您好,请问有什么可以帮到您的。 点击这里给我发消息
武汉新启迪生物科技有限公司
新启迪-您的生物科研好伙伴!
本企业通过iso9001质量体系认证

妊娠期雌激素受体在兔子宫颈中的分布及其与基质成分的关系:免疫组化研究

 二维码
发表时间:2020-08-13 09:05作者:武汉新启迪Xinqidibio来源:www.qidibio.com

摘要

雌激素在怀孕期间通过受体发挥关键作用。尽管兔子是基础细胞上最重要的实验动物雌激素受体α(ERA)定位之一,但尚未描述在怀孕期间新发现的细胞,包括端粒细胞和神经内分泌细胞,血管腔和间质。妊娠0天时,最显着的免疫反应性为ERA,并在纤毛细胞,分泌细胞,血浆和间质上观察到。平滑肌和内皮细胞对ERA表现出轻度的免疫反应性。淋巴细胞仅表现出对ERA的强免疫反应性。妊娠第7天,在纤毛细胞,分泌细胞,平滑肌,间质和淋巴细胞上观察到对ERA的中等免疫反应。在内皮细胞和血浆中检测到对ERA的强免疫反应性。怀孕14天时,最显着的免疫反应性很强,并在纤毛细胞,平滑肌,淋巴细胞和间质中检测到。在内皮细胞和血浆中检测到中等免疫反应性。分泌细胞仅表现出对ERA的轻度免疫反应性。妊娠21天时,对ERA的免疫反应性介于纤毛细胞,平滑肌,血浆和间质轻度,而分泌细胞,内皮细胞和淋巴细胞为阴性。我们的结果表明,在不同怀孕阶段,子宫颈ERA免疫染色的频率和强度在子宫颈的不同结构区室变化。最显着的免疫反应性很强,可以在纤毛细胞,平滑肌,淋巴细胞和间质中检测到。在内皮细胞和血浆中检测到中等免疫反应性。分泌细胞仅表现出对ERA的轻度免疫反应性。妊娠21天时,对ERA的免疫反应性介于纤毛细胞,平滑肌,血浆和间质轻度,而分泌细胞,内皮细胞和淋巴细胞为阴性。我们的结果表明,在不同怀孕阶段,子宫颈ERA免疫染色的频率和强度在子宫颈的不同结构区室变化。最显着的免疫反应性很强,可以在纤毛细胞,平滑肌,淋巴细胞和间质中检测到。在内皮细胞和血浆中检测到中等免疫反应性。分泌细胞仅表现出对ERA的轻度免疫反应性。妊娠21天时,对ERA的免疫反应性介于纤毛细胞,平滑肌,血浆和间质轻度,而分泌细胞,内皮细胞和淋巴细胞为阴性。我们的结果表明,在不同怀孕阶段,子宫颈ERA免疫染色的频率和强度在子宫颈的不同结构区室变化。妊娠21天时,对ERA的免疫反应性介于纤毛细胞,平滑肌,血浆和间质轻度,而分泌细胞,内皮细胞和淋巴细胞为阴性。我们的结果表明,在不同怀孕阶段,子宫颈ERA免疫染色的频率和强度在子宫颈的不同结构区室变化。妊娠21天时,对ERA的免疫反应性介于纤毛细胞,平滑肌,血浆和间质轻度,而分泌细胞,内皮细胞和淋巴细胞为阴性。我们的结果表明,在不同怀孕阶段,子宫颈ERA免疫染色的频率和强度在子宫颈的不同结构区室变化。

介绍

子宫颈是位于子宫和阴道之间的边界结构,在维持妊娠和分娩时机中起关键作用1另外,子宫颈作为保护雌性动物2的上生殖道的屏障子宫颈是一种动态结构,具有很高的适应能力,可以适应女性生殖道上的不同事件,并在怀孕期间和妊娠结束时起到保留胎儿的屏障作用,从而可以正常分娩。此外,子宫颈对激素环境3的修饰具有不同的生物学反应

