的基因。动脉和静脉指定程序的这种“保留”可能反映了来自CRP或其他前体的这些专门子集的连续稳态补充和发育程序。或者，保留发育基因可用于预编程节段性EC分化，以在免疫血管生成过程中快速扩张血管。
如此处所示，单细胞分析具有识别EC子集的潜力。阐明对其专业进行编程的发育过程，转录和调控途径；并将转录表型映射到脉管系统，提供了血管内皮的分子蓝图。针对此处定义的特定亚组和过程，有望通过操纵血管生成和免疫反应来治疗各种血管，免疫和炎性疾病。
Apln CreER（apelin;靶向突变1.1）39，BALB / cJ（杰克逊实验室），B6.Cg-Gt（ROSA）26Sortm9（CAG-tdTomato）Hze / J（杰克逊实验室）和B6.129（Cg） -Gt（ROSA）26Sortm4（ACTB-tdTomato，-EGFP）Luo / J（Jackson Laboratory）小鼠在退伍军人事务帕洛阿尔托卫生保健系统的动物设施中繁殖和饲养，并获得实验室评估与鉴定协会的认可动物护理。实验方案已获得斯坦福大学动物保护与使用委员会的批准。实验中使用了8-20周龄的雄性和雌性小鼠。LysM GFP 卡尔加里大学动物资源中心将小鼠（溶菌酶2；靶向突变1.1； Thomas Graf博士提供）维持在无特定病原体的环境中。
腋生，从20-30成年小鼠腹股沟和肱PLN：BALB / cJ的（PLN1和PLN2）或混合的背景（PLN3）的小鼠如所描述的离解6。为了最大程度地减少技术差异，在一项研究（PLN1）中，将雄性和雌性PLN进行组合，然后再处理组织，并使用Seurat软件包（v3.1.1）中的AddModuleScore函数分离后测序，以计算雄性特异性基因（y染色体基因）的富集）和女性特定基因Xist。基本上按照描述的方法（在线版本）分离内皮细胞6。简而言之，将PLN合并在HBSS缓冲液中，并用剪刀切碎。将切碎的组织用HBSS清洗2-3次，重悬于含有0.2 mg / ml胶原酶P，0.8 mg / ml Dispase II，0.01 mg / ml DNase的HBSS培养基中，并在37°C下孵育10分钟。然后，通过依次用较小口径的P1000移液器吸头上下吸液几次，轻轻地破坏组织。使组织沉降到试管底部，将消化释放的细胞转移到冰冷的FBS中（终浓度为30％）。将新鲜的消化缓冲液添加到剩余的组织片段中，以进行另一轮消化。过滤消化的细胞，并使用抗CD45 MicroBeads（Miltenyi）从细胞悬液中去除血淋巴样细胞。大约5–10×10 4 BEC（lin-使用FACS Aria（100 µm喷嘴；〜2500细胞/秒）将Gp38 - CD31 +）分为100％胎牛血清。将新鲜分选的细胞悬液用PBS稀释至最终FBS浓度约10％，并以400× g离心 5分钟。用微量移液器小心除去上清液，并将细胞沉淀重悬于剩余体积（〜30–50 µl）中。使用血细胞计数器对细胞进行计数，必要时通过加入含10％FBS的PBS将细胞浓度调节至500–1000个细胞µl。
根据10X Genomics指南，使用Chromium Single Cell 3'Library和Gel Bead Kit v2（10X Genomics，PN-120237）处理细胞悬液以进行单细胞RNA测序。使用Illumnia NextSeq 500使用150个循环的高输出V2试剂盒（读1-26，读2-98和索引1-8碱基）对文库进行测序。Cell Ranger软件包（v3.0.2）用于将高质量读段与mm10转录组对齐（提供质量控制报告：https ://stanford.io/37sXZV3 ）。使用scran软件包72计算归一化的对数表达值。使用MAGIC（基于Markov Affinity-based Graph Imputation of Cells）算法的自定义实现（https://github.com/kbrulois/magicBatch）计算推定的表达式值73 和优化的参数（t = 2，k = 9，ka = 3）。
