在许多人类癌症中，包括肝细胞癌（HCC），高密度浸润性肿瘤相关巨噬细胞（TAM）与不良预后相关。大多数TAM表达M2表型，随后支持肿瘤生长。肿瘤细胞如何将这些TAM极化为促肿瘤M2表型仍知之甚少。我们以前的研究表明，肝癌衍生因子触发的Toll样受体2（TLR2）依赖性自噬下调NF-κBp65并驱动M2巨噬细胞分化。但是，潜在的机制和潜在的肝癌来源的TLR2配体尚不清楚。在这里，我们提供的证据表明，NADPH氧化酶2（NOX2）依赖性活性氧（ROS）的生成对于HCC诱导的自噬，NF-κBp65下调和初级巨噬细胞的M2表型极化至关重要。这种NOX2产生的ROS产生在TLR2缺陷型巨噬细胞中被消除。HCC衍生或重组的高迁移率族盒1（HMGB1）能够触发这种TLR2介导的M2巨噬细胞极化。抑制剂，丙酮酸乙酯和N-乙酰基半胱氨酸酰胺分别阻断HMGB1和ROS，可显着降低荷瘤小鼠M2巨噬细胞积累和肝结节形成。我们的发现揭示了HMGB1 / TLR2 / NOX2 /自噬轴可触发HCC中的M2巨噬细胞极化，可将其视为治疗HCC的新型治疗靶标。分别显着降低了携带HCC的小鼠中M2巨噬细胞的积累和肝结节的形成。我们的发现揭示了HMGB1 / TLR2 / NOX2 /自噬轴可触发HCC中的M2巨噬细胞极化，可将其视为治疗HCC的新型治疗靶标。分别显着降低了携带HCC的小鼠中M2巨噬细胞的积累和肝结节的形成。我们的发现揭示了HMGB1 / TLR2 / NOX2 /自噬轴可触发HCC中的M2巨噬细胞极化，可将其视为治疗HCC的新型治疗靶标。
已经发现白细胞亚群在肿瘤内积累。一个重要的人群是肿瘤相关的巨噬细胞（TAM），尽管免疫学家认为TAM的存在是宿主对生长中的肿瘤的免疫反应的证据，但许多研究表明这些TAM可以促进肿瘤的进展1。因此，在人类癌症，例如肝细胞癌（HCC）中，高密度的TAM浸润与不良预后2相关。这些观察结果提出了在肿瘤治疗的治疗策略中靶向TAM的可能性。
根据它们的基因和蛋白质谱，TAM被分为经典（M1）和另类（M2）巨噬细胞。M1巨噬细胞通常表达促炎性细胞因子（例如IFN-β，IL-12，TNF，IL-6和IL-1β）和II类MHC分子，并具有治疗益处，促进抗肿瘤活性3。另一方面，M2表型巨噬细胞显示高 IL-10 ，低 IL-12 ，精氨酸酶-1 高，甘露糖受体（CD206）高，清道夫受体（CD204）高，MHC-II 低，从而诱导了免疫抑制性肿瘤环境，因此促进肿瘤进展4。已经提出，肿瘤细胞可以分泌趋化因子以将循环单核细胞主动吸引到肿瘤部位。那些募集的单核细胞将在肿瘤微环境中分化为免疫抑制性TAM。然而，尚未完全了解巨噬细胞如何在肿瘤微环境中分化为M2型TAM。在我们之前的研究中，我们证明了肝细胞源性因子能够通过收费样受体（TLR）2信号触发M2巨噬细胞极化。发现该TLR2信号通路通过p62介导的选择性自噬5下调NF-κBp65（一种M1促进转录因子）5。然而，潜在的机制和潜在的肝癌来源的TLR2配体仍然需要澄清。
NADPH氧化酶（NOX）是一种膜结合酶，由五个亚基蛋白组成，包括gp91 phox，p22 phox， p47 phox，p67 phox和Rac。它在吞噬细胞（也称为NOX2）中广泛表达，产生活性氧（ROS），通过调节炎症小体，自噬和1型干扰素信号传导6来抵抗入侵的病原体。除了抵御病原体，NOX已经显示参与肿瘤相关的免疫细胞极化和分化，包括髓源抑制细胞和TAM 7，8，9。据报道，在IL-4和M-CSF刺激后，NOX生成的ROS或NOX本身可调节M2巨噬细胞极化。NOX-产生ROS或NOX不足的堵塞抑制巨噬细胞M2极化和肺癌生长在小鼠模型8，9。但是，尚不清楚NOX衍生的ROS在肝癌诱导的M2巨噬细胞极化中的作用。
