对于许多类型的肿瘤，化学治疗仍代表着选择的治疗方法，许多标准治疗方法均基于铂（PT）药物的使用。然而，从头开始或获得的对铂的抗性很常见，并导致疾病进展。在上皮性卵巢癌（EOC）患者中，PT耐药的复发非常普遍，改善对治疗的反应仍然代表了尚未满足的临床需求。为了确定PT敏感性的新调节剂，我们针对680个可能参与EOC细胞对铂反应的基因进行了功能丧失筛选。我们发现SGK2（血清和糖皮质激素诱导的激酶2）在PT反应中起关键作用。我们在这里显示，EOC细胞依靠自噬诱导逃避PT诱导的死亡，并且SGK2抑制作用增加了PT敏感性，从而诱导了自噬级联中的一个阻断，这是由于溶酶体酸化的损害。从机理上讲，我们证明了SGK2通过结合和抑制V-ATPase质子泵以激酶依赖的方式控制自噬。因此，SGK2使V-ATPase的亚基V1H（ATP6V1H）磷酸化，并使SGK2沉默或受到化学抑制，影响正常的自噬通量并使EOC细胞对铂敏感。因此，我们确定了一种新的途径，该途径将自噬与铂治疗下癌细胞的存活联系起来，其中可药用激酶SGK2发挥着核心作用。
基于铂的化疗被用在宽范围的固体肿瘤，包括头和颈癌，胰腺癌，结肠直肠癌，膀胱癌，卵巢癌和肺癌[的治疗1，2 ]。尽管初始响应的优良率，基于铂的治疗常常导致化学抗性复发导致治疗失败[发展3，4，5，6，7，8 ]。此问题是上皮性卵巢癌（EOC），其中所获取到铂（Pt）电阻是预测患者[不良预后中的常见事件特别相关的9，10]。在过去的几年中，已经进行EOC的几个综合基因组分析中最常见的组织型[揭示PT-性的新的致癌驱动程序和调解员可能11，12，13 ]。这些研究强调了EOC的异质性，以及需要新颖的方法来鉴定新的可能的治疗靶标。
已经进行了许多研究来鉴定与抗PT治疗的抗性直接相关的基因和机制。PT-电阻已被链接到改建几个过程，例如药物输送，药物失活，DNA损伤反应，DNA修复和细胞凋亡[ 14，15 ]。间一般应激反应途径的自噬也被关联到PT-电阻[ 16，17 ]。事实上，自噬已显示赋予癌细胞次优环境中生长并治疗诱导的应力下存活[必要代谢可塑性18，19，20，21 ]。
我们进行了功能丧失筛选，以鉴定能够影响PT治疗的基因，这些基因靶向与EOC中PT耐药相关的途径。使用这种方法，我们推出了SGK2，血清和糖皮质激素激酶2，作为铂敏感性的新型调节剂。
所述SGK家族由三种同种型：SGK1，SGK2，SGK3和，属于AGC激酶组[ 22，23 ]。AGC家族由60个成员组成，其中一些成员在癌症研究中进行了广泛研究，例如AKT，S6K和RSK。文献数据表明，这三种SGK亚型具有相似的生化特性和结构，其激酶结构域具有80％的同源性，羧基末端非催化结构域具有44-68％的同源性，而SG2和SGK3之间的NH2末端具有25％的同源性，几乎SGK2与其他同工型之间没有同一性[ 24]。关于SGK家族在细胞生理学和人类疾病发展中的作用的大多数科学知识都是基于对SGK1和SGK3基因的研究，而SGK2实际上是一个未表征的研究。SGKs最初鉴定为几个转运通道的调节剂，和泵，可在上皮离子转运[上下文25，26，27，28 ]。最近的工作表明，SGK1和SGK3在癌症生物学的新作用在PI3K / AKT抑制的存在维持肿瘤生长，并表明这些基因可能有致癌作用[ 29，30，31，32 ]。
在当前的研究中，我们已经证明了SGK2在自噬通量调节所发挥的PT敏感性中的作用尚未得到认识。
为了揭示涉及调节EOC细胞PT敏感性的关键基因，我们使用了功能基因组学方法，靶向与两种不同EOC细胞系中的三个shRNA的凋亡，p53和DNA修复途径相关的680个基因（MDAH-2774，在此为MDAH，和SKOV3）（图1a和S1a）。此高通量筛选的统计分析和质量控制确定了50种可能的PT敏化剂基因（筛选原始数据和分析数据在数据文件S1和补充材料与方法中进行了报道）。随后使用四种不同的EOC细胞系进行筛选，以验证这些候选基因（数据文件S1，第8节）。中所确认的那些[ 33，34]（在第9节，数据文件S1中进行了描述），SGK2沉默显示在使用的四种不同EOC细胞系中的三种（即MDAH，OV90和SKOV3，但在TOV112D中则没有），PT诱导的死亡增加（图S1b）。
功能丧失筛选的实验设计。用仅能诱导10-20％的细胞死亡率的剂量的CBDCA处理转染的细胞16小时或不使用CBDCA。b通过qRT-PCR评估了所示EOC细胞系中SGK2 mRNA的表达。c Western印迹（WB）分析评估指定EOC细胞系中SGK1，SGK2和SGK3的表达。Vinculin被用作加载对照。d格拉夫报告与对照（SH Ctrl键）和三个不同的shRNA SGK2转导MDAH细胞的生存力，然后用CBDCA 140微克/毫升处理16小时作为一个。右侧，对SGK2中SGK2，SGK1和SGK3表达的WB分析使MDAH细胞沉默。Ë图报告了稳定表达EGFP-SGK2的OVCAR8细胞的活力。用剂量增加的CBDCA处理细胞，并按d进行细胞活力分析。结果表示为经处理和未经处理的细胞之间的CBDCA存活细胞的百分比（设置为100％作为参考）。在右侧，WB分析了所用细胞中的SGK2表达。Vinculin被用作加载对照。在d和e中，数据代表三个独立实验的平均值±SD。显着性使用两尾不成对的学生t检验计算。*** p <0.001，** p <0.01，* p <0.05。（也参见图S1和S2）。
