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分子克隆常用技术

发表时间:2019-07-17 14:06作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com

分子克隆常用技术


一、核酸的纯化

  在分子克隆的所有操作中,最基本的操作是核酸的纯化。其关键步骤是去蛋白质,通常只要用酚/氯仿。氯仿抽提核酸的溶液即可。每当需要把克隆有某一些所用的酶灭活或去除以便进行下一步时,可进行这种抽提。然而,如要从细胞裂解液等复杂的分子混合物中纯化核酸,则要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后,再用有机溶剂抽提。这些广谱的蛋白酶包括链霉蛋白酶及蛋白酶K等,它们对多种天然蛋白均有活性,(1)用酚氯仿抽提:这两种有机溶剂合用,比单独用酚抽提的除蛋白效果更佳。继而用氯仿抽提则可除去核酸制品中的痕量酚。①核酸样品置有盖小离心管中,加入等体积的酚/氯仿。②旋涡混匀管内容物,使呈乳状。③12000×g室温离心15秒。④水相移入另一离心管,弃去两相界面和有机相。⑤重复步骤①-④步操作,直至两相界面上见不到蛋白质为止⑦按下述核酸浓缩法沉淀回收核酸。

二、核酸的浓缩

  应用最广的核酸浓缩法是乙醇沉淀法。在中等浓度单价阳离子存在下,加入一定量的乙醇后,所形成有核酸沉淀可经离心而回收,甚至对低至pg量的DNA或RNA,也可定量回收。回收的核酸可按所需浓度,再溶于适当的缓冲液中。
  具体操作时,可向含样品的小离心管中加入
V/10单价阳离子盐贮存液2V无水乙醇,混匀,放冰水浴中15-30min,取出目测平衡,0-4度,12000g,离心10min。吸弃上清,再另70%乙醇0.5-1ml,12000g,0-4度洗涤离心2min。吸弃上清,沉淀用油泵抽干或打开盖子晾干后,溶于适当体积的缓冲液中。

单价阳离子盐溶液


贮存液(mol/L)

终浓度(mol/L)

(醋酸铵*

7.5

2.0-2.5

LiCl

8.0

0.8

NaCl

2.0

0.2

醋酸钠

3.0(pH5.2)

0.3

*:当加醋酸铵时,需加入DNA液的V/2

单价阳离子盐的选择,主要基于下述考虑:用醋酸铵可减少dNTP的共沉淀,但在以后要作核酸的磷酸化时应避免用醋酸铵,因铵离子是T,多核苷酸激酶的强烈抑制剂。当用较高浓度的乙醇沉淀RNA时,常用LiCl,因LiCl在乙醇中溶解度很高,不随核酸共沉淀。含有SDS的核酸样品,应使用NaCl,这时该去垢剂要70%乙醇中仍保持可溶。DNA和RNA沉淀,大多使用醋酸钠(pH5.2 )。

三、DNA、RNA的定量

  准确的方法是紫外分光光度法。但本法要求核酸样品是纯净的(即无显著的蛋白质、酚、琼脂糖或其它核酸、核苷酸等污染物的制品)。用紫外分光光度计测定260nm和280nm两个波长处的光吸收,然后,按IA260相当于50μg/ml双链DNA。40μg/ml单链DNA或RNA及20μg/ml单链寡核苷酸。计算你的样品含量。260nm280nm两处读数的比值(A260/A280),可反映核酸的纯度。DNA和RNA纯品的A260/A280的值分别为1.8和2.0如果样品中有蛋白质或酚的污染,则A260/A280将明显低于此值,此时就无法对样品中的核酸进行精确定量。可将样品纯化后再作定量测定。有丰富实验室经验的人,仅凭样品电泳后溴化乙锭染色萤光带的强度,即可大致判断出样品中的核酸含量,故他们常不作核酸的紫外分光光度法定量。

四、核酸的凝胶电泳和分子量参照物

(一)琼脂糖凝胶电泳
  可用于分离、鉴定和提纯DNA片段。本法操作简单、迅速,能分辨其它方法不能分开的DNA片段混合物,分开的DNA可用低浓度的萤光染料(0.5μg/ml溴化乙锭)染色,在紫外灯下直接观察检测少至1ng的DNA。
DNA通过琼脂糖凝胶的迁移率取决于以下参数:①DNA分子的大小:线奖双链DNA分子通过凝胶的速率与其分子量的常用对数成反比
。据此用已知分子量的标准物质和待测分子量的DNA片段同时电泳,比较其电泳速率,即可求出待测片段的分子大小。②琼脂糖浓度:给定大小的DNA片段,以不同速度通过不同浓度的琼脂扩凝胶。因此利用不同浓度的凝胶,可分辨范围广泛,大小不同的DNA片段

不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围

浓度<%(w/v

分离线状DNA分子的有关范围(Kb)

0.3

5-60

0.6

1-20

0.7

0.8-10

0.9

0.5-7

1.2

0.4-6

1.5

0.2-3

2.0

0.1-2

 

③DNA构型:相同分子量的闭环(Ⅰ型),开环(Ⅱ型)和线状(Ⅲ型)DNA,以不同速率通过凝胶,一般情况下,迁移率Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型。④应用的电压:在低电压时,线状DNA片段的迁移率与所用电压成正比。但是压增高时,大分子量DNA片段迁移率的增大是不同的,因此琼脂糖凝胶的有效分离范围随电压增大而减小。为了获得DNA片段的最大分辨力,凝胶电泳时电压不应超过5V/cm

(二)聚丙烯酰胺凝胶电泳
  可用于分析和制备小于1Kb长度的DNA片段

DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围

丙烯酰胺浓度<%(w/v)>

有效分离范围(bp

3.5

100-1000

5.0

80-500

8.0

60-400

12.0

40-200

20.0

10-100

聚丙烯胺凝胶多用垂直平板电泳,准备凝胶时,先配制30%单体母液(29克丙烯酰胺,1克双丙烯酰胺,加水溶解,定容至100ml),再用它来配制所需浓度的凝胶。每100ml上述液体加30μl四甲基乙胺(TEMED),混匀后即可灌注于予先准备好的洁净不渗漏的凝胶玻板,待凝胶灌至近顶端时,立即插入合适的“梳子”,放室温聚合60分钟,若冬天室温太低,则可放37度温温箱内,以促进聚合。聚合完成后,拔出“梳子”,将凝胶板固定于电泳槽中,向电泳槽倾入1×TBE,用滴管冲洗加样孔和凝胶底部以除去气泡,即可加样电泳。一般所用电压1-8v/cm,随时观察标记染米的迁移。在溶于1×TBE的聚丙烯酰胺中,标记染料迁移速率与下述DNA片段的速率相同

标记染料在PAG中的迁移*

凝胶浓度(%)

溴酚蓝

二甲苯腈蓝

3.5

100

460

5.0

65

260

8.0

45

160

12.0

20

70

20.0

12

45

*这些数字是与染料共同迁移的DNA片段的近似大小(以bp计)。电泳结束,从电槽中取出玻板并小心地撬开,凝胶浸于溴化乙锭液(0.5μg/ml1×TBE)染色,45min后放紫外灯下观察电泳结果。

(三)分子量参照物
  为了判断目的DNA片段的大小,常在同一凝胶的目的DNA旁加一分子量参照物,同时电泳并染色后,就能在紫外灯下很快知道目的片段的大小。最常用的分子量参照物是 Hind Ⅲ消化物,各片段的大小以bp表示,分别为:23130,9416,6557,4361,2322,2027,564,125。


文章分类: 分子技术资料
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