这项研究比较了原发性胃癌（PGC）和配对转移性胃癌（MGC）的肿瘤免疫微环境（TIMEs）。通过多重免疫组织化学评估CD4 +和CD8 + T细胞密度和PD-L1表达，通过免疫组织化学评估DNA错配修复（MMR），并通过RNA测序评估免疫相关基因。本研究纳入了接受PGC和MGC手术治疗的23例患者。CD8 + T细胞，PD-L1 +细胞和PD-L1 + CK +MGC中的细胞密度显着低于PGC。分别在52.2％和8.7％的PGC样本中观察到结合阳性评分（≥1％）和MMR不足的PD-L1阳性，而在MGC样本中均仅出现PD-L1阳性。PGC中最常见的TIME类型是发炎（34.8％）和适应性免疫抵抗（34.8％），MGC中是免疫沙漠（65.2％）和免疫学无知（73.9％）。在转录组分析中，与PGC相比，MGC中T细胞发炎基因集和共刺激基因模块的表达下调。总的CD8 + T细胞密度是PGC和MGC的独立预后指标（单变量P = 0.002，多变量P = 0.006）。我们的结果表明，与胃癌患者的原发性肿瘤相比，转移性肿瘤的TIME具有较低的免疫活性。
姑息全身治疗的患者的初级治疗选择转移性胃癌（MGC），以减轻疾病相关症状，提高生存率1，2。然而，MGC的预后仍然很差，与<2年生存率1，2。最近，免疫检查点抑制剂（ICIs），例如抗程序性细胞死亡1（PD-1）和抗程序性死亡配体1（PD-L1），彻底改变了许多晚期实体瘤的全身治疗范式3。抗PD-1抗体，如nivolumab和pembrolizumab，有显著的利益和患者提供新的治疗选择以前治疗MGC 4，5，6。然而，在患者的先前治疗MGC的总反应率的抗PD-1抗体是低（5-25％），并且大多数患者不响应这些ICI不变4，5，6。尽管尚无抗PD-1或PD-L1抗体的确切预测生物标志物，但已提出PD-L1表达，DNA错配修复（MMR）和爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）状态作为ICI反应的预测生物标志物在MGC患者中7。此外，高的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）水平已被报告为有利的预后生物标志物和免疫治疗的预测显著8，9，10。
抗PD-1治疗是针对曾经接受过细胞毒或分子靶向治疗的MGC患者的转移性疾病的全身治疗。开始抗PD-1治疗之前，需要对转移性肿瘤中免疫相关生物标记物进行全面评估。然而，转移性病变的再活检在临床实践中并不总是可行的，并且由于侵入性程序可能导致不愉快的并发症。因此，MGC的免疫相关生物标记物的评估是基于复发性根治性胃切除术中获得的原发性胃癌（PGC）标本的肿瘤免疫微环境（TIME）或姑息性全身性胃癌在初诊时获得的PGC标本。治疗。由于肿瘤内（IT）或肿瘤间分子异质性，转移或疾病进展过程中的免疫逃逸以及先前治疗的全身作用，转移肿瘤的TIME可能与原发肿瘤的TIME不同，因此PGC标本可能无法准确反映TIME的时间。 MGC。但是，以前没有报告评估MGC标本中的免疫相关生物标志物。
在这项研究中，我们比较了原发性和成对转移性胃癌的时间，包括T细胞密度，PD-L1表达，MMR状态，EBV阳性和免疫相关基因表达。我们还评估了胃癌患者原发性和转移性肿瘤中浸润性T细胞对预后的影响。
在2009年1月至2019年5月之间，我们筛选了120例经病理证实的胃腺癌原发灶及相应转移灶的病理数据库。在这些患者中，有23例接受了PGC和MGC手术治疗的患者入选（补充图。 1）。患者的临床病理特征见表1。手术切除的转移部位为肝脏（n = 6，26.1％），腹壁或皮肤（n = 5，21.7％），卵巢（n = 4，17.4％）以及其他各种转移部位，包括胆囊，肺，远处淋巴结，骨，腹膜或阑尾（n = 8、34.8％）。在23例患者中，只有7例（30.4％）在最初诊断为胃癌时患有IV期疾病，并接受了包括胃切除术和MGC切除术在内的同时切除。16例（69.6％）发生异时转移并在胃切除术后6个月或更长时间接受分期切除术，包括胃切除术和MGC切除术。这16例患者的中位无病生存时间为21.0个月，胃切除与MGC切除之间的持续时间为23.1个月。此外，这16例患者中有5例在MGC切除之前接受了全身化疗。
