中央记忆的分化决定了CAR-T细胞的持久性，这与临床治疗效果密切相关。公认的是，4-1BB共刺激优于CD28，以促进中枢记忆分化和CAR-T细胞的持久性。[1]然而，也注意到具有共同刺激作用的CAR-T细胞具有相当的分化能力和持久性，2尤其是在免疫抑制条件下。导致差异的因素仍然未知。越来越多的证据表明，程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）在PD-L1参与时直接影响T细胞的记忆分化3除了限制扩散。尚不清楚PD-1是否参与了不同共刺激的CAR-T细胞之间的记忆分化和持久性差异的减小。在本文中，我们研究了PD-1激活与否时CAR-T细胞的记忆分化，以及因此的持久性和抗肿瘤作用。
CD8 + T细胞由于对恶性细胞具有直接的细胞毒性而用于本研究。如图1a和补充图1a所示，使用对间皮素特异的人源抗体产生了掺入CD28（28ζ）或4-1BB（BBζ）共刺激的CD8 + CAR-T细胞。CAR-T细胞表现出强效的抗原依赖性细胞毒性（图1b，c和补充图1b）。与28ζ细胞相比，BBζ细胞更好地保留了中央记忆亚群（CD45RA - CD62L +），并在体外扩增过程中表现出改善的持久性（P <0.05；补充图1c，d）。这些结果表明4-1BB共刺激的基础活性促进中央记忆分化和CAR-T细胞的持久性。
PD-1减弱了4-1BB共刺激的CD8 + CAR-T细胞在中央记忆积累和长期抗肿瘤作用方面的优势。a – c CD8 + CAR-T细胞的构建和表征。28ζ和BBζCAR（a）的结构。将CD8 +未转导（UTD），28ζ和BBζT细胞与目标细胞以指定的E：T比率孵育24小时，然后根据生物发光（BLI）强度确定目标细胞的生存力（b）。将肿瘤细胞与列出的T细胞在E：T = 1：1孵育24小时，然后收集上清液，并进行ELISA测定IFN-γ和IL-2的分泌（c）。d – g激活诱导的CD8 + CAR-T细胞的记忆分化和PD-1表达。将表达荧光素酶的HeLa细胞贴壁过夜，然后以E：T = 1:10加入纯化的CD8 + CAR-T细胞，而没有外源细胞因子。CAR-T细胞测定的分化状态和幼稚的比率（T 朴素状 ; CD45RA + CD62L +），中枢记忆（T CM ; CD45RA - CD62L +），效应记忆（T EM ; CD45RA - CD62L - ）和最有区别的T（T EMRA ; CD45RA +CD62L - ）细胞在第0天，第3进行比较，和7后共孵育（d）。在第0、3和7天确定CAR-T细胞的扩增。在指定的时间点，收集悬浮细胞，并通过台盼蓝染色排除死细胞。然后计数活细胞，并与第0天（e）的28ζ细胞的活细胞进行比较。通过BLI分析（f）监测CAR-T细胞的长期杀肿瘤活性。在第0、3和7天，收集CAR-T细胞，并使用FACS（g）测定PD-1表达。h – j PD-1阻滞增加了T cm子集和CD8 +的持久性CAR-T细胞。将表达荧光素酶的HeLa细胞粘附在孔表面过夜，然后以E：T = 1:10加入纯化的CD8 + CAR-T细胞，而没有外源细胞因子。在第0、3和6天以20μg/ mL的浓度重复添加IgG和抗PD-1抗体。孵育后第7天，收集CAR-T细胞并确定其分化状态（h）。在第0、3和7天测定CAR-T细胞增殖并进行比较（i）。通过BLI分析监测肿瘤细胞的增殖并进行统计学分析（j）。k，l PD-1阻滞增强CD8 +的中枢记忆分化体内CAR-T细胞。将HeLa细胞皮下接种到SCID-Beige小鼠中。十天后，通过尾静脉注射5×10 6 CD8 + CAR-T细胞，并每3天腹腔注射四次所指示的抗体（ 每组n = 3）。在CAR-T细胞输注后第5天和第14天，分离肿瘤组织，并制备单细胞悬液。使用Fixable Viability Dye eFluor™660排除死细胞后，确定接受非特异性IgG或抗PD-1中和抗体的小鼠之间CAR-T细胞的分化状态（k）和肿瘤内累积（l）。米，ÑPD-1阻滞剂改善了体内CD8 + CAR-T细胞的抗肿瘤作用。已 建立异种移植瘤的小鼠（每组n = 6）在第0天注射5×10 6 CD8 + UTD或CAR-T细胞，在T细胞注射后每3天注射IgG或抗PD-1抗体6次输液。T细胞注射后每3天计算一次肿瘤体积（m）。并证明了不同处理小鼠的存活曲线（n）。表示为平均值±SD的数据代表从至少三个健康供体收集的关于CAR-T细胞的三个独立实验。使用t进行统计分析测试或方差分析。使用对数秩检验比较小鼠之间的存活率差异。P值 <0.05被认为具有统计学意义。* P <0.05；** P <0.01；*** P <0.005