在正常人上皮性卵巢细胞（HuNoEOC）和一组七个可用的EOC细胞系中分析了SGK2表达（mRNA和蛋白质），显示出RNA和蛋白质表达之间的良好一致性（图1b，c）。有趣的是，SGK2在TOV112D细胞系中未表达（用于验证筛选），这为SGK2 shRNA不会影响该细胞系中PT诱导的死亡这一事实提供了可能的解释（图S1b），尽管未观察到SGK2表达与所分析细胞的PT-IC50之间的相关性。为了确认筛选结果，我们使用了表达SGK2的细胞（MDAH，TOV21G，SKOV3和OV90），并用卡铂（CBDCA）处理。在所有模型中，SGK2沉默均显着增加了CBDCA诱导的死亡，尽管观察到不同shRNA的差异（图1d和S1c–e）。因此，在OVCAR8细胞中SGK2的过表达（几乎无法检测到内源性SGK2的表达）增加了对CBDCA的抗性（图1e）。此外，MDAH和TOV21G细胞中的SGK2沉默显着降低了其CBDCA IC50，如剂量反应曲线所评估（图S2a）。
给出了SGK家族[的三个成员描述的高序列同源性24，35 ]，我们还分析了SGK1和SGK3的表达在正常和癌来源EOC细胞和测试了它们的沉默可能在PT-灵敏度任何作用。SGK3在几乎所有测试的细胞中高表达，而SGK1在6/7测试的EOC细胞系中表达。在正常的HuNoEOC中很容易检测到这两种蛋白质（图1c）。使用MDAH作为模型，我们观察到SGK3和SGK1沉默是特异性的，并且不影响它们的存活和PT敏感性（图S2b，c）。
为了了解SGK2如何调节EOC细胞中的PT敏感性，我们首先研究了是否涉及其激酶活性。为此，正如其他人所描述的[ 28 ] ，我们通过用蛋氨酸替代了ATP结合区内的Lys64残基，从而产生了SGK2激酶死亡（KD）突变体。该突变体对TOV21G细胞中的PT敏感性没有影响（图S3a），表明SGK2激酶活性在PT诱导的死亡中可能具有作用。根据Hemmings和合作者的工作表明丙氨酸中的Thr256和Ser422突变赋予SGK1显性负（DN）活性[ 36 ]，我们接下来通过用丙氨酸替换相应的Thr193和Ser356残基来生成SGK2 DN构建体在催化和活化域（图。2a）。我们还在磷酸化残基Asp（S356D）的激活域中取代了Ser 356，以生成SGK2组成型活性（CA）突变体。在剂量反应实验中，SGK2 DN的过度表达增加，SGK2 CA降低了TOV21G细胞对CBDCA的敏感性（图2b）。这些数据加在一起支持了SGK2激酶活性在PT诱导的死亡控制中起作用的可能性。因此，用增加剂量（从35到65 µM）的小分子GSK650394（一种特殊的SGK1 / SGK2抑制剂）对EOC细胞进行预处理24小时，[ 37 ]可以显着提高MDAH细胞对PT的敏感性，单独使用时无毒性作用（图2c）。当将GSK650394与CBDCA一起培养总共36小时时，这种效果得到了增强，同样没有明显的毒性（图2d）。使用顺铂（CDDP）代替CBDCA可以观察到PT敏感性的类似增加（图S3b）。因此，在MDAH和TOV 21G中进行的剂量反应分析中，GSK650394显着降低了CBDCA IC50，但在不表达SGK2的COV318细胞中却没有（图S3c，d）。使用这种方法，我们确定35μM剂量是在所有测试细胞中与CBDCA结合使用最有效的剂量（图S3c）。接下来，通过在一组EOC细胞上使用组合的GSK650394 + CBDCA处理，我们验证了GSK650394在表达SGK2的细胞（MDAH，TOV21G，OV90和SKOV3）中增加了PT敏感性，但在未表达明显水平的SGK2的细胞中未增加PT敏感性蛋白（COV318，TOV112D和正常的HuNoEOC）（图2e）。类似地，GSK650394对稳定表达SGK2 DN的TOV21G细胞的PT敏感性没有任何影响（图S3e）。这些结果表明，GSK650394抑制剂以SGK2依赖性方式使EOC细胞对CBDCA敏感，并证实了SGK2激酶活性在PT敏感性控制中的作用。
一个 SGK2显性负的示意图（DN）（pLPC的-SGK2 T193A / S356A）和组成型活性的（CA）（pLPC的-SGK2 S356D）构建体（上图）。WB（下图）证实了TOV21G细胞中不同SGK2构建体的过表达。Vinculin被用作加载对照。b图形报告a中所述并用剂量增加的CBDCA处理的TOV21G细胞的细胞活力。结果表示为相对于未处理的细胞处理的CBDCA的存活率（％）（设为100％作为参考）（ev ＝空载体）。C该图报告了用所示剂量的GSK650394（GSK），然后是140μg/ ml CBDCA处理的MDAH细胞的细胞活力，如曲线上方的实验时间线所示。d图显示了在所示的实验时间线中，在存在CBDCA 140μg/ ml的情况下，在最后16小时内用GSK 35μM处理了36 h的MDAH细胞的细胞存活力的图表。e图形报告了用指定剂量的GSK 35μM，CBDCA处理的表达SGK2（TOV21G，OV90和SKOV3）和SGK2 非表达细胞系（HuNoEOC，COV318，TOV112D）的细胞生存力d报告。数据代表三个独立实验的平均值±SD。显着性使用两尾不成对的学生t检验计算。**** p <0.0001，*** p <0.001，** p <0.01，ns不显着。（也参见图S3）。