类固醇激素的主要靶标是女性生殖器。子宫颈中类固醇受体的控制与生殖道不同部分的控制相同,分别包括雌激素和孕激素的刺激和抑制4

此外,女性生殖器发育和生育由雌激素调节的567子宫颈是类固醇依赖型器官,是雌激素的作用的目标89101112雌激素受体通常存在于子宫颈13上尽管其外观正常,但在敲除小鼠的生殖道中检测到雌激素受体异常14

雌激素的生理作用是通过细胞内雌激素受体15获得的因此,激素的作用不仅取决于激素的数量,而且还取决于受体的数量。因此,研究雌激素受体在宫颈各个部位的分布对于了解怀孕期间子宫颈各个组成部分发生的变化以及为什么细胞以相似的激素16刺激作用不同的方式非常重要在哺乳动物中观察到两种类型的ER:雌激素受体α(ERA)和雌激素受体β(ERβ)。此外,ERA扮演女性生殖器的不同的重要生理活动中起主要作用1718ERA认为是最常见的类型负责对宫颈雌激素作用ER的1920在怀孕期间,通过雌激素介导的宫颈重塑21

在子宫颈的不同部位描述了不同种类的重要细胞,它们执行了各种功能。子宫颈上皮主要由纤毛细胞和分泌细胞组成,它们在通过宫颈粘液分泌引发和维持妊娠中起重要作用。纤毛细胞的特征是在根尖细胞边界处有许多长的纤毛,并且分泌细胞在细胞的根尖显示分泌产物并形成气泡22另外,子宫颈处的淋巴细胞是妊娠免疫系统适应能力的一部分。淋巴细胞识别为圆形细胞很少细胞质和大圆形核2223另外,新描述的间质细胞的telocyte以小细胞体和薄而长的细胞质过程为特征。Telocyte起着蜂窝通信和组织再生一种珍贵的作用,并在怀孕期间在不同的动物,包括生殖器的不同器官观察到242526此外,先前在不同器官如肺和胃肠道以及生殖道上描述的神经内分泌细胞。神经内分泌细胞被发现单生或成簇并分泌激素。此外,神经内分泌细胞位于朝向上皮的管腔边界或基部边界272829

尽管ERA在兔肉生产中和作为实验动物很重要,但目前尚无关于妊娠期ERA在兔子宫颈中表达的研究。因此,我们旨在显示ERA在妊娠不同阶段在子宫颈中的表达。此外,我们将不同的细胞成分描述为纤毛细胞,分泌细胞,上皮内淋巴细胞,神经内分泌细胞,telel细胞,平滑肌纤维,血细胞,内皮细胞和间皮细胞。此外,在间质和血浆中证实了ERA表达。此外,这项工作是该项目的一部分,旨在研究怀孕期间的女性生殖器30

材料与方法

当前的研究是根据动物保护大学的埃及法律和准则进行的。埃及阿瑟特大学兽医学国家伦理委员会已经批准了本工作的所有步骤。

样品采集

该研究得到埃及阿修特大学兽医学院实验动物使用和护理委员会的批准。在怀孕0、7、14和21天时,从12只健康的新西兰白兔的雌性生殖器中收集子宫颈(随后的每个妊娠天3只)。交配日被认为是怀孕的零日,然后我们在7天,14天和21天后收集了孕妇的子宫颈。我们通过触诊法和超声检查发现了孕妇。屠宰后立即解剖兔子的宫颈,并固定在布恩氏溶液中。