表2显示了PGC和MGC之间的PD-L1阳性，MMR状态和EBV阳性的比较。使用1％的综合阳性评分（CPS）临界值，PD-L1阳性的PGC病例为52.2％（12/23），MGC病例为4.3％（1/23）。与配对的MGC（4.3％，1/23）相比，PGC（8.7％，2/23）中检测到MMM不足（dMMR）的频率更高。其中一名患者患有dMMR的PGC和具有熟练MMR（pMMR）的同步皮肤转移性肿瘤（补充图 2）。在23名患者的46个PGC和MGC标本中未检测到EBV。
补充表1中显示了PGC和MGC中的T细胞密度和PD-L1表达。MGC（44.5±71.0细胞/视野）的IT和浸润边缘（IM）区域的CD4 + T细胞密度低于PGC（62.2±60.2细胞/视野），但差异不显着（P = 0.200 ；图 1a）。MGC（35.5±52.8个细胞/场）中IT和IM区域的CD8 + T细胞密度显着低于PGC（79.6±73.1个细胞/场；P = 0.046；图 1a），PD- L1 +细胞密度（6.2±18.6细胞/视野vs. 77.5±154.0细胞/视野; P = 0.010;图 1 b）。PD-L1 +CK +在IT和IM区域细胞密度也显著在MGC降低（4.5±13.3个细胞/场）中比在PGC（58.8±114.7细胞/场; P = 0.001;图 1个 B）。观察到胃切除和MGC切除（图之间的持续时间的在MGC的IT和IM区域下的T细胞密度和PD-L1表达无论 1 MGC切除之前c）或全身性治疗开始（图 1 d）。在包括肿瘤周围基质（PS）的三个区域中，T细胞密度和PD-L1表达与IT和IM区域中的T细胞密度和PD-L1表达具有相似的趋势（补充表1）。
PGC和MGC中的肿瘤浸润性T细胞密度和PD-L1表达。（a）比较IT和IM区域的CD4 +和CD8 + T细胞密度。（b）在IT和IM区域中PD-L1 +和PD-L1 + CK +细胞密度的比较。（c）根据胃切除术和MGC切除之间的持续时间分析IT和IM区域的T细胞密度和PD-L1表达，以及（d）患者在MGC切除之前是否接受过全身治疗。（e） CD4 +和CD8 + T细胞密度，以及（f） PD-L1 +PD-L1 + CK +细胞密度根据肿瘤部位而定。PGC原发性胃癌，MGC转移性胃癌，IT瘤内，IM浸润边缘，PD-L1编程的死亡配体1，CK细胞角蛋白。使用Wilcoxon符号秩检验进行统计分析（ns不显着； * P <0.05； ** P <0.01； *** P <0.001）。
每个肿瘤的区域比较显示，IM区域的CD4 +和CD8 + T细胞密度高于IT和PS区域（PGC中 CD8 + T细胞密度P = 0.016，CD4 P = 0.008 +在MGC T细胞密度;图 1 e）所示。PD-L1表达倾向于在比IM和PS区域IT区要高，但差异不是在PGC和MGC（图显著 1和 F）。
PGC和MGC标本基于CD8分为三类+肿瘤微环境（补充表内T细胞密度和分布2，图 2一个）11。在34.8％（图中观察到发炎类型 2 b）和26.1％，免疫排斥型在30.4％和8.7％，且在34.8％和65.2％的免疫沙漠类型（图 2 c）中PGC的和成对的MGC标本，分别。
PGC和MGC之间的肿瘤免疫微环境类型比较。（a）比较基于CD8 + T细胞密度的类型以及PGC和MGC之间的分布。（b）具有发炎类型（IT区CD8 + T细胞密度高）的PGC标本的代表性多重IHC图像。（c）具有免疫沙漠类型（IT，IM和PS区域的CD8 + T细胞密度低）的配对MGC标本的代表性多重IHC图像。（d）基于PGC和MGC之间的IT和IM区域中的T细胞密度和PD-L1表达的类型比较。（e）具有自适应免疫抗性类型（高CD4 + + CD8 + T细胞密度和PD-L1阳性）的PGC标本的代表性多重IHC图像。（f）具有免疫学无知类型（低CD4 + + CD8 + T细胞密度和PD-L1阴性）的成对MGC标本的代表性多重IHC图像。PGC原发性胃癌，MGC转移性胃癌，IHC免疫组化，IT肿瘤内，IM浸润边缘，PS肿瘤周围基质，PD-L1编程的死亡配体1，CK细胞角蛋白。