接下来，我们探讨了SGK2抑制作用是否可使铂抗性细胞（PT-res）对铂重新敏感。为了这个目的，我们利用了我们实验室中最近产生的同基因的MDAH PT-res细胞（此处为MDAH PT-res）[ 38 ]。MDAH PT-res细胞具有较高水平的SGK2，与单一剂量的CBDCA处理相比，GSK650394 + CBDCA联合治疗诱导MDAH PT-res细胞死亡增加（图3a）。
a图显示了在35毫克MSK剂量的CBDCA情况下，经过35 µM GSK650394处理24小时（GSK）的MDAH亲代和PT-res细胞的细胞存活力，该细胞存活了额外的16小时。结果表示为经处理和未经处理的细胞之间的存活率（％）（设置为100％作为参考）。右侧，WB分析报告了SGK2的表达。Vinculin被用作加载对照。b通过qRT-PCR对指定的原代和建立的EOC细胞系中的SGK2 mRNA表达进行了归一化，将其对管家基因POL2A进行了归一化，然后折叠在SKOV3 SGK2表达上。C用增加剂量的CDDP处理16 h的原代EOC细胞的细胞活力测定的非线性回归分析。结果表示为活细胞相对于未处理细胞的百分比，并代表三个生物学重复的平均值（±SD）。右表报告了每种情况的IC50和置信区间（CI）。Fisher精确检验用于计算图中报告的总体p值。d如图所示，该图报告了用35 µM GSK650394和CBDCA处理的MDA-MB-468，BT-549（TNBC细胞系）以及FaDu和CAL27（HNSCC细胞系）的细胞活力。结果表示为经处理和未经处理的细胞之间的存活率（％）（设置为100％作为参考）。右侧，WB分析报告了SGK2的表达。Vinculin被用作加载对照。（也参见图S4）。
然后，我们分析了我们实验室从EOC患者手术样本中分离出的原代细胞中SGK2的表达和PT敏感性。我们分析了四种不同的原代细胞系（图S4比较SGK2 mRNA表达到EOC细胞系），SGK2的在SKOV3细胞（其表达了通过western印迹最低SGK2表达可检测的，图设定为切断值。1个 Ç和3b）。表现出最高SGK2表达的49d和66个原代EOC细胞也具有最高的CDDP IC50（图3c），这支持了原代培养物中SGK2表达与对PT的反应之间可能存在相关性。
此外，在三阴性乳腺癌（TNBC）（MDA-MB-468和BT-549）和头颈鳞癌（HNSCC）（FaDu和CAL27）细胞中，GSK650394 + CBDCA处理也增加了细胞死亡（图。3d），在临床实践中已知可以用PT治疗的两种人类癌症类型。
在进行上述实验时，我们观察到当用作单一处理（图4a，b）和与CBDCA结合使用时（图S5a，b），GSK650394诱导EOC细胞中的细胞质囊泡形成。仅在表达SGK2的细胞系（MDAH和TOV21G）中注意到该囊泡的形成，而在不表达SGK2的TOV112D细胞中则未注意到（图S5b）。囊泡的形成是可逆的，因为从培养基中撤出GSK650394导致囊泡在24小时内消失（图S5c）。通过使MDAH和TOV21G细胞中的SGK2沉默，可以证实SGK2直接参与了这些胞质囊的形成（图S5d），虽然不如用GSK650394观察到的明显。在所有测试的TNBC和HNSCC细胞系中也概括了相似的结果（图S5e，f）。
用光学（OM）和透射电子显微镜（TEM）研究细胞的实验时间表。用35 µM GSK650394（GSK）处理MDAH和TOV21G细胞36小时。b MDAH和TOV21G细胞的代表性光学显微镜照片用或不用GSK650394（GSK）作为报告一个。细胞质液泡仅存在于经GSK650394（GSK）处理的细胞中。比例尺= 50 µm。c MDAH（左图）和TOV21G（右图）细胞的TEM超微结构分析。a和e未经处理的细胞；b和f GSK650394处理的细胞（GSK）显示细胞质液泡积累；c和g初始自噬泡（AVi）（白色箭头表示双膜）和降解自噬泡（AVd）泡（d和h）的放大倍数。未处理细胞中突出显示的细胞内细胞器是内质网（ER），线粒体（m）和高尔基体（Go）。比例尺：300 nm。d蛋白质印迹分析评估自噬标记LC3I / LC3II和p62在用35μMGSK650394（36 h），CBDCA 140μg/ ml（16 h）和GSK + CBDCA处理的MDAH和TOV21G细胞中的表达。2d）与Bafilomycin A1（Baf A1）的效果进行比较。Vinculin被用作加载对照。（也参见图S5和S6）。
接下来使用MDAH和TOV21G细胞中的透射电子显微镜（TEM）来更深入地了解这些细胞质囊泡的性质。TEM显示由GSK650394治疗诱导该囊泡具有与自噬泡（AV）的兼容的超微结构[ 39，40 ]与由所指示的初始自噬泡（AVI）的典型特征，这可能是主要归类为自噬体（AP）双层膜的存在（图4a，c和S6a）。AP在大约10％的GSK650394处理过的细胞中存在。此外，几乎所有处理过的细胞还表现出降解性自噬空泡（AVd），累积了部分降解的物质（图4c）。）。在未处理的细胞中均未观察到AVi和AVd。这些数据表明，GSK650394处理导致自噬通量的改变可能通过影响在其中通过溶酶体降解自噬机械识别，偏析和底物的处置，因此导致AV的积累[率41，42，43 ]。