免疫组织化学

用二甲苯对(5 µm)的石蜡切片进行脱蜡,再用升级的酒精将其重新水化,然后用PBS pH 7.4冲洗(3次,每次5分钟)。通过在室温下使用过氧化氢嵌段抑制内源性过氧化物酶。再用自来水冲洗切片10分钟。为了增强抗原的回收,将玻片在水浴中用10 mm柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)在温度达到95-98的条件下处理20分钟。将切片在室温下冷却20分钟,随后在PBS(pH 7.4,3次,5分钟)中洗涤。通过使用Ultra V封闭,在室温下进行封闭非特异性背景染色5分钟。Ultra V阻滞剂的施用时间不超过10分钟,以避免染色伪影。将一抗在4°C下过夜孵育。使用的一抗是针对雌激素受体α(ERA)兔的小鼠抗兔抗体(PolyClonal;来自ThermoFisher Scientific / Lab Vision的目录号RM-9101-S0),在PBS中稀释(1:200)1小时在室温下。使用PBS洗涤切片(在pH 7.4,3次,持续5分钟)。

在室温下将生物素化的二抗应用10分钟。生物素化的二抗是英国Thermo Fisher Scientific公司的生物素化山羊抗多价抗体,抗小鼠igg +抗兔igg。Lab Vision Corporation,随时可以使用。将切片用PBS洗涤(pH 7.4,3次,持续5分钟),然后与链霉亲和素-过氧化物酶复合物一起孵育。英国赛默飞世尔科技。LabVision公司;美国)在室温下放置10分钟。使用1滴DAB加色原至2 mL DAB加底物进行结合抗体的可视化。施加混合物并在室温下孵育5分钟。孵育过程在潮湿的室内进行。哈里斯苏木精用作染色30秒钟的计数器。切片用乙醇和异丙醇I和II脱水,3132

使用OLYMPUS BX51显微镜在显微镜下检查ERA在宫颈中的表达,并使用适合该显微镜的OLYMPUS DP72相机拍摄图像。通过评估免疫染色的强度,通过以下数量和颜色的免疫染色对细胞核和/或细胞质进行染色:强(深棕色至黑色),中度(棕色),中度(浅棕色)和阴性免疫染色(无免疫反应性) )33

使用Image–J软件测量妊娠不同阶段的ERA免疫组化阳性细胞百分比。每只动物在9个切片上进行测量(从每个切片中测量了3个不同的区域)。使用统计分析系统(SAS)对收集的数据进行方差分析(ANOVA)。数据表示为平均值±SEM,以显示平均数据偏差。

道德上的同意和参与同意

该研究得到埃及阿修特大学伦理委员会的批准。

结果

在子宫颈上皮,上皮内淋巴细胞,神经内分泌细胞,平滑肌纤维,血管,淋巴管,间质和不同种类的结缔组织成分(包括成纤维细胞,淋巴细胞和四叶形细胞)上描述的免疫组织化学反应性。

怀孕0天

妊娠0天时,ERA在兔宫颈中的免疫组织化学定位显示,在宫颈内膜上皮中随机分布的纤毛和分泌细胞均具有中等的胞质和核免疫染色。但是,大多数子宫颈内膜上皮对ERA表现为阴性免疫染色(图   1 A,B)。上皮内淋巴细胞对ERA表现出轻度,中度至强度的细胞质免疫染色(图   1 A,C,D)。此外,上皮下的tel细胞具有中等的细胞质和阴性核ERA免疫反应性(图   1 E)。同样,固有层中的不同种类的细胞,包括成纤维细胞和淋巴细胞,表现出轻度的细胞质和阴性的ERA免疫反应性(图   1 F)。

图1
图1

妊娠0天时ERA在兔宫颈中的免疫组织化学定位。A)分泌细胞(黑色箭头)显示出对ERA的中等细胞质和中等核免疫染色,而上皮内淋巴细胞显示出对ERA的强烈的免疫染色(红色箭头)。B)纤毛细胞(蓝色箭头)显示出适度的ERA胞质和核免疫染色。C)上皮内淋巴细胞(红色箭头)显示对ERA的轻度免疫染色。D)上皮内淋巴细胞(黑色箭头)显示对ERA的中度免疫染色。E)上皮下端细胞(红色箭头)显示出适度的ERA胞质和阴性核免疫染色。F)成纤维细胞(黑色箭头)和淋巴细胞(红色箭头)显示出轻度的细胞质和阴性的ERA免疫染色。G)平滑肌纤维(蓝色箭头)显示对ERA的轻度细胞质和轻度核免疫染色。H)动脉(A)和静脉(V)内的血浆(P),红细胞(蓝色箭头)和白细胞的细胞质(黑色箭头)显示出对ERA的中等免疫反应性。淋巴管(L)内的淋巴表现出对ERA的强免疫反应性。)浆膜间质(红色箭头)和间皮(蓝色箭头)显示出中度和强烈的ERA免疫染色。注意,(A)阴性对照中的边框区域

