增加的细胞外钠激活Th17细胞，从而提供针对细菌和真菌感染的保护。虽然高盐饮食已显示会加重自身免疫性疾病，但临床盐耗的免疫学后果尚不清楚。在这里，我们调查遗传性失盐性肾小管病（SLT）患者的免疫力。招募了47名基因型SLT患者（患有Bartter，Gitelman或EAST综合征）。用标准问卷记录免疫功能失调的临床特征，并进行IL-17反应性的免疫学调查。然后评估改变细胞外离子浓度对免疫反应的影响。患者是低钾血症和低镁血症的，间质性钠储存减少的因素为23钠磁共振成像。与年龄相匹配的对照组相比，SLT患者报告粘膜感染和过敏性疾病增加。与他们的临床表型一致，SLT患者的Th2：Th17细胞比例增加。SLT Th17和Tc17极化在体外减少，但STAT1和STAT3磷酸化以及T细胞活化后的钙通量不受影响。在对照细胞中，添加细胞外钠（+40 mM），钾（+2 mM）或镁（+1 mM）会降低Th2：Th17的比例并增强Th17极化。因此，我们的结果表明，SLT中典型的离子环境会损害IL-17免疫力，但是介导盐驱动Th17极化的细胞内通路是完整的，并且可以通过增加细胞外钠浓度来重新激发体外IL-17反应。
在全球范围内，膳食盐（氯化钠）的摄入量超过了我们在比较近的进化史所消耗的量，并且在大多数社区是大于世界卫生组织建议每天2克钠限制1，2。钠的摄入与高血压和心血管疾病的发展有关，但是过量钠的其他不利影响开始出现。这些包括钠直接影响免疫，并与炎症和自身免疫疾病的发展相关联的增加的意识3，4。
IL-17是CD4 +（Th17）和CD8 +（Tc17）T细胞产生的促炎细胞因子。IL-17反应提供了保护免受感染，特别是在上皮表面，但越来越多地涉及自身免疫性疾病5。IL-17免疫力的遗传缺陷导致慢性粘膜皮肤念珠菌病（CMC），其特征在于粘膜细菌和真菌感染，通常与免疫功能失调的其他临床特征（包括变态反应性疾病）相关。CMC最常见的原因是遗传突变影响了细胞因子信号分子的磷酸化和活性，信号转导子和转录激活子1和3（STAT1和STAT3）继而影响Th17极化6，7。
慢性盐负荷导致肌肉和皮肤中的钠储存，导致这些部位的间质钠浓度超过血浆8中的钠浓度。钠可能被巨噬细胞清除，这一发现提供了直接证据将细胞外钠与免疫细胞功能直接联系起来9。钠已被证明影响先天和适应性免疫的多个部件4，10。增加钠促进促炎性细胞亚型如Th17细胞和巨噬细胞M1的激活，同时抑制调节性细胞11，12，13，14。介导钠的这种炎症作用的细胞内途径开始出现。在Th17细胞中，这涉及活化的T细胞的5（NFAT5）核因子和血清/糖皮质激素调节激酶1（SGK1）的上调12，13。这些炎性细胞的盐驱动激活的后果增加自身免疫，加剧了移植排斥反应，和增加的皮肤感染的间隙11，12，13，15，16，17，18。
肾钠处理涉及肾小球滤过大量钠，然后再通过肾小管上皮重新吸收，这一过程主要在远端肾单位进行体内平衡控制。这涉及许多不同的钠转运蛋白，它们通常与其他离子转运机制19协同工作。失盐性肾小管病（SLT）的基础是由于编码钠或其他离子转运蛋白的基因突变导致肾钠重吸收的遗传缺陷20。SLT的最常见原因是厚肢上升节（TAL）和远曲小管（DCT）中钠的重吸收缺陷，分别导致Bartter综合征（BS）和Gitelman综合征（GS）。DCT中的重吸收缺陷也是罕见的EAST（癫痫，共济失调，感觉神经性耳聋和肾小管病变）综合征的特征，该综合征具有与GS 21难以区分的管状表型。。这些失盐性肾病共同具有许多临床和生化特征，包括肾功能衰竭引起的慢性盐耗，此外还有醛固酮增多症和低钾血症性代谢性碱中毒（通常与肾镁浪费和低镁血症有关）。患者经常报告许多无法解释的症状，包括儿童期反复出现的发热性发作；在BS和GS既自身免疫链路进行了说明，但并不充分说明22，23，24，25，26，27，28。以前尚未研究过SLT中的免疫反应性。
为了了解慢性体内盐耗竭的后果，我们调查了SLT患者的免疫力。我们证明SLT与免疫缺陷的临床特征有关，这归因于IL-17反应的降低。我们提供的数据表明，SLT中的免疫表型是慢性盐耗竭和体内离子环境相关变化的结果，并突出了钠以及其他细胞外离子对免疫细胞激活状态的重要作用。在此过程中，我们描述了IL-17免疫缺陷的新原因，并为进一步研究改变细胞外离子以改变感染风险以及作为免疫介导的疾病中潜在的免疫抑制策略提供了基础。
我们调查的47例患者免疫功能基因分型SLT和46年龄匹配的健康和疾病对照29，30。患有BS的患者为23（49％），患有GS的患者为22（47％），患有EAST综合征的患者为2（4％）（补充表 1）。疾病对照是在肾小管疾病门诊就诊的患者，其诊断与肾盐消耗无关（补充表 2）。SLT患者的中位年龄为35（28-43）岁，女性为26（55.3％）位。募集时的生化发现是SLT的典型特征，伴有低钾血症性代谢性碱中毒和频繁的低镁血症（补充表 3）。这些生化特征在对照中未见（补充表 4））。25例SLT患者中有24例（96％）肾素或醛固酮升高。
建议通过低/正常血压在SLT中消耗全身盐；平均收缩压和舒张压分别为117±12和74±7.4 mmHg。6名SLT患者对下肢进行了23次 Na-MRI成像，这证实了与年龄相匹配的健康对照（HCs）相比，皮肤中的钠存储减少了（图 1）。
来自SLT患者（盖特曼综合征）和HC的下肢的代表性23 Na MRI图像。已知钠浓度（0–80 mM）的幻影在下肢旁边成像（红色箭头）。b通过23 Na MRI对SLT患者（GS = 4，红点； BS 1型= 2，蓝点）和与年龄匹配的健康对照组（n = 4）确定的皮肤和肌肉钠浓度。皮肤钠：HC 17.4（14.0-18.6）AU，SLT 11.5（8.2-14.1）AU，p = 0.038; 肌肉钠：HC 16.3（15.9–22.1）AU，SLT 17.7（11.8–20.3）AU，p = 0.99。将组与双面Mann-Whitney检验进行比较。误差线代表中位数附近的四分位数范围。ns不重要（p > 0.05），* p ≤0.05，** p ≤0.01，*** p ≤0.001，**** p ≤0.0001。HC健康对照组，SLT失盐性肾小管病。源数据作为源数据文件提供。
我们比较了健康（n = 24）和疾病（非失盐性肾小管疾病；n = 22）对照的SLT患者免疫功能失调的临床特征（表 1）。SLT患者发生细菌感染（皮肤脓肿21％，复发性上呼吸道感染49％，尿路感染36％）和真菌感染（复发性皮肤粘膜念珠菌病38％；补充图 1）。此外，SLT患者对多种抗原的湿疹/皮炎和过敏性疾病患病率增加。此外，据报道14名（29.8％）SLT患者发生自身免疫现象：牛皮癣n = 5；甲状腺功能减退症n = 2; 自身免疫性肝炎n = 1；白癜风n = 2；雷诺兹n = 2; 和sicca症状/干燥综合征n = 2。
IL-17应答降低是CMC的基础，这通常是由于STAT1或STAT3的突变引起的，并且可能是Hyper-IgE综合征的一部分。为了评估SLT患者遭受的感染是否与IL-17免疫功能减退相一致，我们基于Hyper-IgE综合征诊断标准的与感染相关的成分设计了评分系统，并将其应用于SLT患者和对照（补充表 5）31。与两个对照组相比，SLT患者中与IL-17相关的感染评分更高（图 2a）；此外，SLT患者的临床表型与STAT1和STAT3介导的IL-17缺陷患者相似（补充表 6）。