使用FindVariableGenes函数（Seurat，v2.1）27可以识别高度可变的基因。对于旨在识别簇，非可变基因，细胞周期基因的分析74，排除了在少于三个细胞中检测到的基因和平均表达水平低于0.3（归一化和对数转换的计数）的基因。监督细胞选择用于去除具有非血管内皮细胞基因特征的细胞：淋巴管内皮细胞（Prox1，Lyve1，Pdpn）；周生虫（Itga7，Pdgfrb）; 纤维母细胞网状细胞（Pdpn，Ccl19，Pdgfra）; 淋巴细胞（Ptprc，Cd52）。在来自PLN1样本的一组核心细胞（2394）上使用了主要的主要成分和FindClusters函数（Seurat，v2.1； res = 0.3）来识别8个主要簇。Arterial，HEC和CRP集群进一步细分为Art和Pre-Art，HEC和HEC（后期）。和CRP和CRP（早期），基于规范标记表达及其在PLN1的tSpace投影中的位置，共产生11个子集。剩余的PLN1细胞和来自独立处理的样品（PLN2和PLN3）的细胞使用〜3000个常见可变基因分配给核心PLN1细胞子集的最大相关（皮尔逊）平均表达谱的身份。使用MNN算法删除了技术复制中的批量效果75（在batchelor软件包的（v1.0.1）fastMNN函数中实现）。使用细胞周期基因的汇总表达值将细胞分类为分裂或静止（Satija Lab网站：regev_lab_cell_cycle_genes）。对于UMAP和tSpace嵌入，通过将数据分为分裂和静止的细胞并使用fastMNN函数将分裂的细胞与其静止的对应物对齐，可以消除细胞周期效应。使用UMAP算法进行降维，使用tSpace算法10计算轨迹推断和血管建模的最近邻比对 10。通过在tPC投影1-5内进行门控来选择沿孤立轨迹的细胞；并在此处的图中进行了说明。通过将每个子集与其余细胞进行比较，并使用LineagePulse软件包v0.99.20拟合零膨胀负二项式模型，进行差异基因表达分析。为了评估单个细胞的分化能力，在将读数随机下采样至1000个读数/细胞后，计算每个细胞的信号熵率（SR）36。
使用ComplexHeatmap程序包76生成热图，将其缩放为最大值1。使用从cyt（Pe'er Lab）的plot_as_function改编的代码对轨迹热图的数据进行预处理：使用a相对于轨迹距离对归一化的计数数据进行平滑处理。高斯核，并使用离散色标绘制。小提琴图使用ggplot2生成；基因表达数据的y轴单位对应于归因后对数转换的归一化计数。使用rgl软件包v0.100.30生成了3d绘图，并对交互式渲染进行了较小的源代码修改。
如先前所述计算GO术语基因组和其它组的基因的表达汇集值77使用修拉（V3.1.1）的AddModuleScore函数，其中心值减去汇集表达为随机集对照基因具有相似的表达水平的。为了鉴定生物学上相关的GO术语，我们首先通过将AddModuleScore函数系统地应用于具有至少3个表达基因的所有当前注释的GO术语，来生成一个汇总的表达矩阵。通过使用Student's t将每个子集与其余细胞进行比较，从生成的“ GO术语表达矩阵”（14300个GO术语乘以8832个细胞）中识别出差异调节的GO术语-测试。常规GO术语分析方法（例如使用Enrichr分析顶部差异表达基因）观察到高度重叠。由于此GO术语分析方法是逐个单元地进行的，因此对于鉴定其富集跨越多个子集的术语特别有用，例如GO：0015669_gas transport（补充图 3）。
以下抗体（克隆；目录号；稀释液）用于显微镜和FACS：亮紫（BV）605缀合的CD31（390; 102427; 1：100），周长素叶绿素蛋白–菁5.5 –缀合的抗CD45（ 30-F11; 103131; 1：100），苦瓜素叶绿素蛋白-花青5.5结合的抗Ter-119（TER-119 TER-119; 116227; 1：100），苦瓜素叶绿素蛋白-花青5.5-结合的抗CD11a （H155-78; 141007; 1：100），peridinin叶绿素蛋白-花青5.5-结合的抗CD326（G8.8; 118219; 1：100），藻红蛋白-花青7-结合的抗Gp38（8.1.1; 127411） ； 1：100），抗-VE-钙黏着蛋白（VECD1; 138101）和与BV421结合的抗CXCR4（L276F12; 146511）来自Biolegend。BV421偶联的抗CD146（ME-9F1; 740095; 1：100）和BV480链霉亲和素（564876; 1：200）来自BD Biosciences。抗雌激素受体α抗体（SP1; ab16660; 1：100）和抗-ERG抗体（EPR3864; ab196149和ab196374）来自Abcam。抗CD276（MIH35； 16-5937-81）来自Thermo Fisher Scientific。抗PNAd（MECA79），抗Ly6c（Monts1），抗EMCN（5C7），抗PODXL（MECA-99），抗ICAM-1（BE29G1），抗VCAM-1（6C2.1），抗PLVAP（MECA-32）和抗Slex（F2）是从杂交瘤内部产生的；用DyLight抗体标记试剂盒或生物素标记试剂盒（Thermo Fisher Scientific）标记，并以10ug / ml的浓度使用。