根据TIL密度和PD-L1表达，PGC和MGC标本也分为四类：I型–适应性免疫抵抗，II型–免疫无知，III型–本征诱导和IV型–免疫耐受（补充表2），图 2 d）12。PGC样品具有I型比其他亚型（图的比例较高（34.8％） 2 E）。在成对MGC标本，我们没有发现任何I型例，相比于其它亚型（图型II（73.9％）的比例较高 2 F）。
RNA测序显示，与PGC相比，MGC中共有76个基因显着上调，而443个基因显着下调（图 3a）。与PGC相比，在MGC中下调的免疫相关基因包括与先天免疫应答（即TRIM8，CTSG，CCL11，LILRB2和EIF1AK2），免疫球蛋白结构（即JCHAIN）和T-细胞激活（即TYK2，IL16，HLA-DQA1，CXCL14，TNFSF15和IL7R）。基因本体术语分析显示，与PGC相比，MGC中与活化T细胞的钙调神经磷酸酶核因子（NFAT）和有丝分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）信号传导级联相关的T细胞活化相关基因被下调（图 3 b）。T细胞活化相关基因集的基因集验证分析（GSVA）显示，与PGC相比，MGC中的共刺激分子基因模块减少了（图 3 c）。接下来，我们进行基因集富集分析（GSEA），使用18-基因T细胞发炎基因表达谱（GEP）来预测响应PD-1阻断13，14，发现T细胞发炎GEP在MGC下降相比PGC（图 3 d）。
免疫相关基因表达谱。（a）519个差异表达基因的热图（DEGs；P <0.05，倍数变化> 2）。（b）DEG的基因本体分析。（c）基因组验证分析，以评估与免疫检查点，免疫检查点配体，共刺激分子，共刺激配体和趋化因子有关的基因集的富集。（d）基因集富集分析，以评估18基因T细胞发炎的基因表达谱的富集。PGC原发性胃癌，MGC转移性胃癌，NSE标准化富集评分，GEP基因表达谱。
所有患者的中位总生存期（OS）为16.9个月（95％CI为10.5-23.2个月）。表3总结了根据临床病理特征和肿瘤浸润性T细胞浸润对OS进行的单变量和多变量分析。我们按照每视野中CD8 + T细胞的中位数（50.9个细胞/视野）和每视野中CD4 +和CD8 + T细胞的数量（111.4细胞/视野）将患者分为低和高T细胞密度。PGC和MGC的IT和IM区域。单因素分析显示，PGC中无腹膜转移（P = 0.073），CD4 + + CD8 + T细胞密度 高（P = 0.092）和CD8高 尽管差异不显着，但PGC中的+ T细胞密度（P = 0.068）表现出朝向OS改善的趋势。我们计算了总CD8 +通过求和CD8 T细胞密度+从PGC和MGC肿瘤的T细胞密度为每个病人。高CD8 + T细胞密度患者的中位OS明显长于低CD8 + TIL密度患者（分别为27.3和12.0个月，P = 0.002；图 4）。多变量分析包括倾向于与生存相关的变量（P <0.1），并发现只有总CD8 +T细胞密度是PGC和MGC肿瘤的独立预后因素（危险比[HR] 0.188，95％置信区间[CI] 0.057-0.624，P = 0.006；表3）。
根据PGC和MGC中总CD8 + T细胞密度的总生存期。PGC原发性胃癌，MGC转移性胃癌，OS整体生存。使用Kaplan-Meier方法进行统计分析。
据我们所知，该研究是第一个评估胃癌原发性和成对匹配的转移性肿瘤之间的时间差异的研究。我们发现，在胃癌患者中，转移性肿瘤中与免疫相关的生物标志物，例如T细胞密度，dMMR状态，PD-L1表达和T细胞活化相关的基因标志明显低于原发性肿瘤。 。此外，原发性和转移性肿瘤的高CD8 + T细胞密度与MGC患者的生存期改善有关。
许多以前的研究已经报道在原发性和转移性病灶其它实体肿瘤之间的T细胞浸润和PD-L1表达差异15，16，17，18，19，20。在我们的研究中，PGC具有较高的T细胞密度，尤其是CD8 +T细胞和PD-L1的表达均高于MGC。原发性和转移性肿瘤之间的这些差异可能归因于许多因素，包括转移性肿瘤本身的免疫逃逸机制，原发性和转移性癌组织获取之间的时间间隔以及先前的全身治疗。但是，根据我们的亚组分析，无论MGC切除的时机或MGC切除之前的全身治疗如何，MGC中的T细胞密度和PD-L1表达均低于PGC。因此，TIME的差异可能归因于转移性肿瘤的免疫逃逸机制以及疾病进展或先前治疗期间的选择压力。