一个 IL-17相关的感染评分在SLT例（Ñ = 47），健康对照组（Ñ = 24），和疾病（Ñ = 22）对照：HC 1.0（0.0-2.8）; SLT 5.0（1.0–8.0）；DC 0.0（0.0–2.3），p = 0.0006。使用Kruskal–Wallis检验和多个比较检验对组进行比较。误差线代表中位数附近的四分位数范围。b SLT患者的总免疫球蛋白E（IgE）水平（n = 30）。红线表示正常的上限120 KUL；10/30（33％）SLT患者的IgE> 120 KUL。c NK细胞表达为SLT患者中淋巴细胞的比例（n = 32）。红线表示正常下限为7％。13名（40.6％）SLT患者的NK细胞<7％。d。SLT患者（n = 3）和健康对照组（n = 7）的T细胞活化分析。抗CD3 /抗CD28刺激72小时后表达CD25 的CD4 +细胞比例：HC 89.5％（84.9-95.4），SLT 89.1％（87.3-93.5），p = 0.99。将组与双面Mann-Whitney检验进行比较。图表中的误差线代表中位数附近的四分位数范围。CD4和CD25染色的代表性FACS等高线图在每个象限内具有百分比的细胞比例。È在SLT例（T-细胞增殖分析Ñ = 6）和健康对照（n = 6）。抗CD3 /抗CD28刺激72小时后表达Ki67 的CD4 +细胞比例：HC 83.6％（68.7-88.2）和SLT 76.2％（70.4-85.6），p = 0.48。将组与双面Mann-Whitney检验进行比较。图表中的误差线代表中位数附近的四分位数范围。CD4和Ki67染色的代表性FACS等高线图具有每个象限内细胞百分比的百分比。f。SLT患者的水痘带状疱疹和肺炎球菌特异性免疫球蛋白G水平（n = 11）。根据分析解释数据，在SLT患者中的发现与健康成年人群一致。NS不显著（p > 0.05），* p ≤0.05，** p ≤0.01，*** p ≤0.001，**** p ≤0.0001。HC健康对照组，SLT失盐性肾小管病。源数据作为源数据文件提供。
鉴于SLT粘膜微生物感染的患病率增加，我们有兴趣了解SLT患者在常见感染部位之一的微生物群落是否存在差异。因此，我们进行尿沉渣培养，这表明随着棒状杆菌属细菌的存在，细菌成分发生了变化。与对照相比，SLT患者的血浆水平均（补充表 7和8）。为了确定细胞外钠浓度的变化是否直接影响微生物的生长，需对霉菌及其他常见微生物（大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和白色念珠菌）进行检测。）在补充有NaCl的培养基中培养。NaCl对受试细菌的生长没有影响，而添加其他NaCl 可使念珠菌菌落的大小呈剂量依赖性减小（补充图 2）。因此，细胞外钠改变的直接作用可能是粘膜真菌感染。然而，细胞外环境改变对细菌生长的影响缺乏，这支持了微生物群改变背后的免疫力的主要缺陷，以及在SLT中观察到的尿液感染率增加。
补充表9总结了SLT患者的免疫学分析 。30名患者中有10名（33.3％）的总IgE水平升高，而32名患者中有13名（40.6％）的CD16 + CD56 + NK（自然杀手）细胞降低了（图 2b，c）。否则，测试的参数在实验室参考范围内。
与对照组相比，SLT患者经72小时抗CD3和抗CD28刺激后，T细胞增殖和活化分别确定为表达Ki67和CD25 的CD4 +细胞的百分比（图 2d，e）。抗原特异性抗体反应的分析表明，SLT患者的水痘带状疱疹和肺炎球菌免疫球蛋白G的保护水平与健康成人相似（图 2f）。此外，与对照组相比，SLT患者的CD4，CD8，CD45RA和CD45RO亚组没有差异（补充图 3）。因此，对SLT患者的初步免疫学分析表明，适应性免疫没有明显缺陷。
鉴于SLT中粘膜感染增加的临床发现以及盐对Th17反应的已知作用，我们评估 了SLT中的CD4 + T细胞亚群，并将其与健康和疾病对照进行比较。分析 分别代表Th1，Th2和Th17细胞的CD4 +细胞中IFNγ，IL-4和IL-17的表达，表明SLT中Th17细胞显着减少，而Th1和Th2细胞在两组之间无差异（图 3a，b）。当将CD4子集表示为每个受试者中一种细胞亚型与另一种亚细胞之比时，SLT患者中Th2：Th17细胞的比例会增加，这与SLT队列中观察到的感染率和过敏率增加的发现一致（图 3c）。
一个 IFNγ，IL-4，和IL-17的表达在CD4 + 4小时刺激佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯和离子霉素在SLT患者（后细胞Ñ = 15），健康对照组（Ñ = 11），和疾病对照（Ñ = 12 ）。细胞因子表达报告为CD4 +细胞的百分比。将组与使用Dunn的多重比较检验的Kruskal–Wallis检验进行比较（用显着性条显示）。误差线代表中位数附近的四分位数范围。IFNγ表达：HC 1.9％（1.5-4.0），SLT 1.3％（1.0-3.7），DC 0.9％（0.5-8.9），p = 0.53。IL-4表达：HC 2.8％（0.8–4.8），SLT 3.0％（1.7–3.3），DC 2.5％（0.7–3.0），p = 0.52。IL-17表达：HC 1.4％（0.9-2.2），SLT 0.7％（0.3-1.4），DC 1.0％（0.8-1.4），p = 0.038。b SLT患者和HC的CD4 +细胞中IFNγ，IL-4和IL-17表达的代表性FACS点图。每个象限内记录的单元格百分比百分比。c SLT患者（n = 15），HC（n = 11）和DC（n = 12）中每个受试者中IFNγ，IL-4和IL-17表达的比率。将组与使用Dunn的多重比较检验的Kruskal–Wallis检验进行比较（用显着性条显示）。误差线代表中位数附近的四分位数范围。IFNγ：IL-4（Th1：Th2）：HC 1.2（0.4-2.9），SLT 0.7（0.3-3.9），DC（1.0（0.4-3.9），p = 0.82）。IFNγ：IL-17（Th1：Th17）：HC 1.8（0.8-7.0），SLT 3.3（1.6-8.3），DC 1.0（0.5-7.8），p = 0.40。IL-4：IL-17（Th2：Th17）：HC 1.9（0.4-3.2），SLT 3.4（1.2-6.6），DC 1.4（0.7-2.5），p = 0.05。NS不显著（p > 0.05），* p ≤0.05，** p ≤0.01，*** p ≤0.001，**** p ≤0.0001，HC健康对照，SLT失盐肾小管病，DC疾病控制。源数据作为源数据文件提供。
为了进一步研究IL-17反应，将外周血单核细胞（PBMC）在最佳的Th17极化条件下培养7天。在CD4 IL-17表达+ 和CD4 -细胞，代表的Th17和TC17偏振分别在SLT患者相比，减少健康和疾病对照（图 4A，B，d）。与HCs相比，SLT患者的上清液IL-17浓度降低了（图 4c）。与CD4 + 细胞亚群分析一起，这些数据证实SLT患者的IL-17反应降低。
在 用抗CD3，抗CD28刺激的HC（n = 27），SLT（n = 21）和DC（n = 19）PBMC 1周培养后，CD4 +细胞（Th17）中的 IL-17表达， IL-1，IL-6，IL-21，IL23和TGFβ：HC 3.2％（2.5-6.3），SLT 1.6％（0.8-2.0），DC 2.6％（2.1-3.5），p = 0.0001。将组与使用Dunn的多重比较检验的Kruskal–Wallis检验进行比较（用显着性条显示）。误差线代表中位数附近的四分位数范围。b HC（n = 27），SLT（n = 25）和DC（n（n = 1）的培养1周后CD4−细胞（Tc17）中的IL-17表达 = 19）用抗CD3，抗CD28，IL-1，IL-6，IL-21，IL23和TGFβ刺激的PBMC：HC 1.5％（0.6-3.0），SLT 0.6％（0.3-1.1），DC 1.9％（1.1–2.2），p = 0.0005。将组与使用Dunn的多重比较检验的Kruskal–Wallis检验进行比较（用显着性条显示）。误差线代表中位数附近的四分位数范围。c在 用抗CD3，抗CD28，IL-1，IL刺激的HC（n = 24），SLT（n = 23）和DC（n = 18）PBMC 培养1周后，上清液IL-17浓缩细胞-6，IL-21，IL23和TGFβ：HC 4287 pg / ml（1681–10,487），SLT 1117 pg / ml（249–3709），DC 951 pg / ml（503–3768），p = 0.0012。将组与使用Dunn的多重比较检验的Kruskal–Wallis检验进行比较（用显着性条显示）。误差线代表中位数附近的四分位数范围。d HC和2例SLT患者CD4 +细胞中IL-17表达的代表性FACS点图。每个象限内记录了单元格百分比百分比。NS不显著（p > 0.05），* p ≤0.05，** p ≤0.01，*** p ≤0.001，**** p ≤0.0001。SLT失盐性肾小管病，HC健康对照，DC疾病对照，PBMC外周血单核细胞。源数据作为源数据文件提供。
