通过巨噬细胞上的Toll样受体4（TLR4）检测微生物成分，例如脂多糖（LPS），可诱导强烈的促炎反应，这取决于代谢重编程。这些先天的代谢变化已与肿瘤细胞中的有氧糖酵解进行了比较。但是，TLR4激活导致线粒体和糖酵解重编程的机制尚不清楚。在这里，我们显示TLR4激活诱导信号级联募集TRAF6和TBK-1，而TBK-1磷酸化S727上的STAT3。使用无法进行STAT3 Ser727磷酸化的基因工程小鼠模型，我们在体内和体外显示STAT3 Ser727磷酸化对于LPS诱导的糖酵解重编程至关重要，在LPS诱导的炎症模型中，产生中枢免疫应答代谢产物琥珀酸酯和炎症细胞因子。我们的研究确定非规范的STAT3激活是TLR4诱导的糖酵解，巨噬细胞代谢重编程和炎症反应的关键信号中介。
TLR4活化诱导线粒体通过重新编程，这是需要满足用于生物合成前体的脂质，蛋白质，核酸和炎症状态的增加的能源需求需求迅速增加巨噬细胞中的代谢变化1，2，3，4。炎性细胞因子和趋化因子的LPS诱导的转录也依赖于代谢重编程2，5。
活化的巨噬细胞变得更具糖酵解性，增加了活性氧（ROS）的产生，并积累了三羧酸（TCA）循环代谢产物琥珀酸酯，使其通过电子转移链（ETC）从氧化磷酸化转向。最近的研究确定了TLR下游激酶TBK-1和IKKε在免疫细胞诱导糖酵解发挥作用的6，7通过Akt磷酸化6，但如何将这些信号汇聚，并协调线粒体代谢功能尚不清楚。
代谢信号对琥珀酸浓度升高的响应导致了缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的稳定，该因子正调控糖酵解中涉及的原型炎症细胞因子IL-1β和其他HIF-1α依赖性基因8。然而，膜结合的TLR如何将该信号传递至线粒体以改变线粒体功能的分子机制也不清楚。
STAT3是由免疫细胞因子激活的关键信号分子，可导致Tyr705磷酸化并激活其作为转录因子的活性9。除了在细胞核内，我们和其他人这一重要的活动，表明Ser727池STAT3磷酸易位至它影响线粒体代谢和ROS生成线粒体10，11，12。
在这项研究中，我们通过TLR询问STAT3的激活，将其作为直接改变线粒体代谢的机制。STAT3通过与TRAF6和TBK-1的相互作用直接与TLR信号通路相互作用，从而导致非规范的STAT3 Ser727磷酸化。随后，TLR诱导的线粒体重编程和炎症细胞因子的产生需要STAT3 pSer727。这些研究确定了STAT3在TLR诱导的代谢重编程和炎症中的功能。
TLR的激活，与TLR3外，死骨MyD88的丝氨酸的受体复合物，引发激酶招募和IRAK1 IRAK4到Myddosome复杂7，13，14，15，16。该复合物随后与TRAF6相互作用以激活经典信号通路，导致NF-κB的核易位并诱导经典的促炎反应17。或者，TLR3和TLR4也与衔接子TRIF结合，导致丝氨酸激酶TBK-1活化，随后IRF3磷酸化，导致核转运和IFNβ表达诱导。
TRAF6代表炎症的规范性和非规范性诱导之间TLR信号分叉的要点。TRAF6-结合伴侣的结构分析显示由临-X-GLU-XX-（芳族的或酸性的残基）的保守结合基序18，用于与下游信号传导蛋白，包括马尔/ TIRAP，TRIF，TRAM和STAT1交互所需19，20，21，22。考虑到STAT蛋白之间的同源性以及STAT3在线粒体重编程中的作用，我们在STAT3中鉴定出高度保守的推定TRAF6结合基序（图 1a），并确认内源TRAF6和STAT3之间的相互作用发生在LPS刺激10分钟内巨噬细胞（图 1b）。为了确定STAT3中推定的TRAF6结合位点的重要性，我们生成了一系列突变STAT3构建体，这些构建体在293T细胞中瞬时表达并与重组GST标签的TRAF6体外结合。该数据表明对Glu100的选择性，即STAT3 E100A完全消除了与TRAF6的相互作用，而对于其他假定的相互作用基序则没有观察到（图 1c）。
一个假定的TRAF6结合结构域和STAT3磷酸化位点的示意图。ND：N-末端结构域：SH2：Src同源结构域TAD：反式激活结构域。b将 BMDM（1×10 7个细胞）接种在10 cm培养皿中并生长24小时，然后用LPS（1μg/ ml）刺激指定的时间。TRAF6从蜂窝裂解物中免疫并用抗TRAF6探测，或STAT3抗体（Ñ = 3）ÇHEK293T细胞（1×10 6）转染用24小时指示的质粒载体。裂解细胞并用重组GST-TRAF6探测免疫沉淀的相互作用蛋白，通过SDS-PAGE分离并用抗FLAG抗体探测（n = 3）。
最初，我们使用IFNα作为STAT3的众所周知的活化剂来治疗永生化的骨髓来源的巨噬细胞（iBMDM）。虽然我们在未处理的细胞中观察到背景Ser727磷酸化的STAT3，但iBMDM却显示出Ser727和Tyr705上磷酸化的迅速增加（图 2a）。相反，据报道，TLR配体仅在长时间刺激后才在Tyr705上启动STAT3的磷酸化，这与继发和间接激活更为一致。为了解决TLR激活是否诱导快速STAT3磷酸化，我们用LPS攻击了原代骨髓巨噬细胞（BMDM），并在攻击后20分钟内观察到S727磷酸化，而即使在120分钟后也未检测到Tyr705磷酸化（图 2b）。）。为了确定STAT3 Ser727磷酸化是否被所有TLR诱导，我们以Pam3Cys（TLR2），poly I：C（TLR3），Loxoribine（TLR7），CpG-DNA（TLR9）或IFNα作为阳性对照刺激巨噬细胞。所有TLR激动剂均诱导STAT3的Ser727磷酸化，但不诱导Tyr705磷酸化，而IFNα可以诱导pSer727和pTyr705结合（图 1c）。