为了确认并更好地表征GSK650394治疗与自噬之间的联系，我们首先在我们的实验模型中测试了两种自噬的特异性标记即p62 / SQSTM1（此处为p62）和LC3的表达。作为阳性对照，我们使用了Bafilomycin A1（Baf A1），它是晚期自噬通量的已知抑制剂，正如预期的那样，它可以增加MDAH细胞的PT敏感性（图4d和S6b）。蛋白质印迹分析表明，单独或与铂结合使用GSK650394处理，可导致p62水平明显升高，LC3的未脂化（胞质）和脂化（膜结合）形式之间的比率（LC3I / LC3II比率）发生变化，并且MDAH和TOV21G细胞中LC3形式的总体增加与Baf A1产生的作用相当（图4d和S6c）。在TNBC和HNSCC细胞中也有类似的观察结果，其中GSK650394处理还诱导了p62和LC3II的增加（图S6d）。P62和LC3脂化（LC3II）连同AV的积累水平的增加，是自噬抑制[可能的标记物42，44，45 ]，整体确认SGK2是自噬的先前未公开的调节器的可能性。
为了更好地定义SGK2的下调如何改变自噬通量，我们利用了标记有mRFP-GFP串联荧光蛋白（ptfLC3）的LC3构建体的荧光测定方法[ 46 ]。ptfLC3的使用允许监视囊泡成熟，因为EGFP蛋白在酸性环境（例如溶酶体和自溶酶体）中被淬灭，而mRFP在酸性条件下更稳定，从而可以确定自噬囊泡是否（红色荧光）（红色加绿色=黄色荧光）与溶酶体[稠合42，46，47]。在MDAH细胞中使用该工具，我们观察到细胞暴露于GSK650394或SGK2沉默可颠倒红色和黄色LC3阳性囊泡（此处称为红色或黄色点）之间的比率（图5a）。同样，阻止溶酶体酸化的Baf A1处理也导致黄色点的数量大量增加。这些数据表明SGK2抑制可以在后期抑制自噬，可能会阻止自噬体融合到溶酶体和/或自溶体酸化。
a转染了mRFP-GFP-LC3的未经处理（对照），用35μMGSK650394处理36 h（GSK）或用0.2μMBafilomycin A1处理30 min（Baf A1）或用SGK2转导的MDAH细胞的共聚焦显微镜分析的代表性图片shRNA（SGK2 sh2）（比例尺：12μm）。右边的图表报告了每个细胞计数的黄色/红色LC3点状细胞的百分比（细胞数/实验条件= 15–20）。b用35μMGSK650394（GSK）处理或未处理的MDAH细胞共聚焦显微镜分析的代表性图片36小时，然后用a啶橙染色。将血清饥饿4小时（饥饿）或用0.2μM巴菲霉素A1处理30分钟（Baf A1）的细胞分别用作阳性和阴性对照（比例尺：18μm）。在右侧，该图报告了红色与绿色荧光强度的平均比率（每种条件下评估的视野数= 8-10）。C 共聚焦显微镜分析的代表性图片，用于评估是否用35μM（GSK）或LLOMe 3 mM处理过的GSK650394（未处理）的MDAH（左）和TOV21G（右）细胞的LGALS1（半乳糖凝集素-1，绿色）和LAMP2（红色）染色用作LMP（溶酶体膜通透性）的阳性对照，然后评估LGALS1（半乳凝素-1，绿色）（比例尺：20μm）。
这些数据使用using啶橙（AO）染色得到证实。AO是acidotropic染料，从绿色荧光匝位于当在细胞溶胶中的颗粒的红色荧光当纳入酸性隔室[ 42，48 ]。AO染色可通过血清饥饿（自噬增加，红色/绿色荧光强度比（R / G FIR）增加）和Baf A1（自噬受阻，R / G FIR减少）进行修饰。使用这两种治疗方法作为阳性和阴性对照，我们观察到与未处理的MDAH细胞相比，GSK650394和Baf A1诱导R / G FIR强烈降低，而血清饥饿增加了颗粒状R / G FIR（图5b））。由于AO R / G FIR的降低也可能是由于溶酶体膜通透性（LMP）所致，我们使用所谓的半乳凝素测定法和L-亮氨酰-L-亮氨酸甲酯测试了GSK650394是否影响LMP而非自噬体的成熟/酸化（LLOMe）作为阳性对照。LLOMe是LMP的诱导剂，可导致溶酶体膜上富含N-乙酰基-乳糖胺的碳水化合物屏蔽暴露，因此被LGALS1（半乳糖凝集素-1）的转运所束缚。结果，LMP诱导后，LGALS1染色从弥漫性变为点状。在MDAH和TOV21G中获得的数据表明LLOMe而不是GSK650394诱导了LGALS1点状染色的出现，该染色也与溶酶体标记LAMP2共定位（图5c）。），总体证实SGK2抑制作用不会直接诱导LMP。
到目前为止，我们的数据表明，在自噬小体/溶酶体融合和/或自溶酶体酸化阶段，SGK2激酶活性的抑制导致自噬的阻滞。为了证实这些数据，我们用LAMP2（溶酶体相关膜蛋白2）对对照和GSK650394处理的细胞（MDAH和TOV21G）进行了染色，并观察到处理过的细胞中LAMP2的染色明显上调（图6a，b）。LC3 / LAMP2共染色显示，在MDAH和TOV21G细胞中，在GSK处理下观察到，这两个分子都存在于大液泡的膜上（图6c，d）。最后，p62与LAMP2或SGK2的共染色表明，在GSK650394处理的细胞中，LAMP2和SGK2都共定位在自噬泡的膜上（图S7a，b）。总的来说，收集到的数据表明，SGK2抑制通过酸性细胞区室的改变诱导AVd的积累，但对自噬体/溶酶体融合或溶酶体通透性没有影响。