近年来，分成几类，已被用于评估免疫状态和预测抗肿瘤反应ICIS的11，12。在我们的研究中，PGC标本的发炎（34.8％），排除（30.4％）和免疫沙漠（34.8％）类型几乎相同，而MGC标本的三分之二（65.2％）由免疫沙漠组成类型。此外，PGC标本比其他亚型具有更高的适应性免疫抵抗类型（34.8％），而MGC标本几乎都是免疫无知类型（73.9％）。两种机制底层PD-L1的上调已经提出了：固有的致癌活化机制，和一个非本征适应性免疫诱导的PD-L1上调继发于由分泌的TIL干扰素γ 12，21。由于大多数胃癌与炎症有关22，PGC中PD-L1的表达可能通过外源性适应性免疫应答而上调。这个假设是由先前的研究显示支持该PD-L1上调可能是从活性的免疫反应，而不是在胃癌和结肠直肠癌新抗原表达的结果反馈23，24，25。然而，我们的结果表明MGC中的T细胞密度低于PGC，而MGC中几乎不存在PD-L1表达。因此，在MGC中，如在PGC中所观察到的，由炎症诱导的淋巴细胞浸润非常少见，并且由于外源性适应性免疫反应很少出现PD-L1表达，从而导致了免疫沙漠和免疫无知类型。
更好地了解MGC和PGC中的TIME可能有助于设计免疫治疗策略，以改善MGC患者的治疗效果。适应性免疫抵抗类型（高TIL密度和PD-L1阳性）最有可能从抗PD-1或PD-L1治疗中受益，而单药抗PD-1或PD-L1方案则很可能不会在免疫学无知类型（低TIL密度和PD-L1阴性）中获得成功12。dMMR /高微卫星不稳定性或高T细胞发炎GEP预测到抗PD-1或PD-L1抗体在多个实体瘤的客观和持久反应7，13，14，26，27。在我们的研究中，MGC的T细胞密度，PD-L1表达，dMMR和T细胞发炎的GEP比PGC更低。因此，尽管存档PGC组织中PD-L1阳性肿瘤，但先前在MGC患者中进行的临床试验中抗PD-1的低应答率可能部分归因于PGC和MGC之间的时间差异。此外，免疫抑制基质，髓样抑制细胞和血管生成的影响表明，IT区的T细胞密度在PGC和MGC中均低于IM区，这阻止了T细胞渗入肿瘤。并抑制T细胞活化。因此，将抗PD-1 /抗PD-L1以外的免疫疗法或化学疗法与分子靶向疗法相结合的联合策略可诱导淋巴细胞浸润，并在MGC患者中有效。28，29，30，31。
许多研究报道，肿瘤浸润淋巴细胞在许多类型的实体瘤预后良好的相关8，9，10。特别地，高的TIL，主要CD8 + T细胞，可在患者中潜在的预后生物标记胃癌8，24，25。虽然很难比较CD8的预后影响+ PGC和MGC之间的T细胞密度，因为只有五例出现MGC与高CD8 + T细胞密度，总CD8 +两个PGC和MGC T细胞密度预测预后比CD8 +更准确仅PGC中的T细胞密度。以前的研究已经报道，在遥远的转移性病灶TIL密度可能是一个预后生物标记17，32。因此，转移性肿瘤的时间应被认为是预测MGC患者预后的重要预后参数。
本研究有一些局限性。首先，这项研究是对有限数量的成对PGC和MGC标本进行的回顾性分析。从MGC患者的转移部位难以获得肿瘤标本。大多数先前的比较原发性和转移性肿瘤之间T-细胞浸润或PD-L1表达研究在结肠直肠癌或肾细胞癌进行23，32，在该转移瘤是提高存活，或者在乳腺癌和非小细胞的标准治疗肺癌，为此重新活检在临床实践建议通知姑息全身治疗方案15，17，19。然而，在MGC患者的常规实践中，很少在转移灶处进行手术切除或再次活检。我们的研究仅包括手术切除的肿瘤组织，以对PGC和MGC中的TIMEs进行准确而全面的比较。因此，即使样本数很小，我们的结果也很有意义。其次，我们无法评估TIL的详细免疫细胞亚群，分化或衰竭状态。因此，需要进行更多的研究，详细研究使用流式细胞仪分析和新鲜组织标本或高保真技术（例如质谱分析和单细胞RNA测序）在原发性和转移性肿瘤之间的TIME差异。第三，我们无法评估原发灶和转移灶中不同时间与肿瘤对免疫治疗反应之间的相关性，这是评估TIME的理由。然而，最近发现，免疫异质性可能导致多灶性肝细胞癌对抗PD-1治疗的不同肿瘤反应33。因此，未来需要进一步的研究来确定TIME异质性与免疫疗法治疗结果之间的关联。