ERA的轻度免疫反应性在子宫颈的某些平滑肌纤维的细胞质和细胞核中表达(图   1 G)。而且,动脉和静脉内的血浆,红细胞和白细胞的细胞质显示出对ERA的中等免疫反应性。淋巴管内的淋巴也显示出对ERA的强免疫反应性。此外,一些内皮细胞显示轻度ERA的免疫染色和周围血管显示出温和的和强大的免疫染色ERA(图基质   1 H)。浆膜间质和间皮显示出中度和强烈的ERA免疫染色(图   1 I)。

怀孕7天

在怀孕的7天时,分泌细胞对ERA进行了中等程度的细胞质和核免疫染色。然而,纤毛细胞表现出中等的细胞质和阴性的核免疫染色。另一方面,大多数子宫颈上皮对ERA表现为阴性免疫染色,阳性细胞随机分布在子宫颈上皮内(图   2 A,B)。上皮内淋巴细胞显示出中等的细胞质ERA免疫染色。上皮内神经内分泌细胞对ERA表达轻度至强性的细胞质和核免疫染色,并单独或成组分布(图   2 C)。此外,上皮下的tel细胞显示出对ERA的中等胞质和轻度的核免疫染色(图   2 D)。

图2
图2

妊娠7天时,ERA在兔子宫颈中的免疫组织化学定位。A)分泌细胞(黑色箭头)显示出对ERA的中等胞质和中等核免疫染色。B)纤毛细胞(蓝色箭头)显示出中等的细胞质和阴性核免疫染色,上皮内淋巴细胞(红色箭头)显示出中度的细胞质ERA免疫染色。C)单个(黑色箭头)或成组(红色箭头)分布的上皮内神经内分泌细胞表达对ERA的轻度至强细胞质和核免疫染色。D)上皮下上皮细胞(红色箭头)显示对ERA和动脉内皮(A的中度胞浆和轻度核免疫染色)表现出对ERA的强免疫反应性。注意,A阴性对照中的边框区域。

我们的结果表明,在子宫颈的某些平滑肌纤维中表达了ERA的轻度胞质和中度至强核免疫反应性(图   3A)。此外,血管内皮表现出较强的免疫反应性和ERA表现出强大的免疫反应,以ERA(图动脉和静脉内血浆2 d和3 B)。浆膜间质和间皮表现出很强的ERA免疫染色(图   3C,D)。

图3
图3

妊娠7天时,ERA在兔子宫颈中的免疫组织化学定位。A)平滑肌纤维(蓝色箭头)显示出轻度的细胞质和中度至强的ERA免疫反应性。B)血管内皮(红色箭头)显示出对ERA的强免疫反应性,而血浆(P)显示出对ERA的强免疫反应性。CD)浆膜间皮(黑色箭头)和浆膜间质(红色箭头)显示出强烈的ERA免疫染色。

怀孕14天

在怀孕的第14天,兔子宫颈整体对ERA表达强免疫染色。关于子宫颈上皮,我们观察到分泌细胞对ERA表现出强的胞质和核免疫染色,而纤毛细胞对ERA表现出轻度的细胞质和核免疫染色(图   4 A)。在上皮内淋巴细胞指示中等至强烈的细胞质和轻度至中度核免疫染色,以ERA(图   4的B)。固有层中的电话细胞对ERA表现出强烈的细胞质和中度核反应(图   4 C)。宫颈的许多平滑肌纤维表达了ERA的强细胞质和强核免疫反应性(图   4D)。另外,血管内皮细胞表现出中等ERA的免疫染色(图   4 E)。浆膜间皮表现出较强的免疫染色ERA(图   4 F)。此外,血浆和间质分别显示中等和强的免疫反应,以ERA(图   4 G)。