高迁移率族盒1（HMGB1）是高迁移率族蛋白家族的成员，最初被表征为非组蛋白，核DNA结合蛋白10。但是，HMGB1能够转位至细胞质，因此响应各种刺激而从细胞分泌。分泌的HMGB1将由几个损伤相关的分子模式（DAMP）受体，包括TLR2，TLR4，TLR9，和用于高级糖化终产物（RAGE），以触发炎症，组织修复和巨噬细胞极化受体进一步认识11，12。在HCC患者中发现高水平的HMGB1与疾病严重程度相关13。
在这项研究中，我们显示肝癌来源的HMGB1通过TLR2 / NOX2轴刺激ROS，从而触发自噬调节的M2巨噬细胞极化。ROS和HMGB1的阻滞减少了肝癌中M2巨噬细胞的积累，并减弱了小鼠肝癌的生长。这些结果表明，源自肝癌的HMGB1能够调节TAM极化，并可作为肝癌治疗的治疗靶标。
我们以前曾报道过，小鼠肝细胞系ML-1 4a的肝细胞源性因子会触发自噬介导的M2巨噬细胞极化5。在这里，我们进一步研究了调节这种自噬介导的M2巨噬细胞极化的机制。已经表明，ROS参与自噬形成，并且在IL-4 / M-CSF触发的M2极化中起重要作用8。因此，我们试图研究ROS在肝癌细胞ML-1 4a条件培养基（MCM）触发的M2极化中的作用。根据此处获得的数据，我们能够检测出经过MCM处理的BMDM中的ROS生成（图 1）。一个）。由ROS清除剂的抑制，N-乙酰半胱氨酸酰胺（NAC），MCM-诱导的IL-10产生和CD206上调（图降低 1 b）中。此外，抑制ROS的由NAC也抑制MCM-LC3触发II积累和NF-κB的p65降解，自噬体在MCM-极化巨噬细胞货物5，或P62（图 1C）。这些结果表明，ROS的产生与肝癌触发的自噬和M2巨噬细胞极化有关。NOX2是一种膜相关酶，是巨噬细胞中ROS的主要产生者。接下来，我们检查了NOX2是否参与MCM处理的BMDM中的ROS生成。Gp91 phox是NOX2 复合物的重要组成部分，可支持ROS的产生。因此，野生型（WT）和gp91phox // BMDM用于MCM治疗，以确定ROS的产生。与WT细胞相比，在gp91 phox // BMDM中，MCM诱导的ROS生成显着降低（图 1 d）。此外，减少的IL-10的生产在MCM-处理亚基gp91发现/ - - PHOX与WT细胞相比的BMDM（图 1 e）所示。有趣的是，LC3斑点和LC3-II的累积由MCM诱导也是废除亚基gp91 PHOX - / -的BMDM与WT细胞（图相比 1个 F，G）。此外，与WT细胞相比，在MCM处理的gp91 phox-/- BMDM中，NF-κBp65和p62的下调均得以恢复（图 1）。G）。这些数据表明依赖NOX2的ROS生成调节肝癌诱导的自噬和M2巨噬细胞极化。
NOX2产生的ROS负责肝癌诱导的自噬和M2巨噬细胞极化。（a）将BMDMs在有或没有N-乙酰基半胱氨酸（NAC，10mM）的条件下预处理30分钟，然后与MCM一起温育另外24小时。通过流式细胞术分析ROS诱导。（b）将BMDMs在有或没有N-乙酰基半胱氨酸（NAC，10 mM）的条件下预处理30分钟，然后再与MCM一起孵育24小时。然后收集上清液和细胞裂解物，分别通过ELISA确定IL-10表达和通过流式细胞术确定CD206表达。（c）在存在或不存在NAC（1、5或10 mM）的情况下，用MCM处理BMDM 24小时。收集细胞裂解物，以确定NF-的表达κ通过Western印迹检测p65，LC3-I / II和p62。（d）用MCM处理野生型（WT）或gp91 -/- BMDMs在指定的时间，并通过流式细胞术确定ROS的产生。（e）用MCM处理WT或gp91 -/- BMDM 24小时，并收集上清液以通过ELISA分析IL-10的产生。（f）MCM诱导依赖NOX2的自噬。WT或gp91 -/- BMDMs用MCM处理12小时，并通过共聚焦显微镜观察并定量LC3点。（g）WT或gp91 -/-BMDM用MCM处理指定的时间。然后收集其细胞裂解物，通过蛋白质印迹法确定NF-κBp65，LC3-I / II和p62的表达。* p <0.05；** p <0.001；*** p ＜0.0001。