总之，我们认为MGC患者中转移性肿瘤的TIME免疫活性低于原发性肿瘤。因此，在评估MGC患者的TIME时，应考虑对转移性肿瘤以及原发性肿瘤中免疫相关生物标志物的评估。
使用2009年1月至2019年5月在忠北国立大学医院经病理证实患有原发性和转移性胃腺癌的患者数据库对病例进行了回顾。我们收集了经手术切除的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本，以全面准确地评估肿瘤周围的时间。两名经验丰富的病理学家评估了每个FFPE块中的苏木精和曙红染色玻片，并选择了具有最大存活肿瘤细胞面积的玻片。临床病理数据包括年龄，性别，转移性疾病的时机，转移部位的数量，腹膜转移的存在，姑息性全身治疗，PGC的位置以及世界卫生组织的组织学分类，均来自医疗记录和病理报告。该研究方案符合1975年赫尔辛基宣言的道德准则。这项研究已经得到忠北国立大学医院的机构审查委员会（IRB）的审查和批准（CBNUH 2018-10-007），并且IRB放弃了获得患者书面知情同意的要求。
使用OPAL多重IHC试剂盒（Perkin-Elmer，Waltham，MA），通过多重免疫组织化学（IHC）评估T细胞密度和PD-L1表达，面板由T细胞标记物（CD4和CD8），免疫检查点组成分子（PD-L1），肿瘤细胞标记物（cytokeratin [CK]）和4'，6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）用于核DNA。将FFPE组织切片（厚度为4-μm）在60°C的干燥箱中加热至少1 h，然后使用二甲苯脱蜡。然后使用Leica Bond Rx自动染色仪（Leica Biosystems，Newcastle，UK）对切片染色。将载玻片烘烤30分钟，并用Leica Bond Dewax溶液（＃AR9222，Leica Biosystems）脱蜡。使用Bond Epitope Retrieval 2 pH 9.0缓冲液（＃AR9640，Leica Biosystems）进行抗原提取30分钟。将玻片与针对兔抗CD4（ab133616，Abcam，1：100稀释），小鼠抗CD8（MCA1817T，BIO-RAD，1：300稀释），兔抗PD-L1（13684S，Cell Signaling Technologies，1：300稀释）和小鼠抗CK（M3515，Dako，1：300稀释），持续30分钟，然后用Polymer HRP Ms + Rb（ARH1001EA，Perkin-Elmer）检测。将CD4，CD8和PD-L1染色的载玻片分别与Opal 480 TSA Plus（以1：150稀释），Opal 520 TSA Plus（以1：150稀释）和Opal 620 TSA Plus（以1：150稀释）孵育。 10分钟 然后在序列的下一步之前，用Bond Epitope Retrieval 1缓冲液（＃AR9961，Leica Biosystems）处理每个载玻片20分钟以除去结合的抗体。将CK染色的玻片与Opal TSA-DIG试剂（FP1502，Perkin-Elmer，1:70稀释）和Opal 780 TSA Plus（稀释1：25）60分钟。随后将核用DAPI染色，并用HIGHDEF IHC氟固封胶（ADI-950-260-0025，Enzo）盖上切片。使用PerkinElmer Vectra Polaris自动定量病理成像系统（Perkin-Elmer）对载玻片成像，并使用inForm 2.4.4软件和TIBCO Spotfire（Perkin-Elmer）对载玻片进行分析。
使用Phenochart软件（1.0.10版，Perkin-Elmer）以10倍放大倍数扫描所有载玻片以选择感兴趣的区域（ROI）。ROI包括IT（在肿瘤实质内），IM（在病变内，在肿瘤边缘的每一侧约500 µm）和PS（在肿瘤周围病变内，但在IM之外）区域（补充图 3）。从每个区域中选择了三个不重叠的视野（一个微观视野，925×693 µm）。通过每个区域三个选定区域中免疫反应性细胞的总数来计算每个区域中的细胞总数。结果表示为阳性染色细胞的平均密度（每视野细胞）。
