RIG-I样受体（RLR）黑色素瘤分化相关基因5（MDA5）在触发被RNA病毒感染的过程中触发固有的抗病毒反应中起着关键作用。MDA5激活导致I型干扰素（IFN）和促炎细胞因子的转录诱导。MDA5还通过在没有感染的情况下先天免疫反应的功能失调而与自身免疫和自身炎性疾病相关。在这里，我们展示了口蹄疫病毒（FMDV）如何抵消由MDA5产生的特定抗病毒作用，该MDA5靶向蛋白质可被病毒前导蛋白酶（Lpro）裂解。MDA5过表达对具有IFN活性的细胞中FMDV感染具有抑制作用。值得注意的是，免疫刺激性病毒RNA与MDA5在感染细胞中共免疫沉淀。此外，在共转染的细胞中以及在FMDV感染过程中，检测到了Lpro对MDA5的特异性切割。与具有保留的抗病毒活性的不可切割的MDA5突变蛋白相比，检测到与MDA5切割相关的IFN诱导显着降低。MDA5中Lpro的切割位点被鉴定为保守解旋酶基序VI中的RGRAR序列，与最近报道的Lpro在LGP2中涉及Lpro的序列一致，这是RLRs家族中另一个参与抗病毒防御的成员。有趣的是，MDA5 Lpro靶序列内的特定突变与小鼠和人类的免疫疾病有关。我们的研究结果揭示了一种针对病毒逃逸的多效性策略，该策略基于针对免疫传感器的系统发育保守域的病毒蛋白酶。
维甲酸诱导基因-I（RIG-I）样受体（RLRs）是参与抗病毒免疫1的胞质DExD / H box RNA解旋酶家族。RLRS是在感染的细胞的病原体相关分子模式（PAMP）的含病毒RNA键传感器2，3，4。RLR家族包括三个成员：RIG-1，黑色素瘤分化相关基因5（MDA5）和遗传与生理学实验室2（LGP2）。RIG-I感知5´-三磷酸平末端dsRNA，而MDA5被长dsRNA 5激活。。LGP2识别dsRNA，而与5´-三磷酸酯或RNA长度无关。病毒RNA识别后，RIG-1和MDA5通过其caspase激活和募集域（CARDs）6与线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）相互作用。然后，IRF3和NF-κB的激活导致I型干扰素（IFN）的产生，促炎性细胞因子和抗病毒效应基因的诱导。与RIG-1和MDA5不同，LGP2缺少CARD，因此缺少通过MAVS进行的独立信号传导活动。LGP2已知能够提高MDA5依赖性IFN诱导7，8。
该小核糖核酸病毒家族包括显著疾病负担对人类和牲畜小的无包膜正链RNA病毒。其中，手足口病病毒（FMDV），导致传染性很强的疾病影响了猪，牛和其他家畜和野生动物世界各地的9，10。I型干扰素中微小核糖核酸病毒感染的MDA5已与承认他们的双链RNA的复制形式诱导11，12，13，14。当RIG-I -/-，MDA5 -/-或MAVS -/-时MEF中具有不同小RNA病毒的MDA5-和MAVS依赖性的，IFN-β应答诱导的病毒RNA转染11。此外，LGP2或MDA5小鼠缺乏导致由脑心肌炎病毒（EMCV）更高对感染的易感性14，15。然而，RIG-I在MDA5 -/- MEFs中的表达赋予了EMCV感染后16早期强烈诱导IFN-β启动子的能力。
不同的策略来抵消RLR介导的抗病毒反应已经报道了小RNA病毒，主要为肠道病毒和Cardiovirus 17，18。MDA5示于胱天蛋白酶一个或蛋白酶体依赖性肠病毒感染过程中被降解19，20。后来在受感染细胞中的研究支持MDA5裂解依赖于病毒2A蛋白酶（2Apro）21。有趣的是，RIG-I裂解还通过各种肠道病毒和感染cardioviruses过程中观察到，并与病毒3C蛋白酶（3Cpro）相关联的16，21，22。但是，迄今为止，尚未鉴定出MDA5或RIG-I中的切割位点。
关于用于FMDV感染的细胞传感器知之甚少。RNA干扰实验表明FMDV由MDA5 23感测。此外，LGP2的过度表达可以抑制FMDV复制24。FMDV的差分毒力因子是领导者蛋白酶（LPRO），木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶与多功能作用于病毒致病25，26，表现为两种形式，实验室和LB 27，作为Lbpro在感染的细胞更丰富28。FMDV LPRO裂解eIF4G，导致快速帽依赖性翻译切断29，30。Lpro靶向几种细胞蛋白31并参与宿主防御的破坏，降解，NF-κBp65的亚基结合并降低IRF-3/7表达32，33。Lpro去泛素酶活性可能会影响IFN-1信号传导途径的蛋白质，例如RIG-1，TBK1，TRAF3和TRAF6 34。Lbpro也通过不可逆的失活机制从底物蛋白质中移除ISG15 35。最近，在解旋酶基序VI LGP2裂解由Lbpro已经报道36，降低了IFN-β和抗病毒反应。