我们以前的发现表明，TLR2信号在促进MCM驱动的M2巨噬细胞极化中起着重要作用。因此，我们接下来检查了NOX2依赖性ROS生成是否需要TLR2信号。在这里，我们表明，SOCS3，CD204和CD206的表达减少，而NF-κBp65的水平是在MCM-处理救出TLR2 - / -的BMDM相比于WT或TLR4 - / -细胞（图 2的a，b） 。这些结果证实了TLR2在MCM驱动的M2巨噬细胞极化中至关重要。接下来，我们监测了MCM处理的WT，TLR2- /和TLR4 -/- BMDM中的ROS生成。MCM刺激了WT和TLR4 -/- BMDM中高水平的ROS产生，而在TLR2 -/-中被抵消了。细胞（图 2 c），表明MCM通过TLR2受体触发了ROS的产生。为了进一步检查TLR2信号是否能够触发依赖NOX2的ROS生成，使用了一种特定的TLR2激动剂Pam3CSK4。我们的结果表明，Pam3CSK4诱导MCM处理的WT BMDM中ROS，CD204，CD206和IL-10的水平升高，并且在TLR2 -/- BMDM中或在存在NAC 时减弱（图 3 a–c）。这些结果表明，Pam3CSK4能够刺激ROS的产生并促进M2巨噬细胞的极化。为了阐明Pam3CSK4是否通过依赖NOX2的ROS促进M2巨噬细胞，用Pam3CSK4处理了gp91 phox-/-BMDM。在Pam3CSK4刺激的gp91中，ROS的产生显着减少phox // BMDM与WT细胞相比（图 3 d）。此外，NF-κBp65的表达被恢复，而在没有检测到增加LC3 II积累PAM3CSK4刺激亚基gp91 PHOX - / -的BMDM与WT细胞相比（图 3 E）。这些结果表明TLR2信号通过依赖NOX2的自噬促进M2巨噬细胞极化。
TLR2对于MCM诱导的ROS和M2巨噬细胞极化至关重要。（a）收集来自WT，TLR2- /和TLR4 -/-小鼠的BMDM，并用MCM处理24小时。收集所有细胞裂解物以通过蛋白质印迹法测定NF-κBp65和SOCS3。（b）用MCM处理来自WT，TLR2- /和TLR4 -/-小鼠的BMDM 24小时，以通过流式细胞术确定CD204和CD206的表达。（c）将WT，TLR2- /或TLR4 -/- BMDM用MCM处理12小时。通过流式细胞术分析这些细胞的ROS产生。*** p ＜0.0001。
Pam3CSK4激活TLR2信号会触发NOX2依赖性ROS的产生。（a）WT或TLR2 -/-BMDMs在有或没有Pam3CSK4（5μg/ ml）的情况下处理指定的时间，并且通过流式细胞术测量ROS的产生。（b）在存在或不存在NAC（5、10、15和20 mM）的情况下，用Pam3CSK4（5μg/ ml）处理BMDM 24小时，并通过流式细胞术分析这些细胞上CD204和CD206的表达。（c）在存在或不存在NAC（10mM）的情况下，用Pam3CSK4（5μg/ ml）处理WT或TLR2 -/- BMDM 24小时，并通过ELISA测量IL-10的产生。（d）WT或gp91 -/-在有或没有Pam3CSK4（5μg/ ml）的情况下，将BMDM处理指定的时间，并通过流式细胞仪测量ROS的产生。（e）将WT或gp91 -/- BMDMs在有或没有Pam3CSK4（5μg/ ml）的情况下处理了指定的时间。然后收集其细胞裂解物，通过蛋白质印迹法确定NF-κBp65和LC3-I / II的表达。* p <0.05；** p <0.001；*** p ＜0.0001。