接下来，我们纯化了CAR-T细胞（补充图2），并分析了它们与靶细胞结合后的持久性和分化。比较而言，具有不同共刺激的CAR-T细胞被激活（补充图3a，b）。一致地，一项关于间皮素特异性CAR-T细胞的研究指出，共同刺激对工程化T细胞的直接细胞毒性影响很小。4与28ζ对应物相比，激活的BBζ细胞没有显示出优越的中央记忆富集，持久性和杀肿瘤活性（图1d–f）。但是，先前的研究表明，当CAR-T细胞被抗原包被的磁珠激活时，4-1BB共刺激保留了增强中央记忆积累和持久性的能力。1与珠子不同，肿瘤细胞可以响应干扰素-γ（IFN-γ）表达PD-L1。实际上，在共培养系统中在肿瘤细胞中高度诱导了PD-L1（补充图 3c）。同时，PD-1在CAR-T细胞中被上调，但其水平在CD8 + 28ζ和BBζ细胞之间没有显着差异（图 1g）。据报道，共刺激对CD8 + CAR-T细胞中PD-1的表达影响很小，[ 4]并且PD-1可以诱导T细胞的终末分化。3因此，我们想知道PD-1是否与受损的中央记忆分化和BBζ细胞的持久性有关。
为了解决这个问题，PD-1被特异性抗体阻断。通过PD-1阻滞类似地改善了两种刺激共同作用下CAR-T细胞的细胞毒性（P <0.05；补充图4a，b）。但是，通过PD-1阻滞，BBζ细胞的中枢记忆分化比28ζ对应物显着增强（P <0.01；图1h）。相应地，PD-1阻断后，BBζ细胞的长期积累和杀伤作用比28ζ细胞更好（P <0.05；图1i，j）。）。为了进一步测试由PD-L1诱导的PD-1信号转导对记忆分化的影响，将CAR-T细胞与具有高或可忽略的PD-L1表达的带前缀肿瘤细胞共培养（补充图5a）。如补充图5b所示，在具有非常低的PD-L1表达的肿瘤细胞的延长的共培养物中，BBζ细胞表现出增强的中央记忆分化能力和长期积累性（P <0.05）。但是，当存在PD-L1时，28ζ和BBζ细胞之间分化和持久性的差异可以忽略不计（补充图5b，c）。这些结果表明，在PD-L1参与下，PD-1限制了中央记忆的分化，并降低了BBζ细胞的持久性。氧化磷酸化（OXPHOS）过程是CAR-T细胞中枢记忆分化的决定因素。1注意到当PD-1被激活时，BBζ细胞的特权OXPHOS电位被消除了（补充图6a）。进一步的分析表明，无论是否存在共信号和PD-1阻滞，OXPHOS被抑制时，CAR-T细胞的中央记忆富集和持久性均显着降低（P <0.05；补充图6b，c），表明PD-1通过下调CAR-T细胞的OXPHOS直接抑制中枢记忆分化。这些发现进一步表明，在4-1BB共刺激的CAR-T细胞中增强的中央记忆分化和持久性的丧失不是由于持续激活，而是PD-1 / PD-L1轴介导的抑制作用的结果。与我们的发现一致，PD-1或PD-L1阻滞剂被发现可有效诱导小鼠病毒感染期间早期谱系的增加和CD8 + T细胞的扩增。3
接下来，我们进行了CAR-T细胞的体内分析。在异种移植肿瘤中，发现CAR-T细胞被有效激活（补充图7a），而在CAR-T细胞和肿瘤细胞中分别诱导了PD-1和PD-L1水平（补充图7b和8）。 。PD-1表达水平在28ζ和BBζ细胞之间相似（补充图7b）。正如预期的那样，在用非特异性抗体治疗的小鼠中激活PD-1时，带有CD28或4-1BB共刺激的CAR-T细胞的记忆分化，积累和抗肿瘤功能是无法区分的（图1k–n）。用中和抗体阻断PD-1后（补充图7b）），与在非特异性IgG抗体治疗的小鼠中观察到的相比，CAR-T细胞的中央记忆极化和积累得到了改善（P <0.05；图1k，1）。此外，与体外研究结果一致，PD-1阻断后，BBζ细胞的体内中央记忆极化和持久性比28ζ细胞的增强（P <0.05；图1k，1）。因此，尽管PD-1阻断后两个CAR-T细胞之间的细胞毒性活性相似，但相对于28ζ细胞，BBζ细胞显着延迟了肿瘤生长并延长了小鼠的存活率（P <0.05；图1m，n）（补充图7a）。 。
临床前和临床研究已经指出，4-1BB共刺激不一定超过由CD28体内，诱发延伸CAR-T细胞的持久性2，4即使它促进了工程改造的细胞的中央存储器分化和扩展体外。1对间皮素特异性CAR-T细胞的研究表明，在体外条件下，与CD28共同刺激的CAR-T细胞相比，具有4-1BB共刺激的CAR-T细胞表现出延长的持久性，而在免疫抑制性肿瘤微环境中则没有。 。1，4同样，对CD19定向的CAR-T细胞治疗Nalm-6异种移植肿瘤的研究表明，与4-1BB共刺激相比，具有4-1BB共刺激的CAR-T细胞在体内具有更好的持久性，而对CD28共同刺激的免疫抑制性较低。血液，但不能抑制骨髓。5这些研究表明，免疫抑制在减少对不同共刺激反应的CAR-T细胞的记忆分化和持久性方面起着至关重要的作用。我们的研究表明，PD-1诱导的中枢记忆分化抑制如何损害CAR-T细胞的持久性和抗肿瘤作用。PD-1阻滞剂可以恢复在结合4-1BB的CAR-T细胞中观察到的优势，包括中枢记忆维持，体内持久性和长期抗肿瘤作用。降低PD-1水平的几种方法已经在CAR-T细胞疗法中进行了测试。4因此，PD-1阻断剂和CAR-T细胞与4-1BB共刺激的组合可能潜在地导致更好的治疗反应。
|
|
