如我们先前所述进行蛋白质印迹37。简而言之，使用RIPA裂解缓冲液从细胞或组织中提取蛋白质。对每个样品中等量的蛋白质进行SDS-PAGE分离，然后印迹到PVDF膜上。封闭后，将印迹与一抗在4°C孵育过夜，然后与HRP偶联的二抗在室温孵育1 h。用化学发光检测试剂（Millipore）可视化信号。

IP和免疫印迹（Co-IP）

进行Co-IP检测蛋白相互作用。简而言之，将全细胞裂解物与所示抗体和Protein G / A-Sepharose 4B在4°C孵育过夜。用RIPA缓冲液洗涤五次后，将珠子在2x SDS-PAGE上样缓冲液中煮沸5分钟以洗脱蛋白复合物，然后进行SDS-PAGE分离并用特异性抗体进行免疫印迹。

CCK-8测定

细胞增殖使用如由我们如前所述的CCK-8试剂盒测量43。该测定一式三份进行三次。

平板克隆形成测定

进行板集落形成测定以检测我们先前描述的细胞增殖43。该测定一式三份进行三次。

EdU掺入法

的EdU掺入法进行如我们先前描述，以检测细胞的增殖43。该测定一式三份进行三次。

软琼脂菌落形成试验

进行软琼脂菌落形成测定以检测细胞锚定非依赖性生长，如先前我们43所述。使细胞在软琼脂培养物中生长12天，并在显微镜下计数由> 50个细胞组成的菌落。该测定一式三份进行三次。

免疫组织化学

物上进行IHC分析的福尔马林固定和石蜡包埋如我们先前描述的异种移植物的组织切片37，43。简而言之，将组织切片与抗p-Shp2（Y542）抗体（YP5081，ImmunoWay Biotechnology； 1：200稀释度）或抗p-Erk-1 / 2抗体（1：400稀释度）在4°C孵育过夜，然后在室温下先与生物素化的二抗，然后再与抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶复合物（DAKO）孵育30分钟。最后，将组织切片与3'，3'-二氨基联苯胺（Sigma-Aldrich）一起孵育，并用苏木精复染。

染色强度分类如下：不染色为0，弱染色为1，中度为2，强染色为3。染色细胞的百分比（在至少500个细胞中检查）归类为无染色= 0，<30％染色的细胞= 1，30〜60％= 2，> 60％=3。通过将面积得分和强度得分相加，计算出每个组织的染色得分（从0到6）。≤3的综合染色评分被认为是低表达，> 3的综合染色被认为是高表达。

免疫荧光

如先前由我们[ 43]所述进行免疫荧光染色。简而言之，将细胞接种到小室玻片（Millipore）中，固定在4％多聚甲醛中，透化，并与小鼠抗EphA2抗体（1：300稀释度）和兔抗Shp2抗体（1：100稀释度）一起孵育，然后孵育与DyLight®488抗小鼠IgG（DI-2788，Vector Laboratories）和DyLight®594抗兔IgG（DI-1794，Vector Laboratories）。使用倒置共聚焦荧光显微镜（LEICA TCS SP8）捕获图像。细胞核用4'，6-二-2-基-2-苯基吲哚（DAPI）复染。

统计分析

使用IBM SPSS统计软件包22进行统计分析。数据以均值±SD表示。定性变量由学生比较牛逼 -测试或χ 2 -测试。所有统计检验都是双向的，p值 <0.05被认为具有统计学意义。