接下来，我们进一步研究了HCC细胞如何通过TLR2信号极化M2巨噬细胞。HMGB1是能够激活TLR2信令和具有促进巨噬细胞M2极化的强效能力14，15。另外，据报道HMGB1是HCC 16的致病因子，与非恶性小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）细胞相比，ML-1 4a细胞上调了HMGB1 （补充图S1a），并在MCM中发现了HMGB1（补充图）。 。S1和图 4的A）。此外，与MCM相比，MEFCM降低了BMDM诱导的CD204和CD206的水平（补充图S1）。b）。因此，我们检查了肝细胞源性HMGB1是否促进MCM触发的M2巨噬细胞极化。为了测试这一点，我们首先建立HMGB1沉默ML-1 4a中的细胞，并收集所述低HMGB1条件培养基（图 4的A）。然后将BMDM用来自shLuc-或shHMGB1-ML-1 4a细胞的MCM处理以监测M2巨噬细胞极化。结果如图 4b，c所示，与HMGB1 高 MCM 相比，HMGB1 低 MCM处理的BMDM 均抑制了MCM诱导的ROS，CD206，精氨酸酶-1和LC3-II的上调水平。处理的细胞。此外，NF-κBp65表达的降低也得以恢复（图 4）。d）。与这些发现一致，在存在中和性抗氧化剂的情况下，恢复了MCM刺激的ROS，IL-10，CD204，CD206，精氨酸酶-1和LC3-II的上调以及NF-κBp65的降低。 -HMGB1抗体与同型抗体处理的BMDM相比（图 4 e-g）。这些结果表明肝细胞源性可溶性HMGB1的阻断抑制了MCM触发的M2巨噬细胞极化。为了进一步确认HMGB1对M2巨噬细胞极化的调节活性，用小鼠重组HMGB1（rHMGB1）刺激BMDM。我们发现在rHMGB1处理的BMDM中诱导了NF-κBp65的降解和LC3-II的积累（图 5）一个）。另外，在治疗rHMGB1的触发产生活性氧，CD204，CD206，精氨酸酶1和SOCS3在WT的BMDM，将其全部在TLR2减毒的- / -的BMDM（图 5的B-d）。这些结果表明，肝癌来源的HMGB1可能通过TLR2受体促进ROS介导的M2巨噬细胞极化。
肝细胞源性HMGB1有助于诱导M2巨噬细胞极化。（a）收集来自shLuc或shHMGB1 ML-1 4a细胞的细胞裂解液和条件培养基，并通过蛋白质印迹法确定HMGB1的表达。（b）将BMDMs用对照或HMGB1低的MCM处理24小时，并通过流式细胞术确定ROS的产生。（c）将BMDMs用对照或低HMGB1的MCM处理24小时，并通过流式细胞术确定CD206的表达。（d）将BMDMs用对照或低HMGB1的MCM处理指定的时间，并收集它们的细胞裂解物以通过蛋白质印迹法确定NF-κBp65，Arg-1和LC3-I / II的表达。（e）在同种型或抗HMGB1抗体存在的情况下，用MCM处理BMDM 24小时。通过流式细胞仪分析ROS的产生。（f）在同种型或抗HMGB1抗体存在下，用MCM处理BMDM 24小时，以通过ELISA确定IL-10的产生，通过流式细胞术确定CD204或CD206的产生。（g）将BMDMs在同种型或抗HMGB1抗体存在下用MCM处理24小时，并收集它们的细胞裂解物以通过蛋白质印迹法确定NF-κBp65，Arg-1和LC3-I / II的表达。* p <0.05；** <0.001；*** p ＜0.0001。
重组HMGB1通过TLR2触发自噬和M2巨噬细胞极化。（a）将BMDMs用各种浓度的重组HMGB1（rHMGB-1）处理24小时，并收集它们的细胞裂解物以通过蛋白质印迹分析NF-κBp65和LC3-I / II的表达。（b）WT或TLR2 -/- BMDMs用r-HMGB1（10μg/ ml）处理24小时，并通过流式细胞仪分析ROS的产生。（c）用r-HMGB1（10μg/ ml）处理WT或TLR2 -/- BMDM 24小时，并通过流式细胞术分析其表面CD204和CD206。（d）WT或TLR2 -/-BMDMs用rHMGB1（10μg/ ml）处理24 h，并收集其细胞裂解物，通过Western印迹法测定SOCS3和Arg-1的表达。** p <0.001；*** p ＜0.0001。