共聚焦显微镜免疫荧光分析的代表性图片，用于评估LAMP2在未经处理或经GSK650394（GSK）处理的MDAH a和TOV21G b细胞中的表达和定位。报告每种情况的缩放区域。细胞核用碘化丙啶染色，并用蓝色假着色（比例尺：9μm）。右边的图报告了每个视野的平均LAMP2荧光强度（每个条件评估的平均细胞数= 90个细胞）。结果表示为相对于未处理的绿色荧光的倍数。共聚焦显微镜免疫荧光分析的代表性图片，评估了LC3（绿色）和LAMP2（红色）在MDAH c和TOV21G d中的表达和定位用GSK650394处理的细胞。如上所示，上面板显示了具有单个和合并通道的代表性最佳聚焦平面。下图显示了在GSK650394处理后液泡中LC3和LAMP2的共同免疫染色的最大投影（左）和xyz投影（右）。比例尺：10μm。图中数据为平均值±SD。显着性使用两尾不成对的学生t检验计算。*** p <0.001，** p <0.01。（也参见图S7）。
接下来，我们从生物化学的角度探讨了SGK2抑制作用是否会影响溶酶体活性。对GSK650394处理的MDAH和TOV21G细胞进行时程分析清楚地表明，溶酶体蛋白酶组织蛋白酶D，-L和-B的激活以时间依赖的方式受到损害，导致其非活性形式的积累（图1和图2）。 。7A和S8A）。失活的组织蛋白酶的积累伴随着LAMP2，p62和LC3II的上调（图7a）。尽管修饰不太明显，但由GSK650394诱导的分子变化在SGK2沉默的细胞中大多得以概括（图7b）。）。最后，在OVCAR8细胞中SGK2的过表达降低了p62和LC3II的表达模式，并增加了组织蛋白酶D的表达（图S8b）。
WB分析LMD2，p62，组织蛋白酶D（CTSD）和LC3I / LC3II在指定时间a或沉默SGK2表达b的 GSK650394 35μM（GSK）处理的MDAH和TOV21G细胞的细胞裂解液中的表达。GRB2被用作加载控件。C在未用GSK650394或35μMGSK650394处理过的MDAH细胞中，内源性ATP6V1H与SGK2和ATP6V0A3进行共免疫沉淀（IP）分析16和24小时。探测用ATP6V1H免疫沉淀的细胞裂解液中ATP6V1H，SGK2和ATP6V0A3的表达。左侧报告了三种蛋白质在相应裂解物中的表达（INPUT）。右图显示了在GSK处理的细胞中与ATP6V1H结合的SGK2和ATP6V0A3的定量，以未处理细胞的倍数表示，代表三个独立实验的平均值±SD。显着性使用两尾不成对的学生t检验计算。*** p <0.001，* p <0.05。d稳定过表达SGK2的OVCAR8细胞中内源性ATP6V1H与SGK2和ATP6V0A3的共免疫沉淀（IP）分析。探测用ATP6V1H免疫沉淀的细胞裂解液中ATP6V1H，SGK2和ATP6V0A3的表达。报道了三种蛋白在相应的裂解物中的表达（INPUT）。下图显示了在SGK2过表达细胞中与ATP6V1H结合的ATP6V0A3的定量，其表达量是用空载体（ev）转染的细胞的倍数。Ë使用SGK2活性重组蛋白与从未经处理和经CBDCA处理的MDAH细胞中免疫沉淀的内源性ATP6V1H（500μg/ ml 16 h）进行体外激酶测定（上图）（下图）。报道了每行（1-5）和相应的裂解物（INPUT）中使用的免疫沉淀的ATP6V1H蛋白的1/10的蛋白质印迹分析（下图）。Vinculin在c – e中用作负载控制。IgG表示具有无关抗体的裂解物IP。（也参见图S8）。
所有的生物化学和生物学收集到的结果（图5 - 7）建议，晚期自噬泡（AVD）的结果累积SGK2遗传或药理学抑制受损自溶酶体酸化和退化的能力。由于溶酶体酸化取决于液泡H的活性+ -ATP酶质子泵（V-ATP酶）[ 49 ]和SGK蛋白能够调节不同ATP酶[ 50，51]，我们假设抑制SGK2可以改变该质子泵的活性。在计算机分析中预测，SGK2可以磷酸化分别属于V-ATPase的V1和V0域的V1H和V0A3亚基中的多个丝氨酸和苏氨酸残基（图S8c）。我们通过测试SGK2是否可以与任何这些亚基相互作用来探索这种可能性。通过免疫沉淀分析，我们观察到内源性SGK2与ATP6V1H共沉淀，并且该相互作用被GSK650394抑制剂处理以时间依赖的方式削弱（图7c和S8d）。此外，GSK650394处理影响了ATPase复合物，因为它也损害了ATP6V0A3与ATP6V1H的共沉淀。这些观察结果通过在OVCAR8细胞中过表达SGK2而得到证实，其中SGK2与ATP6V1H和ATP6V0A3亚基共沉淀，并增加了两个V-ATPase亚基之间的结合（图7d）。这些证据表明与V-ATP酶即SGK2相互作用能够直接向其活性有助于，由于可逆组装/拆卸其V0和V1扇区代表的V-ATP酶泵功能[重要的调节机构52，53 ]。接下来，我们试图在体外激酶测定中使用重组SGK2蛋白来验证SGK2是否可以磷酸化免疫沉淀的ATP6V1H亚基（图。7e）。这些测定揭示了SGK2磷酸化了从未经处理的和经铂处理的EOC细胞中的体外ATP6V1H亚基的免疫沉淀。重要的是，GSK650394抑制剂损害了ATP6V1H的SGK2依赖性磷酸化（图7e）。有趣的是，SGK2经历了特定的自磷酸化作用（图7e和S8e），据我们所知，之前没有进行过描述。当SGK2-GST仅在体外与γP32ATP一起孵育而它不磷酸化用作对照的GST-Rb片段时，也通过放射性信号的存在指出了这一事件（图S8e）。