a将永生化BMDM（iBMDM）（1×10 6）用IFNα（1000 U）处理指定的时间，b将 BMDM（1×10 6个细胞/孔）用LPS处理指定的时间，并将c BMDM处理TLR激动剂，Pam 3 Cys（TLR2，100 ng / ml），Poly I：C（TLR3，500 ng / ml），LPS（TLR4，100 ng / ml），Loxoribine（TLR7，10 mM），CpG-DNA（ TLR9，2.5μM）和IFNα（IFNAR1，1000 U）持续60分钟。如图所示，通过用抗STAT3，抗STAT3 pS727和抗STAT3 pY705抗体对细胞裂解液进行免疫印迹来检测STAT3磷酸化状态（n = 3）。d MyD88 -/- / TRIF -/- iBMDM或e 如描述的那样，用TLR配体（n = 2）处理IFNAR1 -/- BMDMs，并用抗STAT3 pS727和细胞裂解物的抗STAT3抗体进行免疫印迹分析，与缺乏IFNAR1的BMDMs相比，TLR诱导的STAT3 Ser727磷酸化被消融（图。 3e），但不包括IFNα（n = 2）。（F）将iBMDMs用PBS或LPS（100 ng / mL）处理1 h，然后通过SDS-PAGE分离和分离全细胞裂解液，S100或干净的线粒体级分。通过用抗Erk2（S100），VDAC（线粒体）或Lamin A / C（核）的抗体探查，观察到每个馏分中STAT3和pS727 STAT3的丰度以及馏分纯度。显示的数据为a n = 1，b n = 5 的平均值±SEM。c，e n ＝ 3，d，f n ＝ 2个独立实验。
TLR信号通路的刺激至少有两个阶段的反应。依赖于Myddosome复合物成分MyD88和TRIF的早期反应，导致NF-κB和干扰素调节因子（IRF）-3的激活，从而驱动包括I型IFN 17在内的一系列炎症基因的转录。以及对分泌的I型IFN的继发性反应。为了确认STAT3 Ser727的磷酸化直接归因于TLR激活而不是自分泌细胞因子或I型IFN信号传导的结果，我们在缺乏关键Myddosome因子MyD88和TRIF或缺少I型IFN的细胞中建立了S727上的STAT3磷酸化受体（IFNAR1）。我们显示LPS不会在MyD88 -/- / TRIF -/-的S727上诱导STAT3磷酸化iBMDM（图 1d），但在IFNAR1 -/-缺陷型巨噬细胞中不受影响（图 1e）。综合起来，这些结果首次证明，STAT3通过与TRAF6的相互作用而直接募集到TLR信号传导途径中，从而导致STAT3 Ser727磷酸化，而不是Tyr705磷酸化。
在没有Tyr705磷酸化的情况下，TLR诱导的STAT3的Ser727磷酸化与我们先前在RAS转化癌细胞11中描述的新型线粒体STAT3活性的激活相一致。虽然大多数STAT3存在于细胞质中，但STAT3池转入线粒体，引起代谢重编程，并改变ROS的产生，取决于pSer727，但与Tyr705磷酸化无关11。因此，我们对LPS处理的巨噬细胞进行了生化分级分离（图 1f）并证明LPS刺激60分钟后，STAT3 pSer727在线粒体组分中富集。两者合计，这些结果表明STAT3经历快速TLR诱导Ser727，但不是Tyr705磷酸化和巨噬细胞线粒体部分中的积累。
接下来，我们希望确定负责TLR诱导的STAT3 Ser727磷酸化的潜在激酶。我们以前已经表明，STAT3的线粒体活性导致线粒体ROS（mtROS）产生增加23。因此，为了鉴定负责LPS诱导的STAT3 Ser727磷酸化的潜在激酶，我们使用mtROS浓度作为活性的功能读数，并筛选了355种激酶抑制剂的文库（补充数据集 1）。在LPS攻击之前，巨噬细胞用抑制剂预处理30分钟，并每小时监测mtROS产生4小时（补充图 S1）。）使用线粒体超氧化物探针MitoSOX。作为阳性对照，我们在所有筛选中均包括了ROS清道夫N-乙酰-L-半胱氨酸。这种筛选方法确定了几类能够降低LPS诱导的mtROS产生的抑制剂（图 2a）；包括PI3K，mTOR和IκB激酶抑制剂（IKK）抑制剂。有趣的是，我们还鉴定了坦克结合激酶1（TBK-1）抑制剂作为LPS诱导的mtROS产生的抑制剂。重要的是，IRAK1和IRAK4是与TRAF6 18和MyDDosome 相互作用的丝氨酸激酶，其激酶活性对于TLR信号转导和NF-κB激活至关重要13。但是，我们发现，IRAK-1 / 4活性的特异性抑制剂对LPS诱导的mtROS产生没有影响，因此可能不引起STAT3磷酸化，从而充当此筛选的特异性对照。