然后，我们进一步研究了肝癌衍生的HMGB1在荷瘤小鼠中的调控作用。为了了解HMGB1是否可能对肝癌细胞的生长具有内在影响，我们首先在体外监测了shLuc-和shHMGB1-ML-1 4a细胞的细胞生长。结果表明：在shLuc-和shHMGB1-ML-1之间的细胞生长没有差异显著4A在体外（图细胞 6 a）中。然后，我们使用了小鼠原位肝癌模型，该模型是通过向小鼠脾内注射10 6shLuc-或shHMGB1-ML-1 4a细胞建立的，以检查HMGB1对肝癌生长的外在作用。有趣的是，shHMGB1-ML-1 4a中肿瘤结节的大小和数量显着减少荷瘤小鼠shLuc对照组（图相比 6 b）中。通过Ki67的免疫荧光染色测定，Ki67蛋白在shLuc肿瘤中的表达水平比shHMGB1肿瘤高得多，表明HMGB1的丧失减少了在体内（图肝癌增殖 6 c）所示。此外，我们在shLuc-和shHMGB1- ML-1 4a组织中检测到CD206表达的细胞。与非肿瘤组织相比，在shLuc-ML-1 4a组织中清楚地观察到CD206 +细胞增加，表明M2巨噬细胞在肝癌中积累。然而，与shLuc组相比，发现shHMGB1肝癌组织中CD206 +细胞显着减少（图 6）。d）。这表明肝癌来源的HMGB1促进了荷瘤小鼠的肿瘤相关M2巨噬细胞积累和肿瘤生长。接下来，我们测试了HMGB1，ROS或两者均受阻是否能够减少小鼠肝结节的形成。为了检验这一点，HMGB1抑制剂，丙酮酸乙酯（EP），和ROS，NAC的抑制剂，单独或一起施用给肝癌轴承小鼠（图 6 E）。根据图6的结果 e，与PBS处理的对照组相比，单独使用EP或NAC可以减少荷瘤小鼠肝结节的形成。值得注意的是，EP和NAC的联合治疗显示出在数量上和在肝癌携带小鼠肝脏结节尺寸最显著减少与PBS，EP或NAC单一治疗组（图相比 6 F）。综合这些结果，我们已经证明肝癌衍生的HMGB1促进M2巨噬细胞募集和肿瘤生长，而HMGB1和ROS的阻滞抑制小鼠肝癌的生长。
HMGB1和ROS的阻滞减少了与肿瘤相关的M2巨噬细胞的数量，并减弱了小鼠肝癌的生长。（a）监测shLuc和shHMGB1 ML-1 4a细胞的细胞生长72小时。（b，c）将shLuc或shHMGB1 ML-1 4a细胞脾内注射给BALB / c小鼠（n = 5）。注射后28天后，处死所有小鼠，并切除肝脏以量化结节的数量和大小（b）。这些肝脏的部分也被切片以用Ki67或抗CD206抗体染色（c，d）。（e，f）治疗方案示意图。将8至10周龄的BALB / c小鼠（n = 5）脾内接种ML-1 4a细胞以建立肝结节形成。从肿瘤注射后第7天开始，以两天间隔向小鼠腹膜内给予NAC（150mg / kg）。从肿瘤注射后第7天开始，以7天间隔向小鼠腹膜内给予EP（80mg / kg）。肿瘤注射后第28天，处死所有小鼠，并切除其肝脏以量化结节的数量和大小（e）。从3个独立实验中量化结果。* p <0.05；** <0.001；*** p ＜0.0001。
在这项研究中，我们调查了肝癌细胞自噬调节M2巨噬细胞极化的机制。肝癌衍生的HMGB1通过TLR2刺激NOX2依赖的ROS生成，以触发自噬形成，从而导致NF-κBp65的溶酶体降解，从而维持M2巨噬细胞极化。ROS和HMGB1的阻滞能够减少肿瘤相关M2巨噬细胞的积累并减弱小鼠肝癌的生长。在这里，我们发现了由HMGB1触发的TLR2 / NOX2 /自噬轴在肝癌引起的M2巨噬细胞极化中的新调控机制（图 7）。
HMGB1诱导的M2巨噬细胞极化示意图。
据报道，NOX衍生的ROS产生可控制M1 / M2巨噬细胞极化，从而调节炎症，感染和肿瘤的生长。据信M1巨噬细胞中活性氧的增加会增强吞噬活性并触发促炎反应，这在防御细菌入侵方面是有益的17。有趣的是，新兴的研究已经表明，该NOX-产生ROS还负责巨噬细胞M2极化，特别是在肿瘤微8，18。NOX1 / NOX2缺乏症小鼠显示TAM中的ROS生成减少和M2分化受损，从而导致肿瘤生长受到抑制。建议在NOX1 / NOX2缺乏的巨噬细胞中使JNK和ERK失活来介导这种改变9。迄今为止尚不清楚NOX产生的ROS和JNK / ERK如何促进M2巨噬细胞极化。