图4
图4

妊娠14天时ERA在兔宫颈中的免疫组织化学定位。A)分泌细胞(红色箭头)显示出对ERA的强细胞质和核免疫染色,纤毛细胞(蓝色箭头)显示出对ERA的轻度细胞质和核免疫染色。B)上皮内淋巴细胞(蓝色箭头)显示出中度至强性的细胞质和轻度至中度的对ERA的核免疫染色。C)卵母细胞(红色箭头)显示出对ERA的强烈细胞质和中度核反应。D)平滑肌纤维(黑色箭头)显示出ERA的强细胞质和核免疫反应性。E)血管的内皮细胞(红色箭头)显示出中等ERA免疫染色。F)浆膜间皮(蓝色箭头)显示出很强的ERA免疫染色。G)血浆(红色箭头)显示出对ERA的中等免疫反应性,间质(黑色箭头)显示出对ERA的强免疫反应性。注意,A阴性对照中的边框区域。

怀孕21天

妊娠21天时,很少有纤毛细胞和平滑肌纤维显示出对ERA的轻度免疫染色。另外,血浆显示出对ERA的轻度免疫染色。间质表现出对ERA的轻度免疫染色(图   5 A–D)。

图5
图5

妊娠21天时ERA在兔宫颈中的免疫组织化学定位。A)纤毛细胞(黑色箭头)显示对ERA的轻度免疫染色。B)平滑肌纤维(黑色箭头)显示对ERA的轻度免疫染色。C)血浆(红色箭头)显示对ERA的轻度免疫染色。D)间质(蓝色箭头)显示对ERA的轻度免疫染色。注意,A阴性对照中的边框区域

总体而言,对免疫反应的评估表明,怀孕兔子的子宫颈在怀孕0、7、14和21天对ERA有不同的免疫染色。染色强度在妊娠0天为轻度,在妊娠7天为中等,在妊娠14天时为强,在妊娠21天时为轻度(图   6 A–D)。另外,ERA免疫反应的总结发生在图7中总结的不同的宫颈结构成分上  

图6
图6

ERA在兔0、7、14和21天时的免疫组织化学定位。A)在怀孕0天兔宫颈的轻度免疫染色。B)在怀孕7天时兔宫颈的中度免疫染色。C)在怀孕14天时兔宫颈的强免疫染色(1)。D)妊娠21天时兔宫颈的轻度免疫染色。

图7
图7

在怀孕的不同阶段,子宫颈的不同结构成分的ERA免疫反应强度。

1显示了妊娠不同时期ERA阳性细胞的百分比

表1 ERA的免疫组织化学阳性细胞百分比(平均值±SEM)

讨论区

在整个怀孕期间,子宫颈具有承重功能,可以承受来自胎儿成长的压力,并且在怀孕期间不会扩张34宫颈成熟是一个逐渐发生的复杂过程,以促进胎儿35的排出在这些过程中观察到的几个变化包括细胞和细胞外基质元素36此外,通过雌激素受体的调节作用发生了宫颈重塑37另外,在妊娠晚期,雌激素受体的宫颈水平较低21

本研究证明了怀孕期间兔宫颈中存在ERA。雌激素的作用主要是通过与靶细胞38中特定的细胞内受体结合而介导的我们的研究提供了有关在不同妊娠阶段正常兔宫颈中ERA的表达和定位的新信息。我们确定在兔子宫颈中,ERA在妊娠0、7、14和21天显示出不同细胞类型之间的差异。根据ERA的密度,这些可能在整个怀孕期间提供有利的环境。此外,在实验条件下,在怀孕的绵羊和女性中,雌激素的施用促进了子宫颈的软化39但是,仅雌激素不能促进猪的颈软化40