这与Tan和Kagan最近发表的论文7一致，后者显示耗尽TRAF6的巨噬细胞对于TBK-1募集到Myddosome和诱导TLR糖酵解方面是有缺陷的。对TBK-1序列的分析揭示了假定的TRAF6结合基序（人氨基酸223-228），表明这些蛋白质之间可能存在相互作用。的确，内源蛋白的免疫沉淀表明，LPS刺激后，TBK-1以时间依赖性和瞬时方式直接与TRAF6相互作用（图 2b）。）。在LPS刺激后10分钟内观察到了TBK-1-TRAF6相互作用，在刺激后120分钟后不再可检测到。我们以前的数据证明了TRAF6和STAT3之间的相互作用，并导致我们提出了TBK-1，TRAF6，STAT3复合物的形成，以使TBK-1磷酸化STAT3以应对LPS攻击。与此相一致，我们表明STAT3与磷酸化的TBK-1相互作用，其动力学与TRAF6-TBK-1的相互作用略有偏移（图 2c）。重要的是，免疫沉淀的STAT3在Ser727上被磷酸化。
尽管相互作用研究和我们的mtROS抑制剂筛选表明TBK-1是STAT3 S727磷酸化响应LPS刺激的上游激酶，我们希望对此进行正式测试。因此，我们检查了TBK-1缺陷型巨噬细胞中的STAT3 S727磷酸化。如图3d所示 ，与WT细胞相比，我们观察到STAT3 S727磷酸化的一致性降低了约50％，这表明TBK-1参与了STAT3 Ser727磷酸化。先前的研究表明，TBK-1及其紧密相关的激酶IKKε参与TLR诱导的糖酵解重编程6，以及IKKε -/-中TBK-1的缺失 巨噬细胞减少了依赖于TRAF6相互作用的LPS诱导的糖酵解，提示IKKε也可能在STAT3磷酸化中发挥作用。
在用激酶抑制剂（Y轴； 500 nM）预处理30分钟之前，将 iBMDMs以每孔4×10 4个细胞一式三份地接种24小时。在用LPS（100 ng / ml; 0、1、2和4 h）攻击之前，先加入MitoSOX 10分钟。通过测量580 nm处的氧化MitoSOX荧光来分析LPS诱导的线粒体超氧化物的产生。另见补充图 1。用b抗TRAF6和c抗STAT3抗体免疫沉淀LPS刺激的BMDM的细胞裂解液（0-120分钟）。通过分别用抗TBK-1和抗TBK-1 pS172抗体进行免疫印迹来鉴定TBK-1与TRAF6和STAT3的相互作用。b，c ^数据代表三个独立的实验，结果相似。d用LPS或IFNα处理TBK-1缺陷型和WT巨噬细胞指定的时间，并用指定的抗体通过免疫印迹在细胞裂解物中测定STAT3磷酸化。用抗TBK-1抗体通过免疫印迹确定TBK-1表达。È的BMDM用的TBK-1 /IKKε（1μM）抑制剂-795 BX 60分钟之前LPS刺激所示的时间进行预处理。STAT3和TBK-1磷酸化通过用指定抗体进行的免疫印迹观察到。DMSO被添加到13-14车道作为车辆控制。免疫印迹结果代表了三个独立的实验，数据（d，e）表示为平均值±SEM
因此，我们预处理的巨噬细胞与抑制剂BX-795，在1μM，在该浓度已知的是，同时定位TBK-1和IKKε 24，25，30分钟LPS刺激之前。该预处理将STAT3 Ser727磷酸化降低至背景水平（图 2e）。这些数据表明密切相关的激酶TBK-1和IKKε参与STAT3 Ser727磷酸化。这些发现与以前的研究一致，该研究确定了过表达的TRAF6和TBK-1之间的相互作用，并且这些激酶也可能在下游TLR信号传导中发挥作用，而与它们在介导TLR诱导的IRF3磷酸化和IFNβ诱导中的既定作用无关26。而PI3激酶和Akt先前已在TLR诱导重编程糖酵解经由TBK-1 /IKKε牵连6，没有在我们的研究中筛选的七个的Akt抑制剂的减少LPS诱导的mtROS（图 3A）。因此，我们检查了PI3激酶抑制剂TG100713是否也能抑制LPS诱导的STAT3 Ser727磷酸化，并注意到该抑制剂对LPS诱导的磷酸化没有影响（补充图 S2）。因此，虽然先前已将Akt确定为树突状细胞6中TLR诱导的糖酵解中TBK-1 /IKKε的下游目标，但Akt和PI3激酶均未涉及巨噬细胞TBK-1介导的糖酵解7。并且在巨噬细胞中似乎未在STAT3 S727磷酸化中起作用。一起然而，这些研究鉴定TRAF6，TBK-1 / STAT3信号传导关系导致STAT3 S727磷酸化和线粒体定位，用于在TBK-1 /IKKε信令之前描述的作用提供了一个潜在的机制TLR诱导糖酵解6，7。
确实，虽然非典型的TBK-1募集和磷酸化在巨噬细胞LPS诱导的糖酵解7中被认为是至关重要的，但Akt在巨噬细胞信号传导中的作用并未建立类似于树突状细胞的作用6。此外，这些激酶的作用可能反映巨噬细胞和树突状细胞之间的细胞特异性信号传导差异，或反映早期和晚期糖酵解代谢重编程途径的动力学。
尽管糖酵解和代谢重编程的诱导作用因其在巨噬细胞的炎症状态中的重要性而日益得到认可，但TLR如何促进这种反应的机制尚不清楚。我们的发现确定了经由STAT3的TBK-1磷酸化的TLR信号转导中非规范激酶活性的分子功能，该蛋白随后转移至线粒体。