使用BenchMark XT自动染色仪（Ventana Medical Systems，Tucson，AZ）在4μm厚的FFPE切片上进行全自动免疫染色。使用以下抗体，根据标准抗体方案对MMR蛋白进行IHC：小鼠抗MLH1（Ventana / Roche M1，稀释前抗体），小鼠抗MSH2（Roche G219-1129，稀释前抗体），兔抗-MSH6（Roche SP93，稀释前抗体）和小鼠抗PMS2（Roche A16-4，稀释前抗体）。缺乏MLH1，MSH2，PMS2或MSH6表达的肿瘤被认为是dMMR，而表达MLH1，MSH2，PMS2或MSH6的肿瘤被认为是pMMR。
根据产品协议，通过与EBV编码的小RNA（EBER）探针（INFORM EBER，Roche，即用型）进行原位杂交来确定EBV的状态。强EBER信号被解释为EBV阳性。
根据IT，IM和PS区的CD8 + T细胞密度，将肿瘤分为三种类型，以表征免疫活性的模式11：发炎（IT区的CD8 + T细胞密度高），被免疫排斥（低CD8 +在IT区和高CD8 T细胞密度+在IM和PS区的T细胞密度），和免疫沙漠（低CD8 +在IT，IM和PS区的T细胞密度） 。PGC和MGC中IT，IM和PS区域中每个场的CD8 + T细胞的中位数（41.2个细胞/场）被用作对低和高CD8 + T细胞密度进行分类的标准。
根据IT和IM区域中的T细胞密度（CD4 +和CD8 +细胞）和PD-L1表达，还将肿瘤分为四种类型。这些类别用于预测将对抗PD-1或抗PD-L1 12产生反应的患者：I型，适应性免疫抵抗（高TIL密度和PD-L1阳性）；II型，免疫学无知（低TIL密度和PD-L1阴性）；III型，内在诱导（低TIL密度和PD-L1阳性）；IV型，免疫耐受（高TIL密度和PD-L1阴性）。CD4 +和CD8 +的中位数PGC和MGC的IT和IM区域中每个场的平均细胞数（111.4个细胞/场）被用作分类为低T细胞密度和高T细胞密度的临界值。使用CPS确定PD-L1的表达，即用PD-L1染色的细胞数除以IT和IM区域中存活的肿瘤细胞总数，再乘以100。如果肿瘤被认为是PD-L1阳性CPS≥1。
在七个配对的PGC和MGC FFPE组织上进行RNA测序。使用Trizol试剂（加利福尼亚州卡尔斯巴德市的Invitrogen公司）分离总RNA，并使用带有RNA 6,000纳米芯片的Agilent 2100生物分析仪（荷兰阿姆斯特尔芬的安捷伦科技公司）对质量进行评估。使用ND-2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）对RNA进行定量。根据制造商的说明，使用QuantSeq 3'mRNA-Seq文库制备试剂盒（Lexogen，维也纳，奥地利）对提取的RNA样品进行处理，并在Illumina NextSeq 500（Illumina，圣地亚哥，加利福尼亚）上测序。差异表达基因由P定义 <0.05和绝对倍数变化>2。定义与T细胞激活相关的基因集（免疫检查点，免疫检查点配体，共刺激分子，共刺激配体和趋化因子）（补充表3），并进行GSVA。GSEA进行评估的18基因的T细胞的富集发炎GEP（补充表3所预测到的响应）抗PD-1导向治疗13，14。为GSEA指定了标准化的浓缩分数（NSE）。RNA测序数据的基因表达综合登录号为GSE147043。
细胞密度结果表示为平均值±标准偏差。使用非参数Wilcoxon符号秩检验来比较PGC和MGC之间的细胞密度。OS被定义为转移性疾病诊断与任何原因或最后一次随访死亡之间的持续时间。使用Kaplan-Meier方法进行生存分析，并通过对数秩检验评估统计学差异。使用Cox比例风险回归模型进行了单变量和多变量分析，并表示为每个变量的HR和95％CI。使用IBM SPSS Statistics版本21（IBM Corporation，Armonk，NY，USA）进行统计分析。所有统计分析均为双面检验，其显着性定义为P <0.05。
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