关于MDA5和FMDV之间的相互作用了解甚少。在这里，我们展示了MDA5在检测和损害FMDV感染中的特定作用。我们从受感染细胞中的MDA5下拉物中分离了IFN-β刺激性RNA，并报告了FMDV如何通过将Mpro5靶向保守的解旋酶基序VI中的Lpro切割来阻碍抗病毒反应。值得注意的是，MDA5的Lpro目标位点内两个氨基酸的单个突变与干扰素致病有关。了解病毒如何抵抗宿主免疫反应，这些免疫反应专门针对保守基序中的效应蛋白，可能有助于设计新的抗病毒药物开发方法，以及针对I型干扰素病的治疗策略。
为了找到感染细胞中MDA5和FMDV RNA之间相互作用的证据，进行了标记RLR下拉实验（图1a）。猪IBRS-2细胞用DDK标签的-MDA5-RIG-I或-2CARD [缺乏解旋酶结构域和C端结构域（CTD）的RIG-1突变体，作为非特异性RNA结合对照）转染并感染FMDV 24小时后。感染后5 h（hpi）裂解细胞，并免疫沉淀MDA5 / RIG-1 /或2CARD / RNA复合物（图1b）。在裂解物中，还检测到了迁移速度稍快的MDA5和RIG-I形式（通常在表达RLRs的细胞中观察到）。有趣的是，观察到一个95 kDa的附加条带，可能对应于FMDV感染期间产生的MDA5 N末端片段（图1b中的箭头）。）。免疫沉淀（IP）之后，分离出共免疫沉淀的RNA，并通过RT-PCR和在FMDV基因组5'和3'区域退火的引物进行分析（图1c）。与RIG-1或2CARD下拉不同，与MDA5相关的RNA均清楚地观察到了两组引物的特异性扩增，这表明在FMDV感染过程中产生的病毒RNA优先与MDA5结合。
病毒RNA下拉程序的示意图。b IBRS-2细胞用编码DDK标签的-MDA5，-RIG-I或-2CARD的质粒（1 µg / 10 6细胞）转染，并在24小时后以FMI为5的FMDV O1K分离株感染。裂解细胞5感染后1 h，对裂解物进行IP免疫，并用抗DDK单克隆抗体进行免疫印迹分析。带有N末端标签的MDA5（约95 kDa）的更快迁移形式用箭头指示。星号表示MDA5和RIG-1形式，迁移速度略快，通常在表达RLR的细胞中观察到。C从IP组分中提取RNA，并通过RT-PCR用两组引物进行扩增，以扩增病毒RNA指示的796-bp 5'-和576-bp 3'-末端区域。指示了与每个通道相对应的特定IP分数（MDA5，RIG-I或2CARD）。阴性和阳性对照包括在RT-PCR分析中（分别为水和体外转录的FMDV O1K RNA）。
为了确定FMDV感染是否产生刺激性RNA，我们首先测量了SK6细胞中IFN-βmRNA的水平，该SK6细胞已被总RNA提取，该总RNA是从FMDV感染的细胞中提取的。与用FMDV感染细胞的RNA转染的细胞相比，用FMDV感染细胞的RNA转染的细胞观察到了IFN-βmRNA的显着诱导（图2a）。接下来，我们分析了MDA5和RIG-I在FMDV感染过程中产生的RNA触发的IFN诱导中的作用（图2b）。）。从感染或模拟感染的SK6细胞提取的总RNA用于转染表达MDA5或RIG-I的SK6细胞，并在转染后2或6小时（hpt）测量IFN-βmRNA水平。来自被FMDV感染的细胞的RNA仅对表达MDA5的SK6细胞具有刺激作用（图2b）。IFN-βmRNA的诱导在6 h高于2 hpt，可能是病毒复制的结果。在6 hpt eIF4G裂解时，很容易检测到FMDV感染后的早期事件（p110片段）（图2b））。为了测试与MDA5相关的病毒RNA是否可以充当PAMP并诱导抗病毒反应，我们分析了与MDA5，RIG-I或2CARD共免疫沉淀的RNA诱导MDA5依赖性IFN-β反应的能力。只有与MDA5共免疫沉淀的RNA才在表达MDA5的SK6细胞中引发IFN-β反应（图2c）。总而言之，我们的结果表明，FMDV感染期间产生的免疫刺激性RNA主要是由MDA5感测的。