STAT1和STAT3磷酸化的改变是IL-17免疫力遗传缺陷的常见原因。我们评估了SLT淋巴细胞中的STAT1和STAT3磷酸化，但这是正常现象，表明STAT1和STAT3信号缺陷不是SLT患者中IL-17反应缺陷的原因（图 5a，b；补充图 4A–C）。
IL-6和IL-21刺激SLT患者后CD4 +细胞中STAT3 的磷酸化（n = 13）。磷酸化表示为SLT中pSTAT3的上调与同一实验中评估的HC的比率（n = 4个实验中评估的4个HC ）。以比例1绘制的红线表示SLT和HC之间没有差异。b在SLT患者中，用IFNα刺激后CD4 +细胞中STAT1的磷酸化（n = 13）。磷酸化表示为SLT中pSTAT1上调相对于同一实验中评估的HC的比率（n =在4个实验中评估了4个HC）。以1的比例绘制的红线表示SLT和HC之间没有差异。c在培养条件下添加20μM氢氯噻嗪（HCT）进行细胞培养实验（11个健康对照中的11个实验）中的Th17和Tc17极化以及上清液IL-17浓度。每个变量表示为与标准培养条件下读数的比值；比例为1的红线表示添加HCT时读数无差异。d健康对照（n = 13）和吉特曼综合症患者（n = 5）的钙通量曲线下面积（由CD4 +门控比例钙染料Indo-1确定）用抗CD3激活T细胞后：HC 275.9 AU（265.9–279.9）；和吉特曼综合症（GS）277.8 AU（257.5–280.5），p = 0.94。与双面Mann-Whitney检验相比。误差线代表中位数附近的四分位数范围。e在健康对照和两名GS患者中，T细胞活化后CD4 +细胞中的代表性钙通量曲线。NS不显著（p > 0.05），* p ≤0.05，** p ≤0.01，*** p ≤0.001，**** p ≤0.0001，SLT失盐肾小管病，HC健康对照，DC疾病控制，GS吉特曼综合症。源数据作为源数据文件提供。
免疫细胞上表达的许多不同离子通道的突变导致免疫缺陷，主要是由于白细胞活化过程中钙信号传导的相关变化32。在我们的SLT队列中，最常见的缺陷钠转运蛋白是氯化钠共转运蛋白（NCC，SLC12A3）。我们调查免疫细胞上NCC的表达，并评估其抑制是否导致IL-17反应降低。NCC在多种免疫细胞亚型中都有表达，但是用氢氯噻嗪（HCT; 20μM）抑制NCC对HCs细胞中的T细胞钙通量或体外IL-17反应没有影响（图 5c和补充图 4D–F）。SLT患者在T细胞激活后具有正常的钙通量模式（图。 5d，e）。此外，根据受影响的离子转运蛋白，感染评分和IL-17反应没有差异（补充图 4G）。根据这些数据，SLT中IL-17反应的降低不太可能归因于NCC功能的原发性干扰或免疫细胞中细胞内钙信号传导的继发失调。
我们假设SLT中的IL-17应答降低是由于其体内离子环境的改变（胞外钠，钾和镁减少）所致。因此，我们评估了 非特异性T细胞刺激后单独和组合改变细胞外钠，钾和镁浓度对CD4 +亚群平衡的影响，以及在最佳极化条件下培养的对照细胞中IL-17反应的影响。 。
我们首先测量XVIVO15介质的电解质浓度，以确定基线条件（补充图 5A）。然后，我们在不同的离子环境中用抗CD3和抗CD28刺激PBMC 72 h，并测量CD4 + 细胞中IFNγ，IL-4和IL-17的表达。NaCl（0–40 mM），KCl（0–2 mM）和MgCl 2（0–1 mM）的添加导致IFNγ：IL-17和IL-4表达比的剂量依赖性降低CD4 + 细胞中的IL-17 ：（图 6a–c）。每种离子的添加对细胞生存力没有影响（补充图 5B），对IFNγ：IL-4表达没有一致的影响，并且结合多个离子会加剧IL-4：IL-17的表达比率（图5B）。 6d）。因此，正如我们在CD4子集分析中发现的那样，SLT患者具有一种细胞外离子环境，比Th17应答更倾向于Th2应答，并且与他们的临床表型一致。
a用抗CD3 /抗CD28激活T细胞期间NaCl（0–40 mM），KCl（0–2 mM）和MgCl 2（0–0.8 mM）对IFNγ：IL表达比的影响在CD4 +细胞中为-17 ，代表Th1：Th17细胞。显示的数据代表健康对照者的剂量反应。绘制技术重复的平均值。b在用抗CD3 /抗CD28激活T细胞的过程中，NaCl（0–40 mM），KCl（0–2 mM）和MgCl 2（0–0.8 mM）对IL-4表达比的影响CD4 +细胞中的：IL-17 ，代表Th2：Th17细胞。显示的数据代表健康对照者的剂量反应。绘制技术重复的平均值。C+40 mM NaCl对健康对照的CD4 +细胞中IFNγ，IL-4和IL-17表达的影响的代表性FACS点图。每个象限内记录了单元格百分比百分比。d在单独或组合使用的NaCl（40 mM），KCl（2 mM）和MgCl 2（1 mM）存在下用抗CD3 /抗CD28激活T细胞后，CD4 +亚群平衡。数据显示，子集余额以健康对照组中标准条件的比率报告（n = 2）。绘制了中值比率。与标准条件相比，以1的比例绘制的线表示在存在离子的情况下子集平衡没有差异。源数据作为源数据文件提供。
然后，我们评估了改变细胞外离子浓度对7天IL-17反应的影响。我们证明，通过添加NaCl（0–40 mM），KCl（0–2 mM）和MgCl 2（0–0.8 mM），Th17和Tc17极化的剂量依赖性增加（图 7a–c）。离子的添加对细胞活力或IFNγ应答没有影响（补充图 6A，B）。我们更密切地询问NaCl反应，并证明NaCl对Th17和Tc17细胞在HCs中的极化作用是一致的（图 7d，e），其作用主要是由钠浓度而不是渗透压介导的（补充图 6C）。），而钠会影响幼稚和记忆T细胞群体（补充图。 6D–F）。添加到培养条件中的血管紧张素II增加了IL-17反应，而醛固酮没有作用（补充图 6G）。因此，SLT患者的细胞外离子环境会降低IL-17反应，并且这种环境可能会影响多种细胞类型中IL-17的表达。血管紧张素II可以作为盐失代偿的免疫机制。
a NaCl（0–40 mM；n = 1个健康对照），KCl（0–2 mM；n = 2个健康对照）和MgCl 2（0–0.8 mM；n = 3个健康对照）对Th17极化后的极化的影响在最佳Th17极化条件下激活PBMC。绘制技术三次平均值的NaCl效果图。在其他图中，绘制了控件的中位数，数据点代表每个参与者中技术重复的平均值。bNaCl（0–40 mM；n = 1个健康对照），KCl（0–2 mM；n = 2个健康对照）和MgCl 2（0–0.8 mM；n = 3个健康对照组）在最佳Th17极化条件下激活PBMC后Tc17极化。绘制技术三次平均值的NaCl效果图。在其他图中，绘制了控件的中位数，数据点代表每个参与者中技术重复的平均值。c在正常培养基和补充了40 mM NaCl的培养基中活化后，CD4 +（Th17）和CD8 +（Tc17）健康对照细胞中IL-17表达的代表性FACS点图。每个象限内记录的单元格百分比百分比。d。 在正常培养基和补充了40 mM NaCl的培养基中培养的健康对照（n = 26）细胞的Th17极化。Th17细胞（以CD4 +细胞）：普通培养基3.2％（2.5–6.3）；介质+40 mM NaCl 7.6％（4.6-12.4）；p ＜0.0001。将条件与双向Wilcoxon检验进行比较。