兔的颈衬上皮主要由纤毛和分泌细胞组成22我们的数据显示,纤毛细胞对ERA表现出轻度至强力的免疫染色,分泌细胞在不同妊娠阶段对ERA表现出负至中等的免疫染色。雌激素对于通过子宫管运输的纤毛细胞的功能非常重要,并能诱导分泌细胞的重要分泌产物41子宫颈内膜上皮的内分泌作用在怀孕期间可保持子宫颈功能42

在非妊娠条件对雌性生殖道的不同部分观察到神经内分泌细胞2943我们的结果表明,神经内分泌细胞处于上皮内位置,对ER显示出不同的免疫反应性。

我们的数据显示,怀孕期间子宫颈的上皮内和上皮下淋巴细胞显示出对ER的免疫反应呈负性至强阳性。雌激素在调节女性生殖道免疫细胞中起着关键作用44上皮内淋巴细胞在子宫管中对ER表达阳性免疫反应。同样,如先前在精子在子宫管45上的运动期间的局部免疫耐受的管理中所述

我们的结果表明,基质细胞作为成纤维细胞对ERA具有免疫反应性。此外,成纤维细胞充当激素受体并通过旁分泌活性作用于上皮细胞46此外,类固醇激素在基质细胞的增殖和分化以及维持妊娠中起重要作用。子宫上皮细胞与基质细胞之间存在旁分泌对话,这些细胞受类固醇激素受体控制,以在妊娠期间调节其功能47

Telocyte是新发现的与旁分泌酶活性间质细胞和组织修复和再生中发挥作用334849此外,它表现出免疫反应性不同的类固醇激素315051先前在雌性生殖道观察Telocyte 32525354我们的研究结果表明,在怀孕的不同阶段,卵母细胞对ER表达中度至强免疫反应。此外,telocyte充当在雌性生殖道类固醇传感器5556

雌激素对平滑肌的作用对于成功怀孕很重要。我们的数据显示,宫颈平滑肌纤维上的ERA表达逐渐增加,在怀孕中期达到峰值,然后在怀孕后期下降。这些可能与子宫颈的功能密切相关,子宫颈的功能在怀孕期间会强烈关闭,并在怀孕结束时开始扩张,这与子宫肌层上的情况相反。妊娠早期低表达的雌激素受体有助于子宫肌层的静止,直到足月妊娠前雌激素受体表达的增加会在分娩期间引起子宫肌层的收缩,这是在其他激素作用的帮助下57

我们描述了怀孕期间血液和淋巴管中ERA的表达,范围从弱到强。此外,之前描述的雌激素在怀孕期间对血管的作用包括生长和扩张以改善血流58同样,在我们的结果中,红细胞和白细胞显示出对ERA的免疫反应性。此外,白细胞的功能由性类固醇激素控制59宫颈血管白细胞内皮细胞上雌激素受体的表达在调节白细胞功能中起着重要的作用,在诱导怀孕期间负责宫颈重塑的某些酶的诱导中60此外,通过在红细胞中作为活性氧和氮物质清除剂的功能对红细胞的作用观察到ERA的表达61

在最近几年中,一些研究开始关注间质,即在胃肠道,真皮和膀胱上描述的充满液体的空间。同样,间质组织可能对这些器官的机械结构很重要,并在纤维化和癌症转移中发挥作用62在我们的结果中,间质所含的组织液在妊娠早期显示中等免疫染色,在妊娠中期显示强免疫染色,在妊娠后期显示轻度免疫染色,这说明ERA与间质与宫颈重塑和宫颈成熟之间密切相关。此外,我们的数据显示子宫颈上存在的各种液体在整个怀孕期间对ERA表现出不同的免疫反应强度,包括血浆和淋巴液。


武汉新启迪生物科技有限公司联系邮箱:
service@qidibio.com  techsupport@qidibio.com  
武汉新启迪生物科技有限公司咨询客服:周一至周五8:30-17:30
联系我们
服务保障                        支付方式
武汉新启迪生物科技有限公司联系电话:
027-87610298
027-87610297