鉴于以前已经证明TBK-1可以促进TLR依赖性糖酵解，并且我们已经报道了STAT3 Ser727依赖性代谢变化，因此我们假设STAT3 Ser727磷酸化的丧失会阻碍代谢重编程。为了解决这个问题，我们对从小鼠体内获得的原代腹膜巨噬细胞进行了一组代谢分析，在这些小鼠中，丝氨酸至丙氨酸（S727A）突变被敲入了内源性STAT3基因座27中，从而消除了Ser727磷酸化（STAT3 S727A;在本文中称为STAT3 SA）。由于已知在生长因子信号传导和分化中需要STAT3（例如CSF-1，GM-CSF途径），因此我们将腹膜渗出液（PEC）用于这些研究28，此外，PECs代表局部免疫环境，主要由髓样细胞组成29。我们发现，通过检测ECAR，在LPS攻击后，野生型巨噬细胞中观察到的STAT3 SA PECs在静止糖酵解和早期糖酵解爆发中均具有明显缺陷（图 4a）。连同先前在TBK-1 /IKKε缺陷细胞中的观察结果7，这些数据支持STAT3磷酸化诱导代谢重编程的概念。
从WT与STAT3 SA小鼠（ 每基因型n = 3 ）获得的腹膜巨噬细胞（1×10 5 /孔）。LPS（b，c）处理的WT和STAT3 SA腹膜巨噬细胞的WT和STAT3 SA巨噬细胞的细胞外酸化率（ECAR）的实时变化被LPS或溶媒刺激24小时。b *** p <0.0001，而c ** p = 0.0034，*** p <0.0001。一个，b的ECAR和氧消耗速率（OCR）进行了分析作为氧化磷酸化和糖酵解的指标，采用了海马XFP分析器。d腹膜巨噬细胞的OCR实时变化可通过依次处理，依次用电子链抑制剂（寡霉素：三磷酸腺苷（ATP）合酶抑制剂； FCCP：H +离子载体氰化物对-三氟甲氧基苯基-氢键；和复合物I）处理来测定抑制剂鱼藤酮）。e比较LPS或媒介物刺激24 h的WT和STAT3 SA腹膜巨噬细胞的最大呼吸容量（MRC）。结果（a – e）为每种基因型从三只单独的小鼠中获得的腹膜巨噬细胞的平均值±SEM，*** p = 0.0004，采用Tukey多重比较检验的单向方差分析（f – g）将来自单个小鼠的腹膜巨噬细胞以1×10 5细胞/孔接种，并用LPS（100 ng / ml）刺激24 h，然后分析WT和STAT3 SA培养的上清液中产生的琥珀酸和乳酸代谢产物。数据表示为每种基因型五只小鼠的重复技术重复±SEM的平均值，f * p = 0.0292，*** p <0.0001 g *** p = 0.0004，单向方差分析，采用Tukey多重比较检验。
为了确定线粒体重编程是否需要STAT3 Ser727磷酸化，我们将WT和STAT3 SA腹膜巨噬细胞暴露于LPS 24 h，并观察WT3 SA与WT细胞相比ECAR和线粒体耗氧率（OCR）的消融（图 4b）。 ，c）。接下来，我们通过用线粒体ETC抑制剂顺序处理细胞后确定OCR的变化，从而检查了电子传输链的功能能力。这些数据表明，STAT3的S727磷酸化对于引发LPS诱导的线粒体重编程至关重要，并表明STAT3在LPS诱导的代谢重编程中与肿瘤细胞中观察到的平行。
与我们先前在癌细胞11中观察到的一致，STAT3 S727磷酸化的丧失导致基础呼吸率降低。而且，与WT细胞相比，STAT3 SA巨噬细胞的最大呼吸能力显着降低（图 4d，e）。这些数据意味着，尽管STAT3 SA PEC可行并具有主动呼吸作用，但即使没有LPS刺激，它们仍以接近其最大容量的方式运行。还应当指出的是，下面的一个24小时LPS处理我们观察腹腔巨噬细胞的增加在基础呼吸是OCR的LPS介导的抑制的在的BMDM中观察到的相反，但是一致的与其他研究PECs上30，31。这潜在地反映了这些巨噬细胞群，其中，当与比较的BMDM胸肌显示M1标志物的更高表达的不同的偏振32。事实上，除了在来自不同微环境的巨噬细胞的内在代谢差异，已经建议，培养7天的BMDM在M-CSF与腹膜巨噬细胞相比，向M2分化培养可以偏压它们的过程33。因此，尽管两种细胞类型均显示出内在的能力来诱导强力的炎症反应，但它们的代谢反应却不同。
LPS激活的巨噬细胞伴随着TCA周期的重塑，导致TCA代谢产物（包括琥珀酸盐）的浓度累积，这在线粒体重编程和炎性细胞因子产生中起着关键作用。我们发现，用LPS处理24小时的WT腹膜巨噬细胞显示琥珀酸显着增加。然而，如野生型（WT）巨噬细胞所观察到的，STAT3 SA巨噬细胞未能增加琥珀酸盐浓度（图 4f）。我们的数据还显示，STAT3 SA巨噬细胞的基础ECAR较低，它对LPS的反应有所增加，但对WT巨噬细胞的大小却没有。这与以前的观察线从STAT3 SA细胞线粒体有缺陷在ETC活动10，11。因此，STAT3 SA线粒体可能更依赖于有氧糖酵解，这与响应LPS刺激而使STAT3 SA巨噬细胞中的乳酸浓度显着增加相一致（图 4g）。但是，LPS处理的STAT3 SA巨噬细胞中的乳酸浓度仅接近未挑战的WT巨噬细胞中观察到的乳酸浓度。此外，我们没有观察到响应LPS刺激的野生型巨噬细胞中乳酸浓度的任何增加。鉴于ECAR通常与乳酸的产生有关，因此该结果似乎有点违反直觉。但是，必须注意的是，ECAR还测量了CO 2的出口，H 2 CO 3的水合作用和向HCO的离解。3和H +来自呼吸链，这也有助于ECAR读数34。总之，这些数据表明，LPS诱导的STAT3 Ser727磷酸化是TCA周期（琥珀酸盐浓度）和OXPHOS（OCR）增强所必需的。