在这里，我们发现依赖NOX2的ROS能够触发自噬以下调NF-κBp65，从而促进肝癌诱导的M2巨噬细胞分化。此外，我们之前已经证明，肝癌极化的M2巨噬细胞中NF-κBp65的溶酶体降解需要ERK激活5。根据这些观察结果，我们建议NOX产生的ROS部分通过上调自噬和溶酶体活性来调节M2巨噬细胞极化。此外，为了了解NOX1参与MCM诱导的M2巨噬细胞极化，使用了NOX1特异性抑制剂ML171。根据我们的结果，ML171减弱了BMDM上MCM诱导的ROS产生，CD204和CD206。这表明NOX1和NOX2对MCM诱导的M2巨噬细胞极化均至关重要（补充图S2）。将来，应使用遗传性NOX1缺陷型巨噬细胞来确认NOX1在这种现象中的作用。另一方面，最近的一项研究表明，线粒体ROS（mtROS）的诱导触发功能性M2巨噬细胞极化，以保护肠道炎症19。mtROS被称为自噬的诱导剂20，因此mtROS在肝癌促进的M2巨噬细胞极化中的作用需要进一步研究。较早的研究表明，在肿瘤微环境中募集的TAM可能来自组织中的巨噬细胞和BMDM 21。检查是否募集了肝枯否细胞并在ML-1 4a中表达M2-表型对于肿瘤，我们将CLEC4F与肿瘤区域CD206 共染色，CLEC4F被认为是小鼠Kupffer细胞22的标志物。根据补充图S3中显示的结果，在肿瘤和非肿瘤区域均发现CLEC4F + Kupffer细胞。但是，这些CLEC4F + Kupffer细胞不表达CD206。该结果表明肝库普弗细胞可能不响应ML-1 4a触发的M2巨噬细胞极化。
HMGB1在肝癌中的功能由于其细胞内和细胞外位置的不同而变得复杂。细胞内HMGB1已显示可控制HCC 23的细胞周期，存活，增殖和分化。HMGB1的翻译后修饰，包括乙酰化和氧化还原修饰，能够触发HMGB1 24的不同生物活性。据报道，HMGB1的乙酰化有助于HMGB1离开细胞核进入细胞质，在那里它可以被包装成专门的分泌囊泡，然后释放到细胞外环境25。发现分泌的HMGB1在三个半胱氨酸残基（在23、45和106位）的氧化还原修饰可调节其受体结合24。HMGB1是从细胞分泌出来的一种DAMP。作为危险信号分子，分泌的HMGB1将触发外向内的信号级联反应，通过与几个已确定的膜受体结合26来调节炎症，细胞分化，细胞迁移和肿瘤转移。有趣的是，HMGB1诱导的自噬中也报道了HMGB1的这种位置驱动功能。在细胞核中，HMGB1是能够作为以增加热休克蛋白27的转录和经由PINK1 /帕金依赖性途径导致自噬的诱导的转录因子27，28。在细胞质中，HMGB1促进Bcl-2的磷酸化以解离Beclin-1 / Bcl2复合物，从而促进Beclin-1 / PI3K复合物的形成以启动自噬。29。在细胞外环境中，分泌的HMGB1触发ERK和AMPK / mTOR途径，通过结合其膜受体 30来激活自噬。分泌的HMGB1诱导的自噬据报道对癌症进展有益。通过与肝癌细胞上的RAGE结合，分泌的HMGB1触发的自噬能够促进肝癌细胞增殖和对索拉非尼诱导的细胞毒性的抵抗性 31。在图 6一，存在shLuc和shHMGB1 ML-1之间细胞增殖没有差异 4a中的细胞。由于HCC细胞上RAGE的表达水平与HMGB1调控的细胞增殖有关 31，因此ML-1 4a上RAGE的表达水平细胞可能未上调。在这里，我们进一步证明HMGB1诱导的自噬有助于HCC微环境中TAM M2巨噬细胞的极化。这些发现表明HMGB1是治疗HCC的新靶标。另一方面，如图4所示 ，低HMGB1的MCM和针对HMGB1的中和抗体均部分降低了MCM诱导的对BMDM的作用。这表明HMGB1不是MCM中影响M2巨噬细胞极化的唯一因素。需要进一步研究以鉴定出其他源自HCC细胞的潜在因素，以驱动M2巨噬细胞极化。