（A和B）用FMDV O1BFS以5的MOI感染SK6细胞或模拟感染，并在感染后的不同时间提取总RNA。将感染或模拟感染后5小时从细胞中分离的 RNA转染到新鲜的SK6细胞中（10 pg RNA /细胞）。6小时后裂解转染的细胞，并通过标准化为GAPDH的RT-qPCR确定细胞裂解物中猪IFN-βmRNA的诱导倍数。所示数据为一式三份的平均值±SD，并与来自模拟感染细胞的RNA转染细胞进行了比较。b从感染或模拟感染的SK6细胞（6微克）中提取的总RNA用于转染SK6细胞（5×10 5），该细胞已用编码DDK标签的-MDA5，-RIG-I或-编码的质粒转染了24 h。 EV（1微克/ 10 6细胞）。将细胞裂解2 h或6 hpt，并按照A中的RT-qPCR方法测定细胞裂解液中猪IFN-βmRNA的诱导诱导倍数。数据为一式三份的平均值±SD，并与用模拟感染的RNA转染的细胞进行比较除非另有说明，否则为单元格。通过免疫印迹分析指示的蛋白质。抗DDK单克隆抗体用于检测DDK标签的MDA5和RIG-1。c将 SK6细胞用DDK-MDA5转染，并在24小时后模拟转染或用等量的RNA片段转染，如图1所示的下拉法分析（1.5 µl / 0.5×10 6细胞），并对应于用MDA5，RIG-1或2CARD蛋白免疫沉淀的RNA。2小时后裂解细胞，并通过标准化为GAPDH的RT-qPCR确定猪IFN-βmRNA的诱导倍数。所示数据为一式三份的平均值±SD，并与模拟转染的MDA5表达细胞进行了比较。显示了使用Student's t检验的显着差异（* p <0.05； ** p <0.01）。
已经显示了MDA5在检测FMDV RNA中的相关性，我们分析了MDA5和RIG-I在FMDV感染中的作用。在两种不同的猪上皮肾细胞中测定了每种解旋酶表达的作用。SK6细胞在对病毒感染的应答中诱导IFN，而IBRS-2细胞则失去了这种能力。细胞用DDK标签的RLR或空载体（EV）转染，并在24小时后用FMDV（MOI为1）感染。与EV转染的细胞在10和24 hpi相比，SK6细胞中MDA5的表达诱导病毒滴度的显着降低（图3a）。然而，在RIG-1和EV转染的SK6细胞之间的滴度没有发现显着差异。有趣的是，用不同质粒转染的IBRS-2细胞中的病毒滴度在所有时间点都是相似的（图。3a）。通过免疫印迹证实两种细胞系中RLR和非结构性3A病毒蛋白的表达（图3b）。当通过RT-PCR在表达MDA5-或RIG-I的SK6细胞中感染后通过RT-PCR分析猪IFN-β的mRNA水平时，仅在6和10hpi时在MDA5转染的细胞中观察到可检测的水平（图3c）。一致地，仅在6和10hpi时在MDA5转染的SK6细胞中检测到抗病毒活性（图S1）。总之，我们的结果表明，MDA5是在FMDV感染期间触发I型IFN反应的关键RLR。
用2 µg编码DDK-MDA5，DDK-RIG-1的质粒，空载体（EV）或模拟转染SK6或IBRS-2细胞（1×10 6）。24小时后，将MODV为1的FMDV O1K分离株感染细胞。收集上清液，并在感染后指定的时间裂解细胞。一个实验的示意图被示出。通过噬斑测定法确定从SK6或IBRS-2细胞收集的上清液中的病毒滴度。数据是两次独立实验重复的平均值±SD。使用Student's t检验，表明在EV或RIG-I转染的和MDA5转染的SK6细胞（分别为绿色和蓝色星号）中的病毒滴度之间存在显着差异（* p <0.05； ** p <0.01）。b细胞裂解物通过免疫印迹分析DDK标签蛋白和病毒3A非结构蛋白。微管蛋白用于标准化。cRT-PCR扩增IFN-β和GAPDH mRNA的RNA，该RNA是从SK6细胞中提取的，该SK6细胞已按规定转染或模拟转染，并在感染后指定的时间裂解。由于在24 hpi时发生大量CPE，因此只有MDA5转染的单层细胞才能从剩余的少数附着细胞中提取RNA。GAPDH水平用作负荷对照。