数据点和连接线代表每个健康对照中极化的变化。È健康对照的TC17偏振（Ñ = 26）细胞在正常培养基和在补充了40mM的NaCl的培养基中培养。TC17细胞（如CD4的百分比-细胞）：正常媒体1.5％（0.6-2.9）; 培养基+40 mM NaCl 3.3％（1.5–5.6）；p ＜0.0001。将条件与双向Wilcoxon检验进行比较。数据点和连接线代表每个健康对照中极化的变化。F根据SLT生化表型与IL-17相关的感染评分：BS类型1、2和4 [ n = 9] = 2.0±2.1分；BS类型3 [ n = 14] = 4.6±3.3点；GS和EAST [ n = 24] = 5.7±4.5分；p ＝ 0.05。使用单项方差分析和多次比较测试对组进行比较（用显着性条显示）。误差棒代表围绕平均值的标准偏差。g根据SLT生化表型的血清肌酐：BS类型1、2和4 [ n = 9] = 108μmol/ l（81–240），BS类型3 [ n = 14] = 77μmol/ l（56–162 ），GS和EAST [ n = 24] = 66.5μmol/ l（52-73）；p = 0.0005。将组与Kruskal–Wallis检验和多重比较检验进行比较（用显着性条显示）。误差线代表中位数附近的四分位数范围。NS不显著（p > 0.05），* p ≤0.05，** p ≤0.01，*** p ≤0.001，**** p ≤0.0001。源数据作为源数据文件提供。
然后，我们将SLT中的血清生化和临床参数与其与IL-17相关的感染评分相关联。这表现在增加的血清肌酐导致降低的盐损失和血压肾功能受损可充当用于存储钠的替代33，34。为了支持减盐和减少细胞外钠对免疫力的主要作用，血压和血清肌酐与感染评分之间的相关性最强（舒张压Pearson r-0.37（95％CI -0.60，-0.09），p = 0.013 ；平均动脉压Pearson r -0.32（95％CI -0.56，-0.03），p = 0.03；血清肌酐Pearson r -0.27（95％CI -0.52，0.02），p = 0.06），而感染评分与血清镁或钾没有相关性（补充图 7A，B）。此外，根据其肾功能的差异，根据生化表型分组的SLT类型之间的感染评分也存在差异，GS和EAST综合征（远端肾小管功能障碍和最保留的肾功能）患者的感染评分最高在患有BS 1、2和4型（loop功能障碍和最受损的肾功能）的患者中（图 7f，g）。
通过钠离子增加的Th17极化的细胞内途径包括SGK1，NFAT5的上调，和IL23受体（IL-23R）12，13。我们评估该途径在SLT患者中是否完整。我们证明，与HC相比，SGK1和NFAT5的SLT淋巴细胞表达没有降低，CD4 + 细胞上的IL-23R表达也没有降低（图 8a-e）；实际上，在SLT患者的非CD4淋巴细胞中IL23-R表达增加（图 8B和补充图 8A）。
一个上未刺激的CD4 IL-23受体表达+健康对照细胞（Ñ = 8）和SLT例（ñ HC 0.42％（0.34-1.01），SLT 0.79％（0.73-2.60），：= 7）p = 0.07。将组与双面Mann-Whitney检验进行比较。误差线代表中位数附近的四分位数范围。b上未刺激的CD4 IL-23受体的表达-细胞在健康对照组（Ñ = 8）和SLT例（Ñ = 7）：HC 3.34％（2.26-6.56），SLT 9.67％（5.64-10.65），p = 0.02。将组与双面Mann-Whitney检验进行比较。误差线代表中位数附近的四分位数范围。C健康对照（n = 13）和SLT患者（n = 11）中淋巴细胞相对NFAT5的表达：HC 1.01 AU（0.70–1.95），SLT 1.10 AU（0.76-1.62），p = 0.85。将组与双面Mann-Whitney检验进行比较。误差线代表中位数附近的四分位数范围。d健康对照组（n = 7）和SLT患者（n = 13）的淋巴细胞SGK1相对表达：相对强度HC = 1.07 AU（0.73–1.2），SLT = 1.09 AU（0.80–1.31），p = 0.70。将组与双面Mann-Whitney检验进行比较。误差线代表中位数附近的四分位数范围。ËHCs和SLT患者中SGK1表达的代表性蛋白质印迹。 在三个实验中，在SLT患者（n = 13）和健康对照（n = 7）中确定了SGK1表达。f 在标准培养基中，HC（n = 27）和SLT患者（n = 25）以及在补充40 mM NaCl的SLT患者中Th17极化：HC + 0 mM NaCl 3.2％（2.5–6.3）；SLT + 0 mM NaCl 1.6％（0.8–2.0）；SLT + 40 mM NaCl 3.1％（2.4–5.3）；p ＝ ＜0.0001。使用Kruskal–Wallis检验与Dunn的多重比较检验（用显着性条显示）对组进行比较。误差线代表中位数附近的四分位数范围。g HC中的Tc17极化（n = 27）和 标准培养基中的SLT患者（n = 25），以及补充了40 mM NaCl：HC + 0 mM NaCl 1.5％（0.6–3.0）的SLT患者；SLT + 0 mM NaCl 0.6％（0.3–1.1）；SLT + 40 mM NaCl 1.6％（0.9-3.1）；p = 0.0007；使用Kruskal–Wallis检验和Dunn的多重比较检验（用显着性条显示）对两组进行比较。误差线代表中位数附近的四分位数范围。NS不显著（p > 0.05），* p ≤0.05，** p ≤0.01，*** p ≤0.001，**** p ≤0.0001。HC健康对照组，SLT失盐性肾小管病，所有单位均为AU。源数据作为源数据文件提供。
考虑到该途径的保留，我们假设可以通过在培养条件下补充盐来挽救SLT患者的体外IL-17反应。实际上，在培养条件下添加40 mM NaCl会上调SLT中的IL-17反应，从而在标准条件下Th17和Tc17极化等同于健康和疾病控制极化（图 8f，g）。SLT患者的体外IL-17反应的盐反应性与对照组无差异，根据SLT类型的盐反应性也无差异（补充图 8B–D）。这些数据表明，盐补充剂可改善SLT体外的IL-17反应缺陷，但在体内临床上是否可行还是未知的。
Th17细胞极化需要在先天免疫细胞产生的Th17极化细胞因子存在下，由抗原呈递细胞呈递抗原。因此，IL-17反应缺陷可能是先天免疫力受损的结果。我们通过测量全血测定中对一系列刺激反应的细胞因子产生来评估SLT患者的先天免疫反应。我们证明先天反应没有减少；实际上，与对照相比，SLT患者中几种先天细胞因子（例如IL-1，IL-6和TNF）的产生增加了（表 2）。
随后，我们将更详细地分析SLT患者的单核细胞反应。我们发现与我们使用的实验中的对照相比，SLT患者的单核细胞亚群（经典，中间和非经典）或TNF的单核细胞表达没有差异（补充图 9A–C）。此外，在刺激条件下添加40 mM NaCl，2 mM KCl，1 mM MgCl 2或醛固酮（10–100 nM）对单核细胞TNF表达没有影响（补充图 9D）。因此，先天免疫应答降低不是SLT患者IL-17应答降低和感染增加的原因。
我们最终对SLT中的NK细胞进行了进一步分析，以进一步表征NK细胞亚群并评估NK细胞功能。在这项分析中，CD45 + CD3 - CD56 + CD16 +（NK）细胞在HCs中占淋巴细胞的10.2％（5.9-13.8），在SLT患者中占6.9％（3.9-10.0）（p = 0.1，补充图 10A） 。8名（50％）SLT患者的NK细胞少于淋巴细胞的7％，但5名（29％）对照的NK细胞也是如此（p = 0.3）。 然而，在SLT患者中，表达CD16（Fc受体）的CD56 +细胞比例降低（补充图 10B，D）。为了评估NK细胞功能，用IL-12和IL-18刺激PBMC 4小时，并测定IFNγ的NK细胞表达。SLT和对照之间的IFNγ表达没有差异（补充图 10C）。
