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外源DNA片段未的性质

发表时间:2019-07-17 14:13作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com

外源DNA片段未的性质

1.带有非互补突出端的片段


  用两种不同的限制酶进行消化可以产生带有非互补突出端的片段,刀就是最容蜴 克隆的片段。常用的大多数质粒载体均带有由几个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点。由于现有的多克隆位点如此多样,因而几乎总是能找到一种带有与外DNA片段未匹配的限制切位点的载体。于是,采用所谓的定向克隆即可将外源DNA片段插入到载体当中。例如:载体pUC19用BamHl和Hind-Ⅲ进行消化,然后,通过凝胶电泳或大小排阻凝胶层析纯化载体大片段,以使同芤下来的多克隆位点 缺小片段分开。于是,这一载体就可以同有与BamHl和HindⅢ所切出未端相匹配的粘端的外源DNA区段相连接。用得到的环状重级体化大肠杆菌,检查氨苄青霉素抗性。由于HindⅢ和BomHI的突出端不互补,载体片段不能有效地环化,所以转化大肠杆菌的效率也极低。因此,大多数具有氨苄表霉素抗性的细菌都含有带外源DNA区段的质业,外源DNA区段成为连接HindⅢ和BamHI位点的桥梁。当然,可以根据特定的外源DNA区段来改变限制酶的组合方式。   如要制备定向克隆载体,它尽量避免使用大多克隆位点上彼此直接相邻的限制酶切位点。这些位点中的一个被切开以后,第二个位点应位于线状DNA分子一端的几个碱基对之内,这样过于靠近末端,不利于多种限制酶的有效切割。正因为如此,所以务必检查两种限制酶对载体的消化是否完全。可采用以下两种检查方法: 1)用两种限制酶中的一种对载体进行消化,当所用限制酶的最挞缓冲液对离子强度的要求有不同时,应使用所要求的盐浓度较低的酶。消化完后,应通过凝胶电泳对一小份DNA进行检查。如所有质粒DNA均从环状转变为线状分子时,适当调整盐浓度,并加入第二种酶。同时,另行设立一个预实验,其中含有环状质粒DNA,并只加两种限制酶中的第二种。当预实验中的所有DNA都转变为线状(由凝胶电泳确定)时,通过凝胶电泳或尺坟排阻凝胶层析纯化质粒DNA大片段。\par 2)图1.7所示的是检查消化反应完全程度的一种更为严格的方法。对用第一个限制酶切割的一小份DNA进行末端标记,经离尽柱层析法纯化后,与未标记的线状DNA混合。然后用第二个酶消化,完全消化可使DNA小片段释放,它应带有50%的放射性活度,这可通过层析或通过凝胶电泳和放射自显影加以检测。


2。带有相同末端(平端或粘端)的片段


  带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必须克隆到具有匹配末端的线状质粒载体中。在连接反应中,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。因此,必须仔细调整连接反应中两个DNA的浓度,以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平(见本节三).此外,常常使用碱性磷酸酶去除5'磷酸基团以抑制质粒DNA的自身连接和环化。在体外连接反应中,仅当一个核苷酸含5'磷酸基团而另一个含3'羟基时,T4噬菌体DNA连接酶可催化相邻核苷间形成磷酸二酯健。用细菌碱性磷酸酶(BAP)或牛小肠碱性磷酸酶(CIP)去除线状DNA两端的5'磷酸可以最大限度的地减少质粒DNA区段可有效地与去磷酸化质粒DNA相连接,产生一个含有两个切口的开环分子(图1.8)。因为环状DNA(即使是带切口的环状DNA)的转化效率比线状DNA高得多,所以大多数转化体都含有重组质粒。


3.带有平端的片段


  外源DNA片段带平端时,还有一桩切外生枝的麻烦事,这就是蛱端的连接效率比起带有突出互袜末端的DNA要低得多。因此,涉及平端分子的连接反应所要求的T4噬菌体DNA连接酶的浓度和外源及质粒DNA的浓度都要高得多。还要说明的是,加入低浓度的如聚乙二醇一类的物质,常可提高这类反应的效率。


文章分类: 分子技术资料
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