Alexa Fluor 488偶联的针对兔IgG的驴抗体（711-546-152; 1：500）来自Jackson ImmunoResearch Laboratories。用于体内选择素阻断的抗体来自BD Biosciences：抗E选择素（10E9.6; 553749），抗P选择素（RB40.34; 550289）和NA / LE同型对照大鼠IgG1（R3-34 ； 554682）。FACS的抗体稀释度是近似值；实验之间的实际稀释度有所不同。
眶后注射荧光标记的抗体或对LN切片进行荧光染色后，对PLN成像。如果注射，则在处死和去除PLN之前5–30分钟施用抗体（25–75 µg）。为了使整体血管成像，将PLN在载玻片上轻轻压缩至〜35–50 µm的厚度。或者，将PLNs用4％多聚甲醛固定，用蔗糖冷冻保护，在2-甲基丁烷（Sigma）中的OCT（Sakura®Finetek）中冷冻在干冰上，并保存在-20°C下。根据标准方案，用抗体对50 µm冷冻切片进行染色。使用Apotome 2.0荧光显微镜或LSM 700或LSM 880激光扫描显微镜（Zeiss）对载玻片成像。使用斐济消除了噪音。
为了定量ER +细胞，在来自Apln CreER小鼠的切片中，抗人类雌激素受体抗体被用作Apln的替代染色剂。使用网格掩模版以20倍物镜在50 µm切片内枚举毛细血管，HEV和ER +血管，以确定每个EC子集的相对频率（1个长度单位=网格高度的1/8）。扫描足够的视野以包含> 5000 HEC，评估与抗ER抗体的反应性。数据表示为每个淋巴结切片的ER +频率（占血管总数的百分比，即ER +毛细血管长度+ HEC 的百分比）。我们从两只Apln CreER不受挑战的小鼠中扫描了9个LN，从两只Apln中扫描了9 个LN皮肤发炎后五天的CreER小鼠（每个LN切片）。基于MECA79 + EC中的ERG +核，使用×10或×20物镜确定每个视野的HEC数量。
将LysM GFP小鼠的右足垫注射2.5×10 7 CFU金黄色葡萄球菌。一小时后，小鼠接受静脉注射的Cell Tracker Red CMTPX（Thermofisher）标记的淋巴细胞。淋巴细胞注射小鼠后一小时用抗PNAD的混合物静脉内注射-Dylight594和白蛋白-Dylight-680分别可视化HEV和脉管系统。用双光子显微镜观察金黄色葡萄球菌感染后中性粒细胞和淋巴细胞在淋巴结血管中的运动和位置。右后肢pop神经LN暴露在麻醉小鼠中进行成像。LN从2到4 hpi成像。图像采集是通过立式两光子显微镜（Leica Biosystems TCS SP8立式显微镜）进行的。为了进行抗体封闭研究，在感染前20分钟用封闭抗体对小鼠进行预处理。
恶唑酮：通过在20：1丙酮：橄榄油中加入20 µl 3-5％4-乙氧基亚甲基-2-苯基-2-恶唑啉-5-酮（Sigma-Aldrich）进行皮肤免疫攻击。在炎症后的不同时间点收集周围LN（腋窝，臂肱，腹股沟）以进行成像。完全弗氏佐剂（CFA）：小鼠接受单侧飞虱注射10 µl完全弗氏佐剂（Sigma–Aldrich），三，半周后收集the LN，并将发炎的淋巴结与未发炎的对照进行影像学比较。
对于免疫前静息LN中标记的CRP的谱系追踪，在处死前24 h ip注射80 ug / g 4-羟基他莫昔芬（4-OHT; Sigma–Aldrich）在Apln CreER ×R26 mTmG小鼠中诱导报告基因表达或免疫接种，或在单独的实验中处死或免疫接种之前76小时（请参见文字和图例）。在指定的时间点处死经免疫的小鼠，并取LN进行成像。其他用于控制报告基因泄漏的LN包括来自平行免疫而未接受他莫昔芬诱导的Apln CreER ×R26 mTmG小鼠的LN 。为了在最初免疫后标记和追踪表达Apln CreER的细胞，在Apln中诱导了报告基因表达恶唑酮皮肤涂漆后的第二天，对CreER ×R26 tdTomato小鼠进行成像，并在24小时后或11天后对淋巴结成像。
使用Tukey校正的双向方差分析计算两组之间的统计显着性。应用三个规则确定ER +细胞计数的95％置信区间。假设潜在的零膨胀负二项式分布，似然比检验用于差异基因表达分析。P -值通过计算假发现率（FDR），并调整调节用于多重比较p -值<0.001被认为是显著。
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