尽管已经在免疫系统的大部分部位评估了细胞外钠的作用，但尚未评估其对NK细胞的作用。因此，我们在存在额外的NaCl（+40 mM）的情况下刺激NK细胞。在刺激条件下添加氯化钠会增加表达CD56的淋巴细胞比例，但CD56 + 细胞的IFNγ表达会降低（补充图 10E，F）。因此，存在SLT患者中NK细胞数量减少，CD56 + 细胞上的Fc受体表达减少的趋势，这表明SLT患者中的NK细胞具有耐受的表型。
迄今为止，有关钠平衡改变对免疫力影响的研究主要集中在盐负荷及其对炎性或自身免疫性疾病的影响上。除了在体外和动物模型中证实的钠对多种免疫细胞的炎症作用外，患者钠摄入的增加还与类风湿关节炎的发生有关，与多发性硬化症的疾病严重程度相关，并且使肾同种异体移植的结果独立于任何血液压力效果35，36，37。这些数据表明减少盐的摄入量也会影响免疫力，并可能改善各种炎症状态，但这一假设未经检验，并且慢性盐耗竭的免疫学后果尚不清楚。此外，尚不清楚将免疫功能与钠相关的进化压力。长期的盐限制研究在逻辑上具有挑战性，难以坚持；因此，为了解钠平衡降低的后果，我们调查了罕见遗传性SLT患者的免疫力。这些患者提供了一种独特的慢性盐耗竭的体内模型，其免疫力的评估以前未曾探索过。
长期钠平衡研究的新发现表明，钠的第三部分储存在肌肉和皮肤的间隙位置。提出皮肤包含类似于肾脏38中逆流机制的渗透梯度产生系统。在两个站点增加钠的浓度防止多余的水分流失，还可能感染提供保护11，18。尽管已经很好地描述了肾脏中钠的转运机制，但很大程度上未知参与皮肤钠转运的离子通道和转运蛋白。磁共振成像对皮肤钠存储的可视化和测量（23的Na-MRI）已经证明，在这些位点钠浓度与年龄和疾病状态增加导致钠负荷如心脏衰竭和慢性肾脏疾病33，34，39，40，41。在SLT患者中，适应性机制如食盐增加和未受影响的肾单位中钠的重吸收增强被上调，以防止灾难性的钠流失42。尽管SLT患者浪费了钠，但是从长远来看，这将如何影响钠的存储或对钠的总体平衡的影响。此外，如果SLT患者中离子转运机制的缺陷直接影响角质形成细胞钠转运，则是未知的。使用23Na-MRI，我们证明与对照组相比，SLT患者的钠存储量减少。在SLT患者的肾脏特异性（BS1）和全身性（GS）转运蛋白均存在缺陷的情况下，观察到这种减少，表明皮肤钠减少的主要原因是肾脏钠的浪费，而不是皮肤钠运输的主要缺陷。间质钠的这种改变与血清钾和镁浓度的降低相结合，意味着SLT患者的免疫细胞暴露于改变的细胞外离子提示的独特组合中，我们认为这会影响免疫功能。
SLT患者的诊治可能是通过在因其他原因进行的血液检查中偶然识别出生化异常，或带有一系列相对非特异性的症状。这些症状包括抽筋，虚弱，头晕和疲劳，传统上，这些症状直接归因于电解质紊乱或相对低血容量。但是，尚无一致的数据表明症状负担与电解质异常之间的相关性，即使电解质充足，症状也常常持续存在并致残。此外，一些公认的临床特征，如在儿童中GS发热事件，理论上不能被直接电解质作用说明27，43，44，45。我们证明SLT免疫缺陷的数据为这些症状提供了解释，并且我们描述了SLT患者以前未认识到的新型免疫介导功能。在我们的队列中，细菌和真菌感染的持续性以及反复的过敏性发作具有明显的发病率。此外，SLT和自身免疫（例如自身免疫性甲状腺疾病，斯耶格伦氏综合征，自身免疫性肝炎和血管炎）被识别之间的关联22，23，24，26，28 ; 我们队列中的研究结果证实了这种关联，并且我们对免疫功能失调的证明为这种联系提供了解释。
Th17细胞具有促炎性，可针对细胞外细菌和真菌感染（尤其是在粘膜表面46）提供保护。极化需要IL-1β，IL-6和TGF-β的刺激，而完全成熟则需要IL-21和IL-23。Th17细胞分泌包括IL-17在内的多种细胞因子，IL-17诱导其他促炎性细胞因子和趋化因子的释放，对嗜中性白细胞募集很重要。有缺陷的IL-17反应可能会遗传并导致CMC综合征，或者可能在患有胸腺瘤47（产生针对IL-17的中和抗体）的患者或服用抗IL-17单克隆抗体治疗自身免疫性疾病的患者中获得48。我们证明了SLT患者免疫缺陷的主要原因是IL-17反应降低，并且SLT中细菌和真菌感染的粘膜性质与遗传性IL-17缺陷患者的表型一致（补充表 6）。病征CMC是最常见的由于STAT1磷酸异常6，但这些在SLT患者不存在，如均STAT3介导的细胞因子的改变信令31，49。因此，我们通过以前未报道的离子机制描述了IL-17免疫缺陷的新原因。
免疫细胞中离子通量改变导致的免疫缺陷是人类在遗传性离子通道病中的主要描述，这种离子通道病会在T细胞活化过程中导致受损的钙存储钙离子输入（SOCE）50。这可能是由于钙释放激活的钙电流（CRAC）通道突变导致从内质网释放的钙受损（例如基质相互作用分子1 [STIM1]突变）或跨质膜的细胞外钙进入受损（例如钙释放-激活的钙调制器1 [ORAI1]突变）51，52，53，54，55，56。受损SOCE也可以由镁通道缺陷导致由于致病突变镁转运蛋白1（MAGT1），其结果在与镁缺陷，EBV病毒血症和瘤形成（XMEN）综合征X连锁免疫缺陷57，58。此外，在小鼠中，受损SOCE由于ORAI1或STIM1也妨碍的Th17极化的缺失59，60，和钠已经显示通过上皮钠通道（ENaC的）磁通改变钙信号施加在树突细胞中其促炎作用61。在SLT中，我们证明T细胞激活后钙通量不受影响，并且具有灭活性ENaC突变（假性低醛固酮症1型）的患者未包括在SLT队列中。尽管我们已经证明了多种免疫细胞上存在其他钠转运机制，但这种钙通量不变，并且缺乏氯化钠共转运蛋白抑制作用对Th17极化的影响，以及包含多个离子通道/转运蛋白突变的患者的入院治疗通道/转运蛋白活性对免疫细胞的功能可能是免疫力改变的不太可能的原因。
SLT患者在其特征性的细胞外离子环境中是独特的，直接和间接与肾盐消耗有关。在最近的证据突出酸钠对IL-17响应的效果的光12，13，16，17，62，63上的免疫力，以及在以前的证据表明其它细胞外离子的效果（例如，镁）64，我们假设IL-17应答降低是由于SLT患者体内离子环境的改变。我们证明，在临床相关范围内添加钠，钾和镁既可以促进3天T细胞刺激实验期间Th2：Th17极化比率的降低，又可以促进7天期间Th17和Tc17极化的增加在最适合生产IL-17的培养条件下进行的一日实验。这些数据表明，通常在SLT患者中发现的细胞外离子环境抑制了保护性IL-17反应。我们的实验中证实了以前的数据，证实钠促进IL-17的响应12，13，16，17，62，63，但也强调了钠影响Th2和NK反应的潜在作用，并暗示其他阳离子对Th17极化的影响。我们还首次提供了钠耗竭会影响免疫力并导致IL-17介导的免疫缺陷的证据。此外，在SLT队列中，血压和血清肌酐与感染评分成反比，因此我们建议与其他离子改变相反的细胞外钠是感染风险的主要决定因素。这需要通过直接测量大量SLT患者的钠储量来确认，这是未来研究的一部分。
鉴于提出了通过离子变化来改变SLT免疫力的提议，我们最后测试了体外细胞外离子环境的操作是否可用于增强SLT IL-17反应，如我们在对照中所示。我们证明了介导钠驱动的Th17极化的细胞内途径在SLT患者中是完整的，并且在培养条件中添加NaCl可以挽救Th17极化。这增加了更好地校正SLT患者体内细胞外离子浓度可以改善IL-17反应并减轻感染风险的可能性，因此有必要进行进一步的研究。此外，我们的数据为调查是否可以将细胞外离子环境的操纵用作IL-17介导的炎症疾病的治疗策略提供了依据。