以前的研究已经强调的是，增强琥珀酸生产是促炎症反应的关键调节剂通过ETC介导mtROS生产，IL-1β的表达2，8，35。与这些观察结果一致，我们表明STAT3 SA巨噬细胞产生明显更少的IL-1βmRNA表达（图 5a）。因此，我们研究了LPS刺激后STAT3 SA PEC中细胞因子的动力学和表达。与我们的mRNA数据一致，虽然在LPS攻击的4至24小时内IL-1β表达稳定增加，但与WT细胞相比，STAT3 SA细胞裂解物中IL-1β蛋白表达被显着抑制（图 5b））。此外，与WT细胞相比，STAT3 SA中的TNF表达降低了（图 5c），但确实平行于WT表达继续增加，而IL-6浓度仅在LPS后24小时才显着不同（图 5d）。有趣的是，尽管我们观察到未刺激的STAT3 SA巨噬细胞中IL-10表达增加，但在WT细胞中观察到IL-10产量增加时，它们对LPS无反应（图 5e）。这些结果表明，STAT3 Ser727在LPS攻击后在炎性细胞因子表达中起关键作用。重要的是，这些研究结果与以往的研究表征代谢重编程不可或缺的IL-1β生产一致性2，8，35，而IL-6等细胞因子的暂时性升高可能是由于IL-1β或TNF生成减少导致自分泌诱导减少所致。有趣的是，它也提示STAT3 Ser727磷酸化可能在稳态IL-10表达中起作用。
从每种基因型的三只小鼠获得的腹膜巨噬细胞以5×10 5个细胞/孔接种，并用LPS（100 ng / ml）刺激24小时，然后分析IL-1βmRNA表达。数据表示为平均值±SEM，*** p <0.0001，ns-不显着，单向方差分析，Tukey的多次比较测试。从单个WT和STAT3小鼠（每个基因型3只小鼠）产生的腹膜巨噬细胞一式三份地接种在1.5×10 5处。用100 ng / ml的LPS和b细胞裂解液刺激巨噬细胞4、12和24 h，测定IL-1β，并以IL-1β/ mg的总蛋白表示** p = 0.0011，*** p <0.0001 ，并测定培养上清液的cTNF（4 h，*** p = 0.0007; 12 h ** p = 0.0015; 24 h *** p = 0.0001），d IL-6（*** p <0.0001）和e IL-10（* p = 0.0168，*** p <0.0001）。呈现的数据是 每个基因型在每个时间点的三只小鼠（n = 3）的一式三份值的平均值，分析了2种方差分析，Sidak的多重比较测试。WT和STAT3 SA小鼠（Ñ 每种基因型= 9只小鼠）腹膜内注射10mg / kg的LPS处理90分钟，血清分析˚F IL-1β（* p = 0.0444），克 IL-6（* p = 0.0313），h MCP-1（** p = 0.0046），i TNF（p = 0.3994）和j IL-10（p = 0.8204）通过ELISA或细胞计数珠阵列进行表达。数据表示为平均值±SEM，学生未配对t检验，两尾。
内毒素血症8期间，巨噬细胞中需氧糖酵解的增加起着至关重要的作用。为了研究STAT3 Ser727磷酸化在TLR诱导的体内炎症中的作用，我们在LPS诱导的脓毒症模型中检查了STAT3 SA小鼠。如在图5f-1中可见 ，与WT小鼠相比，STAT3 SA小鼠在急性LPS攻击后证明血清中IL-1β，IL-6和Ccl2的产生显着降低，但TNF没有显着降低。与我们的体外研究一致，我们观察到IL-10表达没有差异（图 5j），这反映了对LPS刺激的早期反应，而IL-10表达可能会延迟。两者合计，这些结果突出了Ser727磷酸化STAT3在介导炎症基因诱导中的特异性。
越来越多的证据表明，在TLR激活后，代谢重编程是炎症反应中的关键事件。重要的是，这项研究首次确定了TLR信号传导与线粒体通信的分子机制。我们已经证明TBK-1包含一个推定的TRAF6结合位点，允许其直接募集到TLR信号通路，促进TBK-1介导的STAT3 Ser727磷酸化和易位到线粒体。无法经历STAT3 Ser727磷酸化的巨噬细胞显示出TLR诱导的糖酵解重编程受损，促炎性代谢产物产生减少和炎症减轻。这一发现与癌细胞中的观察结果相似，这进一步增强了炎性巨噬细胞诱导Warburg效应产生促炎表型的概念。这样，STAT3不仅是中央免疫调节转录因子，而且还通过非规范信号迅速协调先天免疫线粒体重编程和炎性细胞代谢。
WT，IFNAR1 -/-（Hudson医学研究所的Paul Hertzog教授的礼物），TBK-1 F / F，TBK-1 F / F / Vav-iCre BMDM在含有30％M-CSF条件的DMEM中分化从L929成纤维细胞上清液中收集的培养基，离心去除细胞碎片（5分钟，300 g），并通过0.22μm过滤器过滤。手术切除小鼠的腿骨，用剪刀切开清洁的骨头，并通过注射器用无菌PBS冲洗。使骨髓悬浮液通过70μm细胞过滤器以除去团块，并在37°C的L929补充10％FCS，DMEM（Gibco）和L-谷氨酰胺（Gibco）的低粘附性10 cm组织培养板中培养细胞， 5％的CO 27天。在第3天，向细胞再补充5ml L929条件化的FCS / DMEM。在轻轻刮擦下从组织培养板中移出细胞，并在刺激前24小时以所需的密度接种在补充有L-谷氨酰胺的1％FCS / DMEM中。或治疗。