已经暗示巨噬细胞上TLR信号传导的激活与肿瘤相关的炎症反应的诱导有关。从垂死的肿瘤细胞，如热休克蛋白或HMGB1 DAMP的，都能够经由TLR信号来触发针对肿瘤生长的保护性免疫应答32，33。但是，最近的报道表明巨噬细胞上TLR介导的激活可能促进肿瘤的发展。例如，TLR2或TLR4信号对的TAM激活增加通过TNF-α和IL-6产生的肺癌转移34，35。肿瘤相关髓样细胞中的TLR9 / IL-6 / JAK / STAT3途径在放疗后引发癌症复发中起重要作用36。最近有报道称，肿瘤来源的中等大小的透明质酸片段可通过TLR4 / mir-935途径诱导M2巨噬细胞极化，从而促进肿瘤进展37。据报道，肺癌衍生的细胞外基质蛋白versican引起TAM中的TLR2依赖性激活和M2表型极化，从而诱导肿瘤转移38。此外，肿瘤来源的含外来体的热休克蛋白72能够通过TLR2 / MyD88途径39触发肿瘤相关髓样细胞的免疫抑制功能。与这些观察结果相似，我们先前曾报道，依赖TLR2的自噬对于调节HCC相关的M2巨噬细胞极化5是必需的。并在此研究中进一步鉴定了HCC衍生的可溶性因子HMGB1。我们的发现与最近的一项研究一致，该研究表明肿瘤来源的外泌体HMGB1通过诱导PD1 + M2表型TAM 12的扩增促进食管鳞状细胞癌的发展。但是，我们没有观察到MCM处理的TLR2中CD204，CD206和ROS的水平完全降低-/-BMDM与野生型细胞相比。这表明存在来自MCM的其他信号来控制此M2巨噬细胞极化。在这项研究中，我们进一步表明，NOX2产生的ROS参与了这种TLR2依赖性M2巨噬细胞极化。一些研究发现指出，NOX2是TLR2调节的免疫反应的重要介体。特别是，NOX2和TLR2之间的相互作用已被建议通过诱导cathelicidin表达40来促进针对分枝杆菌感染的防御。从内皮细胞或TLR2-depenedent神经损伤经由小神经胶质细胞另外，在TLR2 / NOX2的要求6介导的GM-CSF的生产已经注意到41，42。但是，TLR2通过NOX2生成的ROS的机制尚未明确。先前的报道表明，TLR2 / MyD88 / TRAF6 / c-Src / NADPH氧化酶复合物的形成对于脂蛋白酸诱导的人气管平滑肌细胞中ROS的产生至关重要43。进一步的研究将值得检查该复合物是否形成，并引起HMGB1触发的M2巨噬细胞极化。
Pam3CSK4购自InvivoGen（CA，USA）。重组鼠HMGB1购自eBioscience（CA，USA）。2-乙酰吩噻嗪（ML171）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州）。针对LC3和p62的抗体购自MBL（日本名古屋）。NF-κBp65，精氨酸酶1和ERK（p44 / 42）的抗体购自Cell Signaling Technology（MA，USA）。抗小鼠CD204-FITC和CD206-FITC抗体分别购自AbD Serotec（英国牛津）和Biolegend（美国CA）。针对β-肌动蛋白和HMGB1的抗体购自Abcam（美国马萨诸塞州）。针对SOCS3的抗体购自Proteintech（IL，USA）。抗HMGB1中和的鸡IgY抗体购自SHINO-TEST Corporation（日本神奈川县），同种型鸡IgY抗体购自BD Biosciences（美国加利福尼亚州）。
人胚胎肾细胞293 T购自美国典型培养物收集细胞库。先前在BALB / c背景下产生的小鼠肝癌细胞系ML-1 4a细胞44。293 T和ML-1 4a将细胞在补充有10％热灭活胎牛血清（FBS），50 U / mL青霉素和0.05 mg / ml链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。为了培养骨髓源性巨噬细胞（BMDM），将两到三只6至8周大的小鼠擦掉以获得双腿的股骨和胫骨。这些骨头用75％的乙醇消毒，然后去除骨头的末端。冲洗掉所有这些骨头的骨髓细胞，并保存在补充有10％FBS的RPMI 1640培养基中。将合并的骨髓细胞（2×10 6）在分化培养基（RPMI 1640中的10％FBS，0.01μg/ mL MCSF）中进一步培养6天。