我们证明了SLT患者在天然和记忆细胞群体中没有改变，并且细胞外离子环境影响记忆以及天然细胞，证实了最近的报道65。因此，我们使用PBMC而不是分离的细胞进行IL-17极化实验。我们没有评估所有CD4 + 亚型和调节性T细胞或T滤泡辅助细胞，这两者都可以由钠影响的任何效果14，15，66，在SLT患者是未开发的。同样，已显示钠会影响树突状细胞的功能61但SLT患者的临床表型（不存在复发的病毒和分枝杆菌感染）和IL-17应答的特定缺陷是原发性缺陷不一致在树突细胞67，68。而且，全血测定中的先天细胞因子反应不受影响，因此未进行树突状细胞的进一步功能评估。我们在T细胞活化过程中测量了钙通量，但无法测量患者或对照中的钠通量，因此无法确认SLT患者在免疫细胞上的离子转运机制上没有主要缺陷。SLT患者的肾素-血管紧张素-醛固酮系统被激活，尽管这主要是由于食盐浪费所致，尽管我们评估了醛固酮和血管紧张素II对Th17极化的作用，但我们并未评估肾素的直接作用。具有独立的免疫调节作用69。我们也没有评估已知会影响免疫力的前列腺素E2改变的影响70，并且在某些BS 1、2和4型BS患者中有所增加。最后，我们没有研究钠和其他离子对免疫力的影响在体内的位置，这在本项研究以及其他关于BS的研究中仍然是一个重要的未知数盐对免疫力的影响。
总之，我们描述了SLT患者的新型免疫缺陷，这些患者的粘膜细菌和真菌感染增加，免疫功能失调的其他临床特征包括自身免疫现象，皮炎和过敏性疾病。这些临床特征与IL-17反应受损有关，我们认为这是由于钠浪费和SLT患者发现的独特细胞外离子环境所致。我们强调了多个细胞外离子对免疫细胞激活状态的作用，并证明SLT IL-17反应可能在体外被盐拯救。因此，细胞外离子环境的操作对于SLT患者减轻感染风险可能具有治疗益处。
基因型BS，GS或EAST综合征的患者是从英国伦敦的皇家免费医院和大奥蒙德街医院肾小管疾病诊所招募的。记录招募当天的人口统计，生化和临床数据。比较了loop功能障碍（BS类型1、2和4），远端肾小管功能障碍（GS和EAST综合征）和混合表型（BS类型3）患者的生化参数。
SLT患者经历了结构化的临床病史，侧重于免疫功能失调的临床特征。在年龄和性别相匹配的健康（n = 24）和疾病（n = 22）控件。疾病控制对象包括参加肾小管疾病门诊的患者，但没有证据表明存在明显的食盐浪费表型。这些患者与SLT患者从同一诊所招募，并且经历了相同的结构化临床病史和生化分析。条件包括：近端肾小管病= 7；单基因高血压= 5（家族性高钾血症高血压= 3； STX16突变= 2）；远端肾小管酸中毒/肾钙化= 3; 孤立的肾脏镁浪费= 1；甲状旁腺功能亢进= 1; 肾小管间质性肾炎= 2; 延髓海绵肾= 1; 尿崩症= 1; 非肾性低钾血症= 1（补充表 2）。健康对照是在医院或大学内工作且没有已知疾病的志愿者。比较了SLT组和对照组的每个临床变量的患病率。
随后确定每个与已知由IL-17介导的免疫缺陷引起的感染有关的受试者的感染评分。为此，我们在Hyper-IgE综合征的诊断标准中使用了与感染相关的评分系统，该系统是由IL-17免疫力的遗传缺陷导致的（补充表 5）。比较了SLT和对照组的IL-17相关感染评分。我们还比较了SLT亚型之间的感染评分（根据缺陷转运蛋白和生化组），并将感染评分与SLT患者的血清生化和临床参数相关联。
为了确定皮肤和肌肉的钠存储量，对SLT患者（n = 6）和HCs（n = 4）进行了右下肢的23 Na-MRI成像。将已知浓度为23 Na（分别为0、20、40、60和80 mM）的试管放在视野内的受试者肢体上，并用于定量。在3 T mMR传记上对所有参与者进行扫描，并发送/接收鸟笼23 Na线圈（Stark对比MRI线圈研究）。使用平衡的稳态自由精度（BSSFP）序列（带宽= 289 Hz /像素，回波时间= 3.33 ms，重复时间= 21 ms，信号平均值= 100，分辨率= 3.1）获取三组23 Na加权MR图像×3.1×20毫米3，获取时间= 2:17）。使用内部脚本（Matlab）计算了23张 Na 定量地图。每个参与者在每个钠体模上的每次采集绘制感兴趣区域，每个体模的平均信号用于计算校准曲线，如下所示：[已知的23 Na浓度] = p1 * [平均信号] + p2，其中p1和p2是斜率和截距。然后使用以下值使用p1和p2的值计算每个像素的23 Na浓度：[ 23 Na浓度（mM）] =（[Signal] – p2）/ p1。
为每位患者确定皮肤和4个肌肉组中的平均钠浓度。使用ITK-Snap v3.0软件（http://www.itksnap.org）执行图像分析。在SLT患者和对照组之间比较了皮肤和肌肉中的平均钠浓度。
为了表征尿中微生物群落，从SLT患者（n = 14）和HCs（n = 12）中收集尿液标本，并进行沉积物培养。收集20 ml体积的尿液样本，并通过离心沉淀细胞。将细胞沉淀重悬于400 µl磷酸盐缓冲盐水（PBS）（英国Life Technologies）中，并在PBS中进行十倍系列稀释，以促进微生物菌落的定量。将培养物在37°C的普通培养箱中放置18-24小时。温育后，以每毫升菌落形成单位（cfu / ml）量化所产生的微生物生长。
使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF MS）在哥伦比亚血琼脂（英国奥克斯oid）上分别培养培养的生物，以进行物种级鉴定。在MicroFlex LT质谱仪（美国布鲁克·道尔顿公司）上采用了直接菌落规程。简而言之，将每种培养的分离物点样在96孔靶板上，并用1 µl基质溶液覆盖，该基质溶液由溶于50％乙腈和2.5％三氟乙酸的α-氰基-4-羟基肉桂酸组成。风干5分钟后，加载目标板并使用包含Bruker Taxonomy 16S参考库的MALDI Biotyper 3.0软件程序进行分析。鉴定出的不同菌株的数量，每种菌株的微生物负荷，
为了确定细胞外钠的增加是否直接影响微生物的生长，应采用大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，白色念珠菌和淀粉棒杆菌菌株在37℃的普通培养箱中在显色琼脂（法国Biomerieux）上生长。对每个菌株制备无菌混悬液，其混浊度等于0.5 McFarland标准。对每种菌株进行七次十倍系列稀释，并将每种稀释液与未稀释的细菌悬浮液一起稀释至25微升，接种在四个胰蛋白tone大豆琼脂平板的一个象限中，该平板在有或没有其他氯化钠的情况下制备（未经调整的平板） ，+ 40 mM，+ 80 mM，+ 160 mM）。将板在37℃下孵育，并在24小时后通过目测检查微生物的生长。
SLT患者的初步免疫学分析是在伦敦皇家免费医院的国家健康服务临床实验室进行的。其中包括全血细胞计数，红细胞沉降率（ESR），C反应蛋白（CRP），免疫球蛋白A，G，M和E浓度，补体蛋白C3和C4浓度，淋巴细胞计数和子集（CD3 +，CD4 +， CD8 +，CD19 +，CD16 / 56 +）。
为了评估T细胞的增殖和活化， 通过密度离心（Lymphoprep； Stemcell，目录号07861）从SLT患者（n = 6）和HCs（n = 7）中分离出外周血单个核细胞（PBMC ），并刺激细胞在XVIVO15培养基（Lonza，Lonza，目录号BE02-060F）。对细胞染色生存力（可修复的生存力染料-efluor450; Invitrogen，目录号65-0863-14），CD4（CD4-FITC; BioLegend，目录号300538）和CD25（CD25-PE / Cy7; BioLegend，目录号302612） ），固定和通透（Invitrogen，货号00-5523-00）和Ki67的细胞内染色（Ki67-APC; BioLegend，货号350514）。可行CD4 +的比例 报道了通过荧光激活细胞分选术（FACS）分析的表达Ki67和CD25的细胞。对该门以及所有后续的FACS实验进行门控是通过荧光减一（FMO）。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）（VaccZyme VZV和PCP试剂盒；结合位点，Cat＃MK012和MK092）测量血清中的水痘带状疱疹和肺炎球菌特异性免疫球蛋白G水平。