永生化的WT和MyD88的- / - TRIF - / -的BMDM（iBMDMs）从与J2携带V-myc和V-RAF癌基因重组逆转录病毒指示的小鼠产生36，37。
永生的WT BMDM是Douglas Golenbock教授（UMASS）的一种礼物。从ATCC获得的HEK293T细胞在添加有L-谷氨酰胺的DMEM中的10％FCS中生长，并在37°C的5％湿润CO 2中生长。
所有实验程序均已得到莫纳什医学中心动物伦理委员会的批准。使用6-12周龄的雌性和雄性小鼠。根据澳大利亚政府动物福利法规，将STAT3 S727A（STAT3 SA）27，IFNAR1 -/-和C57BL / 6J WT保留在Monash Medical Center动物设施中，且无特定病原体的条件下。TBK-1 F / F和TBK-1 F / F/ Vav-iCre根据《动物福利法》，《美国国家卫生研究院实验动物的护理和使用指南》中的建议，由联邦医学会动物设施维护。麻省医学院医学院动物保护和使用委员会的成员。
通过腹膜灌洗，用5 ml补充有5 mM EDTA的冷无菌PBS从WT和STAT3 S727A（STAT3 SA）小鼠中收集腹膜细胞。离心细胞（300 g，5分钟），并使其在10％FCS，DMEM（Gibco）和2 mM L-谷氨酰胺（Gibco）中粘附到组织培养板上1 h。180分钟后，将细胞用无菌PBS洗涤3次，以去除非贴壁细胞，并在37°C，5％CO 2在1％FCS / DMEM中添加2 mM L-谷氨酰胺的条件下过夜培养29，然后进行实验29。
为了鉴定STAT3和TRAF6之间的结合界面，我们使用以下引物E28A通过E28，E100，E680或E28和E680的定点诱变产生了一组STAT3突变体：F 5'-CAGTGACAGCTTCCCATGGCGCTGCGGCAGTTTC；R 5'-GAAACTGCCGCAGCGCCATGGGAAGCTGTCACTG，E100A：F 5'-CTTGAGAAGCCAATGGCGATTGCCCGGATTGTG；R 5'-CACAATCCGGGCAATCGCCATTGGCTTCTCAAG，E680A：F 5'-CACAATCCGGGCAATCGCCATTGGCTTCTCAAG，R 5'- CTTGAGAAGCCAATGGCGATTGCCCGGATTGTG。使用lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific，Cat＃L3000001）将所得的带有FLAG标签的STAT3构建体转染到293T中。转染后48小时裂解细胞（50 mM Tris，pH 7.4，1.0％Triton X-100，150 mM NaCl，1 mM EDTA，2 mM Na 3 VO 4，10 mM NaF，1 mM PMSF和蛋白酶混合物抑制剂（Roche）），并在18,000 g下离心 5分钟（4°C）以除去碎屑。GST标签的TRAF6 C结构域被克隆到pGEX-4T-3中，并在BL21（DE3）细菌（Thermo Fisher Scientific，Cat＃EC0114）中表达，如前所述20。简而言之，将TRAF6转化的BL21细菌在补充有氨苄青霉素（100μg/ ml）的Luria Broth中培养，当OD600达到0.6时，通过与500μM异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖吡喃糖苷在16°孵育16小时来启动TRAF6表达。 C。离心沉淀细菌，并在50 mM Tris，150 mM NaCl中于pH 7.6与完全蛋白酶抑制剂（Roche）（每毫升细菌10 ml）一起温育，并在4°C下超声处理30 s，在30 s之间进行30 s爆破。总共10个周期。通过40,000× g离心来澄清细菌裂解液 在4℃下搅拌45分钟，并且将澄清的蛋白在4℃下旋转4h结合至谷胱甘肽琼脂糖珠（Thermo Fisher Scientific，目录号25236）。将珠子在10x珠子体积的裂解缓冲液中洗涤3次。通过SDS-PAGE和约63 kDa蛋白质的考马斯蓝染色评估蛋白质诱导和结合TRAF6的珠子。为了观察STAT3与重组TRAF6的结合，将20μl的GST-TRAF6珠添加至来自上述转染的293T细胞的等同的澄清的裂解物中。旋转在4°C下进行4小时的结合。在10x珠子体积的缓冲液50 mM Tris，pH 7.4，1.0％Triton X-100，150 mM NaCl，1 mM EDTA，2 mM Na 3 VO 4中洗涤珠子旋转3次，每次10分钟，10 mM NaF，1 mM PMSF（均为Sigma Aldrich）和蛋白酶混合物抑制剂蛋白酶（Roche，目录号05892970001），每次5分钟。在最后一次洗涤后，除去上清液，并将珠粒重悬在Laemmli缓冲液中，煮沸5分钟，然后与通过SDS-PAGE分离的输入蛋白样品一起。将凝胶转移至硝酸纤维素，在奥德赛封闭缓冲液（Li-cor，Cat＃927–70001）中封闭，并与所示的第一抗体一起孵育。转移后通过SDS-PAGE凝胶的考马斯亮蓝染色检测等效的GST-TRAF6负载。