收集的数据表明，SGK2通过确保正确的溶酶体酸化来控制自噬通量。自噬已被描述为在肿瘤细胞中促存活响应于化疗药物，和自体吞噬的损害可能代表一种新的治疗策略，以提高化疗的功效和/或克服化疗耐药[发作54，55，56，57，58 ]。为了验证自噬是否与所用模型的PT反应有关，我们首先用剂量增加的CBDCA处理MDAH细胞长达48小时，并观察到以时间和剂量依赖性刺激自噬，其特征是p62清除率增加，LC3 I / II比值和组织蛋白酶D活性形式（图8a）。有趣的是，在乳腺癌和头颈癌细胞中也证实了CBDCA自噬诱导，这是通过Western印迹分析中p62的表达减少所揭示的（图S9a）。
WB分析在指示的时间内用递增剂量的CBDCA处理的MDAH细胞a或对照和SGK2过表达的OVCAR8细胞b中的p62，组织蛋白酶D（CTSD）和LC3I / LC3II表达。c WB分析超表达SGK2 WT，DN和KD突变体的TOV21G细胞中的自噬标记，如a和b所示处理16 h。GRB2 a或Vinculin b，c被用作加载对照。dSGK2在调节EOC细胞的铂敏感性中可能发挥的作用的示意图。铂治疗诱导自噬反应作为生存途径，其中SGK2充当自噬刺激剂。在表达SGK2的细胞中，SGK2通过与溶酶体V-ATPase质子泵相互作用，确保维持溶酶体酶的激活/成熟所必需的正确的酸性pH（左图）。沉默或化学抑制SGK2会导致V-ATPase分解，溶酶体降解能力受损以及随之而来的自噬通量的抑制，并伴随着巨大的自噬体的积累（在细胞内部，右图）。自噬抑制最终导致EOC细胞对铂处理的敏感性增加，细胞死亡增加（右图）。
我们还研究了在退出治疗后24和36 h的自噬和凋亡标记，它们代表了我们观察到GSK650394 + CBDCA导致细胞死亡增加的时间（图S9b中的释放）。与生物学数据完全一致，我们观察到在用GSK650394 + CBDCA处理的细胞中，自噬的调节先于凋亡标志物的出现（即，裂解的PARP-1和caspase-9），这表明联合治疗可通过损害而诱导细胞死亡增加自噬并因此诱导凋亡。
为了更好地剖析分子事件，我们观察到OVCAR8细胞中SGK2的稳定过表达（导致PT耐药性增加）（图1e）也增加了自噬作用，p62的清除率更高，LC3 I / II比值倒置和活性组织蛋白酶D的显着增加（图8b）。
接下来，通过在TOV21G中过表达SGK2 WT，KD和DN构建体，我们观察到WT蛋白已经以100μg/ ml CBDCA的低剂量诱导了p62和LC3的快速下调，而DN突变体可能诱导了p62的持续表达由于自噬的阻滞（图8c）。如所预期的，相对于用空载体转染的TOV21G亲本细胞，SGK2KD的表达没有诱导任何显着差异（图8c）。
迄今为止收集的数据表明，在EOC细胞中，CBDCA处理诱导自噬是一种由SGK2激酶活性维持的存活机制。因此，通过在存在或不存在GSK的情况下用增加剂量的CBDCA处理MDAH细胞，我们观察到用GSK650394 + CBDCA处理的细胞中CBDCA诱导的自噬逆转。通过延迟的p62清除和反转比LC3I / II证明了这种反转（图S10a）。
接下来，我们问自噬的诱导是否通常由治疗EOC的其他化学疗法诱导，并测试了紫杉醇对MDAH细胞中p62和LC3表达的影响。剂量和时间响应曲线表明，紫杉醇在36小时内未引起其表达的任何改变（图S10b）。因此，GSK650394对SGK2的抑制作用不影响紫杉醇诱导的MDAH细胞死亡（图S10c），总体上支持SGK2激酶活性通过调节自噬保护PT诱导的死亡保护癌细胞的假说。
最后，通过询问Oncomine [ 59，60 ]（http://www.oncomine.org我们发现）的数据集即SGK2不仅过表达，而且在EOC的一个子集扩增与正常组织相比（图S11a中-C ），表明它可能在人类病理学中起作用。
从无偏见的功能丧失筛选开始，该筛选将SGK2确定为EOC细胞中PT敏感性的可药物调节剂，我们表征了这种研究不足的激酶在自噬控制中的作用，自噬是一种由癌细胞激活的逃避策略，可以在自噬下存活PT治疗。我们证明了SGK2的遗传或药理抑制作用可以在体外阻断PT刺激的自噬过程的诱导，最终增加PT诱导的细胞死亡。
众所周知，癌细胞中的自噬反应在一个高度动态的网络中起作用，该网络不仅影响细胞内稳态维持，还影响复杂的过程[ 57 ]。在这个意义上，自噬网络起着参与在肿瘤抑制和肿瘤促进[似是而非依赖于上下文的角色58，61 ]。一些证据指出，自体吞噬在癌症发展到化疗耐药的能力的潜在作用，这表明自噬在对治疗的反应[产生重大影响62，63]。在这里，我们报道在EOC细胞中，具有多种作用机制的化学疗法（CBDCA与紫杉酚）对自噬诱导的影响不同，进一步证实了自噬在癌症中的背景依赖性作用。