从SLT患者（n = 20），HCs（n = 19）和疾病对照（n = 18）中分离出PBMC ，并用佛波肉豆蔻酸酯乙酸酯（PMA，50 ng / ml; Sigma，cat）刺激新鲜细胞4 h。 ＃P8139）和离子霉素（1 µg / ml； Sigma，目录号I9657）在存在布雷菲德菌素A（5 µg / ml）的情况下。随后对细胞进行CD4（CD4-FITC），IL-17（IL-17-PE; BioLegend，cat＃512306），IFNγ（IFNγ-APC; BioLegend，cat＃502512）和IL-4（IL-4- PE / Cy7； BioLegend；目录号500824），并通过FACS分析。CD4 +比例 确定表达这些细胞因子的细胞并在组之间进行比较。还对未刺激的细胞进行CD3（CD3-PE / Cy5; BioLegend，cat＃300410），CD4（CD4-FITC），CD8（CD8-BV785; BioLegend，cat＃301046），CD45RA（CD45RA-AF700; BioLegend，cat）染色在SLT患者和对照组之间比较了＃304120）和CD45RO（CD45RO-PE； BioLegend，目录号304206）和T细胞亚群。
为了研究细胞外离子对CD4 + 亚群平衡的影响，分离健康对照PBMC，并在XVIVO15培养基中用抗人CD3（结合10 µg / ml平板）和抗人CD28（1 µg / ml）刺激72 h。以及额外的0–40 mM NaCl，0–2 mM KCl和0–1 mM MgCl 2。在第3天，在存在布雷菲德菌素A（5 µg / ml）的情况下，用PMA（50 ng / ml）和离子霉素（1 µg / ml; Sigma，cat＃I9657）对细胞再刺激4 h。然后对细胞进行生存力染色（eFluor450），CD4（CD4-FITC），IFNγ（IFNγ-APC），IL-4（IL-4-PE / Cy7）和IL-17（IL-17-PE），并进行分析通过FACS。 确定活CD4 +细胞中细胞因子表达的比例。
通过自动分析仪（Cobas 8000模块化分析仪系列，Roche）测量未经调整的XVIVO15介质中的电解质浓度。
从SLT患者（n = 27），HCs（n = 21）和疾病对照（n = 19），并用抗人CD3（结合10 µg / ml平板），抗人CD28（1 µg / ml），IL-1β（12.5 ng / ml； Peprotech，目录号200-01B）刺激的新鲜细胞， IL-6（25 ng / ml; Peprotech，cat＃200-06），IL-21（25 ng / ml; Peprotech，cat＃200-21），IL-23（25 ng / ml; Peprotech，cat＃200 -23）和TGFβ（5 ng / ml; Peprotech，cat＃100-36E）在XVIVO15培养基中放置7天。在第7天，在存在布雷菲德菌素A（5 µg / ml）的情况下，用PMA（50 ng / ml）和离子霉素（1 µg / ml; Sigma，cat＃I9657）对细胞再刺激4 h。然后对细胞进行活力（eFluor450），CD4（CD4-FITC），CD8（CD8-PE / Cy7，BioLegend，cat＃300914）和IL-17（IL-17-PE）染色，并通过FACS分析。通过ELISA（R＆D系统，目录号DY317）测量上清液中IL-17的浓度。存活CD4 + 和CD8 +的比例 确定表达IL-17的细胞，分别代表Th17和Tc17细胞，并在各组之间进行比较。
这些实验还通过在培养条件下添加渗透压（NaCl 0–80 mM，KCl 0–2 mM，MgCl 20–1 mM，甘露醇0–160 mM和葡萄糖酸钠0–80 mM，以及醛固酮（100 nM； Cambridge Biosciences，cat＃B2153），血管紧张素II（0.1–1 µM； Sigma，cat＃A9525）的实验）和氯化钠共转运蛋白（NCC）抑制剂氢氯噻嗪（20 µM； Sigma，目录号H4759）。将补充培养基中的IL-17反应与标准培养条件进行比较。在用NaCl，葡萄糖酸钠和甘露醇进行的实验中，测量了7天培养结束时的上清渗摩尔渗透压浓度（Osmomat 030，Gonotec，柏林），并且每种渗压浓度产生的摩尔渗透压浓度与Th17和Tc17极化相关。还进行了实验，以评估NaCl对分离的天然CD4 + CD45RA +细胞（EasySep人类天然CD4 +T细胞分离试剂盒；STEMCELL，目录号17515），幼稚CD8 + CD45RA +细胞（EasySep人幼稚CD8 + T细胞分离试剂盒; STEMCELL，目录号19258），和记忆CD4 +CD45RO +细胞（EasySep人类记忆CD4 + T细胞分离试剂盒; STEMCELL ，目录号19117）。通过FACS分析确认细胞纯度（＞ 90％）。
为了研究STAT1和STAT3中的磷酸化缺陷，分离了SLT患者（n = 13）的PBMC，并用IL-6（100 ng / ml），IL-21（100 ng / ml）和IL-6（100 ng / ml）刺激了细胞15分钟。根据先前描述的诊断协议;IFNα（R＆d Systems，目录号11101-1 11500 U / ml）的71，72。立即固定细胞（Cytofix固定缓冲液； BD Biosciences，目录号554655），透化（Phosflow渗透缓冲液III； BD Biosciences，目录号558050），并对CD4（CD4-FITC），pSTAT1（STAT1 pY701-Alexa647； BD）染色生物科学，目录号612597）和pSTAT3（STAT3 pY705 – PE； BD生物科学，目录号612569）。对于每一个主题，在STAT1和STAT3磷酸化的提高诱导比未受刺激的CD4 + 和CD4 - 确定细胞，并且将该增加表示为与每个实验中健康对照受试者中看到的增加的比率。
分离健康的对照PBMC，并对NCC（兔抗SLC12A3多克隆一抗； Life Technologies，目录号PA5-80004；山羊抗兔APC偶联二抗； Invitrogen，目录号A-10931），CD4（CD4-FITC）染色），CD8（PE-Cy7）和CD45RA（CD45RA-AF700），并通过FACS分析。除NCC（APC）外，还分别对NCC（APC），CD45（CD45-FITC; BioLegend，cat＃304006），CD3（CD3-BV711）和CD56（CD56-BV510; BioLegend，cat＃318340）进行染色。 ）CD19（CD19-PE / Cy7; Invitrogen，目录号25-0199042）。确定表达NCC的每种细胞类型的百分比。
从HCs（n = 13）和SLT患者（n = 5）和装有比例钙指示剂Indo-1（4μM; Indo-1 AM细胞渗透性; ThermoFisher cat＃I1223）的新鲜细胞中分离出PBMC 。洗涤细胞并对其进行CD4染色（CD4-PerCP / Cy5.5; BioLegend，cat＃300530），然后在XVIVO15培养基中与生物素化的抗CD3（BioLegend; cat＃317320）孵育15-30分钟。CD4 +中Indo-1荧光比 然后通过FACS分析与475 nm（代表游离的细胞内钙）相比400 nM的细胞。在加入抗生蛋白链菌素（40μg/ ml; Avivasysbio，cat＃OPPA01200）激活T细胞之前，收集1分钟的荧光数据以确定基线钙浓度，并再记录5分钟的荧光。创建了钙通量曲线，并在SLT患者和HCs之间比较了该曲线下的面积。
从HCs（n = 8）和SLT患者（n = 7）中分离出PBMC ，并对CD4（CD4-FITC）和IL-23受体（IL23R-PE; R＆D Systems，目录号FAB14001P）染色并用FACS分析。CD4的百分比+ 和CD4 -表达IL23-R细胞进行测定和组间比较。