为了检测STAT3的磷酸化状态，将BMDM（1×10 6）细胞接种在激动剂（IFNα，1000U;亲切的礼物）的6孔板中，Hudson医学研究所的Paul Hertzog教授，第3页半胱氨酸，100 ng / ml; EMC微样品集，目录号L2000S），聚I：C，10μg/ ml Invivogen，Cat＃tlt-picw，LPS，100 ng / ml; 指示时间的Invivogen Cat＃tlrl-b5lps，洛索比汀，500μM，Invivogen，Cat＃TLR1-lox和CpG-DNA 1668S，500 nM，定制合成Geneworks）。将pBMDMs在改良的RIPA裂解缓冲液[50 mM Tris（pH 7.4），150 mM NaCl，1 mM EDTA，1％（v / v）Triton X-100、0.3％（w / v）脱氧胆酸钠，0.3％中裂解） （w / v）补充了蛋白酶（Roche，Cat＃05892970001）和磷酸酶（Roche，Cat＃04906845001）抑制剂的SDS（全部Sigma Aldrich）。使用DC分析蛋白质浓度蛋白质测定（Bio-Rad，目录号5000111）。将样品还原并在含有10％（v / v）β-巯基乙醇的Laemmli缓冲液中煮沸，通过SDS-PAGE解析，转移到PVDF（EMD Millipore，Cat＃IPFL00010）上，在Odyssey封闭缓冲液（Li-cor，Cat＃ 927-70001）并与以下一抗孵育过夜：pY705-STAT3（1：1000，Cat＃9131），pS727-STAT3（1：1000，Cat＃9134），STAT3（124H6; 1：1000，Cat＃9139） ），α-TBK-1（1：1000，Cat＃3013），α-TBK-1pSer172（D52C2; 1：1000，Cat＃5483）源自Cell Signaling Technology。TRAF6抗体来自Santa Cruz Biotechnology（d-10; 1：500，Cat＃SC-8409），然后用合适的IRDye偶联二抗探测膜：抗兔IgG（1：5000，Thermo Fisher Scientific，Cat＃A21076 ），抗小鼠IgG（1：5000，Rockland Immunochemicals，Cat＃610-445-002），抗大鼠IgG（1：5000，Rockland Immunochemicals，目录号612-145-002）。使用Odyssey扫描膜®红外成像系统。为了评估激酶在STAT3磷酸化中的作用，在LPS攻击之前，将BMDMs用1μMBX-795（Caymen Chemicals，Cat＃14932）或1μMTG10073（Selleck Chemicals，Cat＃S2870）预处理60分钟，并进行分析。如上所述。补充信息中提供了所有图示的全图免疫印迹。
从iBMDM 11中分离出纯线粒体。通过用橡胶警察刮擦收集5×10 7 – 1×10 8iBMDM，洗涤两次并重悬于5×缓冲液A的沉淀体积中（20 mM HEPES pH 7.6、220 mM甘露醇，70 mM蔗糖，1 mM EDTA） ，0.5 mM PMSF和2 mg / ml牛血清白蛋白]。将细胞在冰上孵育15分钟以促进细胞肿胀，然后在200 PSI压力下进行氮气空化5分钟（PARR仪器，目录号4639）。将匀浆液在4°C下以800 g离心 10分钟，保留含有线粒体的上清液，并以10,000 g离心 在4°C下放置20分钟。将代表粗线粒体级分的上清液重悬于1 ml溶液B（20 mM HEPES pH 7.6、220 mM甘露醇，70 mM蔗糖，1 mM EDTA，0.5 mM PMSF）中，并加载到逐步Percoll（GE Healthcare，Cat ＃17-0891-01）梯度由1 mL 80％Percoll /天平溶液A，4.5 ml 56％Percoll /天平溶液A和4.5 ml 23％Percoll /天平溶液A组成。梯度在65,000 g下离心 45分钟，从56％和23％层的交界处分离出线粒体。将线粒体在溶液B中洗涤两次，通过将1μl线粒体悬浮液添加到600μl的50 mM Tris pH 7.4、0.1％（w / v）SDS中并测量280和310 nm的吸光度来检测线粒体蛋白含量。线粒体蛋白浓度（mg / ml）由（甲280nm处 - 甲310nm的）/1.05×600。
