中国药典细菌内毒素检查法学习与讨论

中国药典细菌内毒素检查法学习与讨论

本法系利用从鲎的变形细胞中提取的试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的含量是否符合规定的一种方法。

细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。

细菌内毒素的量用内毒素单位（EU/）表示。

细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。

细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及设置的各种阳性对照。

细菌内毒素检查用水系指与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37℃±1℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。细菌内毒素定量测定用的检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。

试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250℃干烤至少1小时，也可用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标示为无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。

供试品溶液的制备   某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的PH值在6.0—8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲剂调节PH值。酸或碱溶液须用检查用水在已去除内毒素的容器中进行配制。缓冲剂必须经过验证不含内毒素和干扰因子。

内毒素限值的建立   药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：

L=K/M

式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U活性单位表示，注射剂K=5E U/(kg·h)，放射性药品注射剂K=2.5 EU/(kg·h)，鞘内用注射剂K=0.2 EU/(kg·h)；

M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml(kg·h)、mg (kg·h)或U活性单位/ (kg·h)表示，人均体重按60kg计算，注射时间若不足1小时按1小时计算。

确定最大有效稀释倍数（MVD）是指供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在此稀释倍数下可进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD：

MVD=CL/λ

式中L为供试品的细菌内毒素限值：

C为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则C等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U活性单位表示时，C的单位需为mg/ml或U活性单位/ml；

λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。

方法1   凝胶法

凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或定量检测内毒素的方法。在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。

鲎试剂灵敏度复核试验   当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2.0λ、1.0λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取含有分装了0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支,其中16管加入0.1ml内毒素标准溶液,每一个浓度平行做4支;另外两管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃适宜恒温器中，保温60分钟±2分钟。

将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（-）。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。

若最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc).

λc =1g^-1(∑X/4)

式中X为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。

当λc在0.5λ—2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。

干扰试验   按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

只有当A和D的所有平行管都为阴性，并且C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。

Es= 1g^-1(∑Xs/4)

Et= 1g^-1(∑Xt/4)

式中Es和Et分别为溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（1g）。

当Es在0.5λ—2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)时，且当Et在0.5Es—2.0Es (包括0.5λ和2.0λ)时，则认为供试品在该浓度下无干扰作用，如果供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。

表1   凝胶法干扰试验溶液的制备

注：A 供试品溶液；B干扰试验系列；C鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D阴性对照。

使用更高灵敏度的鲎试剂并对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。

当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。

当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。

检查法

1）凝胶限量试验

按表2制备溶液A、B、C、D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

表2   凝胶限量试验溶液的制备

注：A供试品溶液；B供试品阳性对照；C阳性对照；D阴性对照。

结果判断   保温60分钟后观察结果。若阴性对照溶液D的平行管为阴性，供试品阳性对照B的所有平行管为阳性，阳性对照溶液C的平行管都为阳性，试验有效。

若溶液A的两个平行管都为阴性，判供试品符合规定；若溶液A的两个平行客都为阳性，判供试品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性另一管为阴性，需进行复试。复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管都为阳性，判供试品符合规定。

2）凝胶半定量试验

本方法系通过确定终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。依表3制备溶液A、B、C和D。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

结果判断   保温60分钟±2分钟后观察结果。若阴性对照溶液D的所有平行管为阴性，供试品阳性对照B的所有平行管为阳性，溶液C的终点浓度的几何平均值在0.5λ—2λ之间，试验有效。

溶液A中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ，为每个系列的终点浓度，所有平行管终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度（按“灵敏度的复核”中的公式）。如果试验的是供试品的稀释液，则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘上稀释倍数。

如试验中供试品溶液的结果都为阴性，应记为内毒素浓度小于λ（如果检验的是稀释过的供试品，则记录为小于λ乘以该供试品的最低稀释倍数）。如果结果都为阳性，应记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。

若内毒素浓度小于规定的限值，判供试品符合规定。若内毒素浓度大于规定的限值，判供试品不符合规定。

表3   凝胶半定量试验溶液的制备

注：A：没有超过MVD并且通过干扰试验的供试品溶液。用检查用水进行2倍系列稀释，从通过干扰试验的稀释倍数开始再稀释至1倍、2倍、4倍和8倍，但随后的稀释也不得超过MVD；

B：含2λ浓度标准内毒素的溶液A（供试品阳性对照）；

C：含2λ、1λ、0.5λ、0.25λ浓度标准内毒素的检查用水系列；

D：阴性对照。

方法2 光度测定法

光度测定法分为浊度法和显色基质法。

浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中浊度变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，可以分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据反映混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度（吸光度和透光率）之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。

显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特殊底物显色释放出的有色团的多少而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，分为终点显色法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的有色团的量之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法是检测反应混合物的色度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测色度增长速度的方法。

光度测定试验应在特定的仪器中进行，温度一般为37℃±1℃。

为保证浊度和显色试验的有效性，应预先进行标准曲线的可靠性试验以及供试品溶液的干扰试验。当试验环境中发生了任何可能影响检测结果的改变时，试验的有效性应重新检测。

标准曲线的可靠性试验

标准曲线的制备   用标准内毒素配成溶液并制成至少3个浓度的稀释液（稀释度不得大于10），最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。每一稀释步骤的混匀时间同凝胶法，每一浓度至少做3支平行管。同时要求做2支阴性对照。当阴性对照在设定的时间内不发生反应，将全部数据进行线性回归分析。

根据线性回归分析，标准曲线的相关系数（r）的绝对值应该大于或等于0.980，试验方有效。否则须重新试验。

干扰试验

选择标准线中点或一个靠近中点的内毒素浓度。按表4制备溶液A、B、C和D。供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等，参照所用仪器和试剂的有关说明进行。每种溶液至少做2个平行管。

表4   光度测定法干扰试验的制备

注   A：稀释倍数未超过MVD的供试品溶液。

    B：加入标准曲线中点或靠近中点的一个已知内毒素浓度的，且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液。

    C：如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的，用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。

    D：阴性对照。

按所得线性回归方程分别计算供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量Ct和Cs，再按下式计算该试验条件下的回收率（R）。

R=(C_S-C_t)/λm×100%

当内毒素的回收率在50%~200%之间，则认为在此该试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。

当内毒素的回收率不在指定的范围时，须按“凝胶法干扰试验”中的方法去除干扰因素。并要重复干扰试验来验证处理的有效性。

检查法

按“光度法的干扰试验”中的操作步骤进行检测。

使用溶液C生成的标准曲线来计算溶液A的每一平行管的内毒素浓度。

试验必须符合以下三个条件方为有效：

（1）系列溶液C的结果要符合“光度技术预试验”下“标准曲线的可靠性试验”中的要求。

（2）用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后，计算出的内毒素的回收率要在50%~200%的范围内。

（3）溶液D（阴性对照）在规定的反应时间内未检测出内毒素。

若供试品溶液所在平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数和浓度后，小于规定的内毒素限值，判供试品符合规定。若大于规定的内毒素限值，判供试品不符合规定。

（注：本检查法中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微孔板中的孔。）