自噬是一种高度保守的动态分解代谢过程，涉及形成称为自噬体的双膜囊泡，该囊泡吞噬细胞蛋白和细胞器以传递至溶酶体。当自噬体与溶酶体融合时，其含量会降低，大分子前体将被回收或用于促进代谢途径[ 55]。将特异性底物靶向自噬体的衔接子蛋白p62和LC3II与其他货物蛋白一起降解，可用作自噬通量的量度。出现更多的自噬元素（即自噬体或溶酶体）并不一定意味着更多的自噬。实际上，在许多情况下，自噬体可能由于向溶酶体的运输障碍而积累，而自噬体生物发生没有任何变化，而自溶体的增加可能表明降解活性降低。从这个意义上讲，溶酶体消化是自噬的一个阶段，对其能力的分析是评估自噬通量或完全自噬的基础[ 42]]。溶酶体的特征在于高酸性pH，这为其蛋白水解酶（例如组织蛋白酶）的活性提供了最佳条件[ 49 ]。溶酶体pH梯度主要产生并通过V-ATP酶，多亚基蛋白复合物水解ATP泵质子进入溶酶体[维持52，53 ]。
在这种情况下，我们的数据表明SGK2的遗传或药理抑制作用诱导了自噬体的积累，特别是巨大的自溶酶体的积累，并伴有无活性的组织蛋白酶的积累[ 64 ]。我们建议，SGK2激酶活性可能通过ATP6V1H亚基的磷酸化在激活V-ATPase从而促进该质子泵的V0V1区段装配中起作用。我们观察到SGK2在体外激酶测定中能够磷酸化ATP6V1H（图7c），并假设在细胞内也可能发生这种情况，因为对MDAH细胞进行GSK650394处理会削弱SGK2-ATP6V1H / V0A3的相互作用。但是，进一步的实验应证实这种可能性。我们的证据也支持SGK2抑制促进ATPase分解，降低其维持酸性溶酶体pH的活性以实现最佳蛋白酶成熟/活性的可能性。抑制SGK2后组织蛋白酶的活化受损，然后降低了溶酶体降解能力，并随之积累了自身溶酶体并抑制了自噬通量（图8d）。）。值得注意的是，用GSK650394抑制SGK2的药理作用比沉默基因更好。这种部分差异可能是由于使用shRNA技术可实现的SGK2蛋白不完全敲除或GSK650394分子可能的脱靶作用。未来使用不同分子方法的工作可能有助于剖析这两种可能性。
在与我们的结果相一致，最近的作品报道，沉默V-ATP酶质子泵的不同亚基分别为[增强了紫杉醇和铂类药物毒性宫颈癌和卵巢癌，65，66 ]。这些证据支持基于质子泵抑制剂药物重新定位的新抗癌策略的想法[ 67 ]。
有趣的是，尽管SGK2抑制作用在未经处理和经紫杉醇处理的细胞中也能短暂阻断自噬，但这种阻断作用不会对正常或癌细胞产生毒性作用，因此支持SGK2抑制在PT诱导的反应中起特定作用死亡。但是，我们想指出的是，SGK2与其家族中的其他成员一样，可能直接参与了其他细胞途径的调控，例如细胞增殖和凋亡，这在我们这里没有进行研究，这也可能有助于其对CDK2的调控。 PT敏感性。
总体而言，我们在这里报告了SGK2激酶通过抑制自噬而在不同类型的癌症中控制PT诱导的细胞死亡的新作用。SGK家族的其他两个成员在EOC细胞中似乎没有共同承担这一角色，尽管有必要进行更多的研究，其中可能涉及使用CRISPR技术敲除该家族的不同成员，以明确证实这一发现。作为SGK2，一种可药物化的激酶，已在EOC的一个亚型中扩增，目前已经有抑制剂可用，我们的发现也可能具有直接的翻译相关性，以改善PT可治疗的表达SGK2的癌症患者的治疗和/或生活质量。
我们的机构生物库已经收集了样本并获得了所有患者的知情同意。内部审查委员会批准了这项研究（＃IRB-06 / 2011和IRB-05-2014）。
MDAH-2774，SKOV3，TOV112D，TOV21G，OV90，MDAH-MB-468，BT-549，FaDu，CAL27和293T17细胞购自ATCC; 来自NCI的OVCAR8；来自ABM的永生化人卵巢上皮细胞（HuNoEOC）；ECACC的COV318；Invitrogen的293FT。新鲜的肿瘤标本用于产生原代EOC培养物。
卡铂（CBDCA），顺铂（CDDP）和紫杉醇（TEVA Italia）用于体外实验。GSK650394是购自Tocris Bioscience（3572）的SGK1 / SGK2激酶抑制剂。巴菲洛霉素A和A啶橙购自Sigma-Aldrich Co，L-亮氨酰-L-亮氨酸甲酯（LLOMe）购自Santa Cruz（表S1）。
pDONR223 SGK2是William Hahn＆David Root的礼物（Addgene质粒＃23378），它被用于通过使用pEGFP-C1载体（Clontech）和pLPC SGK2载体（由Dr温和提供）来生成pEGFP SGK2载体。 R. Maestro（CRO阿维亚诺）定点诱变用于通过QuikChange定点诱变试剂盒生成SGK2 DN（SGK2 T193A / S356A）突变体，SGK2 CA（SGK2 S356D）突变体和SGK2激酶死亡（KD）（SGK2 K64M）（表S1中列出的引物）。 （安捷伦）。mRFP-EGFP-LC3是Tamotsu Yoshimori的礼物（Addgene质粒＃21074）。pLKO shRNA购自Sigma-Aldrich Co，并在表S1中列出。
将细胞接种到96孔培养板中，转导后72小时或抑制剂处理后24小时后，将细胞用含指示剂或CBDCA / CDDP的正常生长培养基按所示浓度处理16小时。治疗结束后24小时，使用CellTiter 96 AQueous细胞增殖测定试剂盒（Promega）评估细胞活力。对于每种实验条件，对这些实验进行了3次重复3次生物学重复的实验。数据在某些实验中以492 nm处的Abs值表示，在另一些实验中以活细胞相对于未处理细胞的百分比表示（设置为100％作为参考值），如图中的图例所示。在所有情况下，数据均代表平均值±SD。