最初的10,000 g线粒体分离粗离心后，通过收集上清液制备S100馏分， 然后在Beckman台式超速离心机中以100,000 g进行离心。蛋白浓度通过Bradford测定法（Thermo Fisher，目录号23236）表征。通过SDS-PAGE分离等效蛋白，并用针对指定蛋白的抗体通过Western blot与蛋白含量和分离纯度相关（α-VDACD73D12，1：1000，Cat＃4661;α-LaminA / C，1：1000，Cat ＃2032；细胞信号技术；α-ERK1/ 2 K-23，1：1000，圣克鲁斯生物技术，目录号SC-94）。
使用RNAeasy分离试剂盒（Qiagen，Cat＃74104）从WT和STAT3 SA腹膜巨噬细胞中提取总RNA，并使用莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（Promega，Cat＃）用随机六聚体（Thermo Fisher Scientific，Cat＃N8080127）反转录。 1701）根据制造商的说明。使用针对il1b（正向5'- CAACCAACAAGTGATATTCTCCATG-3，反向5'- GATCCACACTCTCCAGCTGCA-3'）和18S（正向5'- GTAACCCGTTGAACCCATT-3'的引物对的SYBR试剂（Thermo Fisher Scientific，Cat＃A46012）对mRNA进行定量。 ，反向5'- CGAATCGAATCGGTAGTAGCG-3'）。使用比较CT方法分析相对mRNA表达，将感兴趣的基因标准化为18S管家基因，并计算相对于对照样品中表达的倍数基因诱导。
使用R＆D Systems的ELISA试剂盒（IL-1β：Cat＃DY401，TNF：Cat＃DY410，IL-6：Cat＃DY406和IL-10：ELISA）对腹膜巨噬细胞和血清分泌的细胞因子以及腹膜巨噬细胞裂解物进行定量。根据制造商的说明使用Cat＃DY417）或细胞因子珠子阵列小鼠炎症试剂盒（BD Biosciences，Cat＃552364）。
将iBMDM（4×10 4 / ml）一式三份接种在1％FCS / DMEM（Gibco）和L-谷氨酰胺（Gibco）培养基中的黑色微量测试Optilux 96孔板（BD Falcon）中4小时，然后用苯酚代替预处理30分钟前20小时-不含红1％FCS / DMEM（Gibco）和L-谷氨酰胺（Gibco）的红细胞，或不使用激酶抑制剂（500 nM）进行治疗。在用LPS（100 ng / ml，Invivogen）处理之前，将巨噬细胞与终浓度为1μM的MitoSox（Thermo Fischer Scientific，Cat＃M7512）孵育10分钟。每60分钟分析一次板的荧光发射，作为mtROS产生的标记（激发/发射510/580 nm），持续4 h（ClarioStar Plate Reader，BMG），并表示为与未处理的对照巨噬细胞相比的诱导倍数。
使用Seahorse XF分析仪测量WT和STAT3 SA腹膜巨噬细胞的ECAR和OCR。为了实时测量ECAR和OCR，从小鼠中分离细胞，以1×10 5个细胞/孔的八孔小板形式接种，并使其粘附过夜。将细胞在培养基中洗涤两次，并用LPS（100 ng / ml）处理24小时。读取前一小时，将细胞用洗涤两次，然后在无CO 2的培养箱中在补充有1 mM丙酮酸，2 mM L-谷氨酰胺和10 mM葡萄糖的Seahorse XF基础培养基（Agilent Technologies）中培养。在先于基础条件下测量ECAR和OCR，然后依次用电子链链抑制剂1μM寡霉素，1.5μMFCCP-氰化物对-三溴甲氧基苯基-，1μM抗霉素A和鱼藤酮依次处理细胞（Seahorse XF Cell Mito Stress Test kit，安捷伦，目录号103015–100）。在检查通过LPS实时诱导ECAR的实验中，如上所述分离并接种了细胞，但是在对ECAR进行基础测量后，用LPS（100 ng / ml）攻击细胞，并测量ECAR 180分钟。数据代表来自至少三只独立小鼠的一式三份孔的平均值±SEM。
还分别根据制造商，通过琥珀酸比色测定试剂盒（Biovision，目录号K649）和乳酸-Glo测定法（Promega，目录号J5021）测定了LPS处理的WT和STAT3 SA腹膜巨噬细胞培养的上清液的琥珀酸和乳酸代谢产物浓度。指示。
腹膜内注射10 mg / kg的总体积为100μl的LPS（大肠杆菌 055：B5超纯； Invivogen）后，在雄性和雌性WT和STAT3 SA小鼠（6-14周龄）中诱发败血症。90分钟后将小鼠剔除，并通过心脏穿刺收集血清以测量血清细胞因子。
对于每个实验，使用GraphPad 8.01软件使用图例中所示的特定统计测试进行统计分析。数据表示为平均值±平均值的标准误差，如图中的图例所示，其中包括生物学和实验重复。在图上用星号表示的重要性如下：* p <0.05，** p <0.01和*** p <0.001。
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