从HCs（n = 7）和SLT患者（n ＝ 13）和通过在含有蛋白酶抑制剂（Halt蛋白酶抑制剂混合物； ThermoScientific，cat＃1862209）的RIPA缓冲液（Sigma，目录号R0278）中消化制备的蛋白裂解物。定量蛋白质（Pierce BCA分析； ThermoScientific，目录号23227），将35μg样品上样至在120 V下运行60-90分钟的10％SDS-PAGE电泳凝胶（BioRad PowerPac Basic）。将凝胶转移（70 V，90分钟）到硝酸纤维素膜（GE Healthcare，目录号106000006）上，并在室温下于5％牛奶中封闭1 h。将膜与一抗在4°C孵育过夜，然后在室温与二抗孵育1小时。以1：900稀释度使用兔抗SGK1一抗（Abcam，cat＃ab43606），以1：10,000稀释度使用小鼠抗GAPDH一抗（Abcam，cat＃ab8245）。抗兔HRP（Abcam，分别以1：3000和1：5000的稀释度使用cat＃ab205718）和抗小鼠HRP（Abcam，cat＃ab205719）二抗。使用BioSpectrum 810成像系统（UVP）开发了印迹，并使用ImageJ软件对图像进行了定量（https://imagej.net）。确定了SLT患者和HCs之间相对于GAPDH的SGK1表达。
PBMC是从HCs（n = 13）和SLT患者（n ＝ 12），并使用RNA纯化试剂盒（Direct-zol RNA MicroPrep; Zymo Research，cat＃R2061）提取RNA。使用nanodrop分光光度法分析产量，并使用G-Storm GS1热循环仪，使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems，目录号4374966）进行互补DNA合成。然后在LightCycler96（Roche）热循环仪中使用Taqman试剂（Taqman Fast Advanced Master mix； Applied Biosystems，目录号4444556）进行逆转录酶聚合酶改变反应（RT-PCR）。引物用于检测NFAT5（Taqman基因表达测定ID Hs00232437_m1； Applied Biosystems，目录号4331182）和18S（Taqman基因表达测定ID Hs99999901_s1； Applied Biosystems，目录＃4331182）。使用2- ΔCT确定每个受试者中NFAT5相对于18S的表达。然后使用2- ΔΔCT与一名健康对照受试者进行比较。比较了SLT患者和HCs之间的相对表达。
将SLT患者（n = 13）和HCs（n = 42）的全血在RPMI培养基中以1：5稀释，并在96孔板中激活，并单独或组合使用以下刺激物：IFNγ（2×10 4 IU / ml，免疫工具）；IL-12（5μg/ ml;免疫工具）; 脂多糖（LPS，1μg/ ml; List Biochemicals）; IL-18（5μg/ ml; R＆D系统）; 酵母聚糖（ZYM，10 mg / ml; InvivoGen）; β-葡聚糖（B-GLUC，5 mg / ml，InvivoGen）; IL-15（5μg/ ml;免疫工具）; Pam2（1 mg / ml; EMC Microcollections）; Muramyldipeptide（MDP，4 mg / ml; InvivoGen）。
将细胞孵育24小时，然后在Luminex分析仪上通过多重磁珠阵列（TNF，IL-1β，IL-6，IL-10，IL-12和IFN-γ； R + D Systems Fluorokinemap）测量上清细胞因子。 Bio-Plex，英国BioRad）。比较了SLT患者和HCs之间每种刺激条件的细胞因子浓度。
从SLT患者（n = 14）和HCs（n = 12）中分离出PBMC，并对CD14（CD14-APC / Cy7; BioLegend，cat＃325619）和CD16（CD16-FITC; BioLegend，cat＃302006）进行染色并进行分析与FACS。古典（CD14 + CD16 - ），中间体（CD14 + CD16 +）和非经典的（CD14 - CD16 +）单核细胞群进行测定和组间比较。还用LPS（100 ng / ml;来自大肠杆菌的 LPS）刺激细胞4小时血清型R515; 在布雷菲德菌素A（5 µg / ml）的存在下，Hycult Biotech，cat＃HC4048）。在固定和透化之前，对细胞进行活力（alexafluor450）和CD14（APC / Cy7）染色，对TNF（TNF-Alexafluor488; BD Biosciences，cat＃557722）进行染色，并用FACS分析。这是在标准培养基中以及在HC中，在补充有40 mM NaCl，2 mM KCl，1 mM MgCl 2和醛固酮（10–100 nM）的培养基中完成的。 比较了SLT和对照之间以及补充培养基和标准条件之间表达TNF的CD14 +活细胞的比例。
从SLT患者（n = 16）和HCs（n = 17）中分离出PBMC ，并对新鲜细胞进行CD45（CD45-FITC），CD3（CD3-BV711），CD56（CD56–BV510）和CD16（CD16）染色-PE / Cy7； BioLegend，目录号302016），并通过FACS分析。CD45 + CD3 - CD56 + CD16 + （NK）细胞作为CD45的比例+ 细胞进行了计算，因为是CD56的比例+ CD16 + 于CD56 + CD16 -细胞。在存在布雷菲德菌素A（brefeldin A）的情况下，IL-12（50 ng / ml; Peprotech，cat＃200-12）和IL-18（50 ng / ml; Cambridge bioscience，cat＃230-00229-10）刺激PBMC。 5μg/ ml; Sigma，cat＃B7651）4 h，并对CD45，CD3，CD56和IFNγ的活力进行染色。可行的CD45的比例+ CD3 - CD56 + 表达IFNγ的细胞进行了测定。在HCs（n = 8）中，在补充有40 mM NaCl的培养基中也进行了刺激。NK细胞的比例（CD45 + CD3 - CD56 +）被确定为是IFNγ的由CD56表达+ 细胞，和标准和高盐条件下进行比较。
补充表10概述了所用的抗体 。
FACS在LSR Fortessa流式细胞仪（BD Biosciences）上进行。使用FlowJo v10软件（https://www.flowjo.com）进行了分析。补充图11概述了门控策略。
数据以分类变量的数量和百分比表示，数字变量的均值和标准差或中位数和四分位数范围取决于分布。使用Fisher精确检验或卡方检验比较分类变量。使用Mann-Whitney检验和Wilcoxon检验分别比较了未配对和配对数据的两组非参数分布数值变量。将参数分布的数值变量与不成对或成对的t进行比较-测试。使用单项方差分析和多次比较检验对两个以上的变量进行比较；具体来说，对于非参数数据，我们使用Kruskal–Wallis检验和Dunn检验进行多次比较。数值变量与皮尔森相关性相关。除非另有说明，否则图形会在中位数和四分位数范围的旁边绘制各个点。
使用Graphpad Prism版本7（www.graphpad.com）进行分析。一个p的≤0.05 -值被认为是统计显著。
皇家自由医院研究与开发委员会批准了该研究（标识号为7727），所有参加者在入组前均提供了书面知情同意书。还获得了同意，以在适当的情况下发布患者可识别的图像。
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