使用冷RIPA裂解缓冲液（150 mM NaCl，50 mM Tris HCl [ph8]，1％Igepal，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS）和蛋白酶抑制剂混合物（Complete，Roche）制备细胞裂解物， 1 mM原钒酸钠和1 mM二硫苏糖醇，如先前报道[ 68]。使用Bio-Rad蛋白质测定法（Bio-Rad）确定蛋白质浓度。对于免疫印迹，通过4–20％SDS-PAGE（Criterion预制凝胶； Bio-Rad）分离等浓度的蛋白质样品（60μg），并转移到硝酸纤维素膜（Hybond C； Amersham）或PVDF（Bio-Rad）膜上。使用补充有蛋白酶抑制剂加2μg所示特异性一抗的HNTG缓冲液（20 mM HEPES，150 mM NaCl，10％甘油，0.1％Triton X-100）中的1 mg细胞裂解液进行免疫沉淀，并于4孵育过夜℃。通过与蛋白A和G珠（GE Healthcare）在4°C下温育2小时来捕获免疫复合物，用HNTG缓冲液洗涤，在3X样品缓冲液中洗脱，并在SDS-PAGE上分离以进行蛋白质印迹分析。使用以下第一抗体进行了免疫印迹：兔单克隆抗SGK2（1：500），兔单克隆抗SGK3（1：500），兔单克隆LC3B（1：500），来自Cell Signaling Technology的兔多克隆抗Caspase 9（1：500）和兔多克隆LC3B （1：10000）来自Novus Biological；小鼠单克隆抗Vinculin（1：1000），小鼠单克隆抗LAMP2（1：200），小鼠单克隆抗SGK1（1：200），小鼠单克隆抗V-ATPase H（ATP6V1H）（1：200），从圣克鲁斯生物技术公司购买；来自Sigma Aldrich Co的小鼠多克隆抗SGK2（用于IP）和小鼠单克隆抗组织蛋白酶D（1：500）；来自Abcam的兔单克隆抗p62（1：20000）和兔多克隆抗TCIRG1 / ATP6V0A3（1：500）；来自Elabscience的兔多克隆抗组织蛋白酶L（1：500）和兔多抗组织蛋白酶B（1：500）；BD Biosciences的小鼠单克隆抗GST（1.500）；小鼠抗GRB2（1：500），来自Transduction Lab；Roche的小鼠单克隆抗GFP（1：500）。使用合适的辣根过氧化物酶偶联的二抗（GE Healthcare）进行ECL检测（Bio-Rad）或使用Alexa偶联的二抗（Invitrogen）进行奥德赛红外检测（LI-COR Biosciences）观察抗体。
通过将SGK2活性激酶（Signal Chem）与从未经处理和经CBDCA处理的MDAH细胞（CBDCA 500μg/ ml，16 h）或Rb1-GST重组蛋白作为底物免疫沉淀的内源性ATP6V1H孵育30分钟来进行体外激酶测定在的γ1.5微居里的存在下30℃下32 P-ATP（PerkinElmer）中，如前所述[ 69 ]。
如先前所述[ 68 ] 进行了qRT-PCR分析。简而言之，使用Trizol试剂（Invitrogen）提取总RNA，使用NanoDrop（Thermo Fisher Scientific Inc.，美国）进行定量，并使用AMV逆转录酶（Promega）进行逆转录。使用SsoFast EvaGreen Supermix（Biorad）和CFX96 TM实时PCR检测系统（Bio-Rad）扩增cDNA。使用SGK2 /管家基因作为SQ均值标准化SGK2表达。使用CFX96 TM软件（Bio-Rad）计算SQ（起始数量）。
对于免疫荧光，将铺在盖玻片上并固定在PBS 4％多聚甲醛（PFA）中的细胞用一抗染色，例如SGK2（1：400）和LAMP2（1：200）（Santa Cruz Biotechnologies），LC3B（1：200） （Cell Signaling），LGALS1（1：1000）（Abcam）和p62（1：200）（Abcam）。碘化丙啶（5微克/毫升）用于核染色作为报道[ 38，70 ]。对于a啶橙染色，在图像采集之前，将细胞与37啶橙溶液（Sigma-Aldrich Co）在37°C孵育30分钟。将细胞用37 µC的Bafilomycin A 0.2 µM处理30分钟作为对照。使用共聚焦激光扫描显微镜（TCS SP8 Leica）分析染色的细胞。使用Volocity®软件（PerkinElmer）研究了荧光强度和蛋白质共定位（另请参见补充材料和方法）。
统计显着性（p <0.05），平均值，标准偏差，95％置信区间（CIs）使用GraphPad PRISM软件（版本6.0），使用最合适的测试确定，如每个图所示。统计学显着性表示为：* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001，**** p <0.0001
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