BALB / c（雄性，8-10周龄）和C57BL / 6小鼠（雌性，8-10周龄）购自国立成功大学动物实验室。TLR2 -/- 小鼠由台湾中研院分子生物学研究所的John T. Kung博士友情提供。TLR4 -/-小鼠由大阪大学WPI免疫学前沿研究中心宿主防御实验室Akira Shizuo博士提供。gp91 phox-/-小鼠是由台湾国立成功大学临床医学研究所的谢志昌博士提供的。将所有小鼠饲养在国立成功大学动物实验室的无病原体设施中。根据国立成功大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）制定的准则饲养和护理动物。这项研究得到了国立成功大学动物实验伦理委员会的批准（许可号：102117）。的鼠在仰卧ü肝癌模型成立通过脾内注射1×10 6活SH-萤光素酶（LUC） -或shHMGB1-ML-1 4a中的细胞在0.1ml的DMEM中成麻醉小鼠如先前报道44。注射后1周开始形成各种大小的肝肿瘤结节。在肿瘤细胞接种后28至35天，收集荷肝细胞瘤小鼠的肝脏以确定肝结节的数量和大小。
为了收集蛋白质提取物，收集细胞并将其悬浮在冰上的裂解缓冲液（Cell Signaling）中20分钟，然后以12,000× g离心 20分钟。收集上清液以确定蛋白质浓度。通过SDS-PAGE分离25至30μg的每种蛋白质提取物，并将其转移到PVDF膜上。为了检测蛋白质，将一抗添加到膜上。与过氧化物酶偶联的二抗孵育后，通过增强化学发光试剂（PerkinElimer Life Sciences，MA，USA）将印迹可视化。
为了进行细胞表面免疫染色，收集BMDM并与荧光偶联的抗体（包括FITC偶联的抗CD80，CD204，CD206和PE偶联的抗MHC II抗体）在染色缓冲液（2％FBS + 0.1％叠氮化钠PBS）在冰上放置30分钟。这些表面分子的表达通过流式细胞术确定。为了监测自噬体的形成，将细胞用4％甲醛固定并在4°C下用抗LC3抗体染色。通过共聚焦荧光显微镜（Olympus FV 1,000，日本）确定LC3点的形成。
为了确定M1或M2巨噬细胞的极化，将BMDM（3×10 4）接种在96孔板中，并用MCM或重组HMGB1处理24小时。接下来，收集这些细胞的上清液。通过ELISA试剂盒（R＆D system Inc，MN，USA）分析产生的细胞因子的水平。
为了分析BMDM中ROS的产生，将细胞与5μM2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate（H 2 DCF-DA）荧光探针在室温下孵育1小时。通过流式细胞术检测（DCF）中ROS转化的荧光2'，7'-二氯荧光的水平。
通过稳定表达基于慢病毒的shRNA，HMGB1在ML1 4a细胞中被敲低。所述克隆获自国家RNAi核心设施（中国科学院分子生物学研究所/基因组研究中心，台湾），并且HMGB1的靶序列为TRCN0000365913 5'-GAAGATGATGATGATGAATAA-3'。为了生产重组慢病毒，将 293 T细胞（2×10 5）接种到6孔板中，并用DNA混合物（pCMVdeltaR8.91：0.9μg/孔； pMD.G：0.1μg/孔； shRNA：1μg）转染。 /好）。然后用重组慢病毒感染ML1 4a细胞24小时，并用嘌呤霉素选择稳定表达的细胞。通过蛋白质印迹法测定靶蛋白的敲低效率。
所有实验至少进行了2至3次，数据表示为均值±SD。使用GraphPad Prism 5软件（GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA，美国）通过双向方差分析对数据进行分析，认为p <0.05代表两组之间的显着差异。将所有实验重复2至3次。
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