证明了MDA5在检测FMDV感染中的特定作用，我们调查了该病毒是否抵消了MDA5依赖性抗病毒反应。在MDA5-RNA的下拉中，观察到了一条额外的条带（图1b），表明MDA5可能在感染过程中被切割。为了解决这个问题，用两种不同类型的FMDV（表达为MOI 5）感染表达MDA5的SK6细胞，并通过免疫印迹监测MDA5模式，eIF4G的裂解和Lpro表达随时间的变化（图4a）。）。在MDA5水平和病毒Lpro积累之间观察到反相关，这最后解释了在2 hpi观察到的广泛eIF4G裂解。在8 hpi时观察到全长MDA5完全消失或急剧下降，并出现约95 kDa的N末端产物，类似于在5 hpi时在感染细胞中观察到的情况（图1b）。使用针对MDA5 C末端区域的抗体，检测到约25 kDa的产物与检测N末端产物相吻合（图4a））。印迹中25 kDa C末端产物的定量分析显示，在4 hpi时分别用O型或C型FMDV裂解的37.4或34.7％。为了将感染的进程与MDA5裂解相关联并分析其对抗病毒反应的影响，确定了O型病毒感染后上清液中的病毒滴度和抗病毒活性（图4b，c）。抗病毒活性水平以抑制疱疹性口炎病毒（VSV）感染的上清液的最高稀释度来衡量，随FMDV感染的进行而增加，在8 hpi时达到最高水平（图4c）。）。通过将上清液与针对猪IFN-α的抗体孵育，可以完全中和抗病毒活性。最高的病毒滴度（通过对IBRS-2细胞的噬斑测定来测量）和抗病毒活性与最低的MDA5信号（8至24 hpi）重叠，这可能是由于宿主翻译关闭和蛋白质的特殊加工所造成的。我们的结果表明，在猪细胞中FMDV感染期间MDA5被切割。
将猪SK6细胞模拟转染或用2 µg编码DDK-MDA5的质粒转染，并在24小时后以MOI为5感染O型或C型FMDV。在感染后的不同时间裂解细胞。一个裂解物通过免疫印迹进行检测使用指定抗体所指示的蛋白质的分析。箭头指示MDA5的N-和C-末端裂解产物。还描述了eIF4G的110kDa裂解产物。b通过在IBRS-2细胞上进行噬菌斑测定，确定了从用a型感染（O型病毒）分析的细胞中收集的上清液中的病毒滴度。数据为一式三份的平均值±SD。Ç在从细胞的上清液的抗病毒活性分析在一（感染O型病毒）表示为将IBRS-2细胞上的VSV噬菌斑数量减少50％所需的上清液最高稀释度的倒数。当指示时，上清液预先用单克隆抗体抗猪IFN-α处理。数据是三个独立测定的平均值±SD。
当分析FMDV感染期间RIG-1的模式时，未观察到RIG-1裂解的直接证据（图S2A）。
接下来，我们研究了病毒编码的Lpro在MDA5加工中的参与。为此，共表达对DDK-MDA5的HEK293细胞并且或者野生型Lbpro（LbWT）的催化活性形式或以无活性形式（LbC51A）的作用37，38进行了分析。当MDA5与1 µg LbWT共表达时，解旋酶的信号在24 hpt时完全消失（图5a）。使用一定范围的LbWT量，观察到了对全长MDA5的剂量作用（图5b）。有趣的是，检测到分别对应于MDA5的N-和C-末端区域的约95和25kDa的两个切割产物，并与eIF4G切割重叠（图5b）。
用2 µg编码DDK-MDA5或DDK载体的质粒和1 µg编码LbWT，LbC51A或EV（a，c和d）的质粒或增加量的LbWT质粒模拟转染或共转染HEK293细胞（0.2、2、20、200和2000 ng）或2 µg EV（b）。C在zVAD（20 µM），MG132（10 µM）或氯喹（CQ）（50 µM）存在下，共转染HEK293细胞。在对照细胞中，嘌呤霉素（20 µM）诱导了细胞凋亡。24小时后裂解细胞，并通过免疫印迹分析，以使用指定的抗体检测指示的蛋白质。对于在MG132和CQ存在下共转染的细胞，其裂解物的暴露时间更长。箭头指示MDA5的N-和C-末端裂解产物。还描绘了分别为PARP和eIF4G的89-kDa和110-kDa的切割产物。d24 hpt收集裂解物，并用抗DDK单克隆抗体进行IP。通过10％-SDS-PAGE和8％-SDS-PAGE分析IP馏分和裂解物。通过免疫印迹分析指示的蛋白质。MDA5的N末端裂解产物用箭头指示。
为了解决caspase，蛋白酶体或溶酶体途径是否参与FMDV诱导的MDA5降解，分别在其相应抑制剂zVAD，MG132或氯喹存在下进行了MDA5和LbWT共表达测定。监测C末端PARP切割产物（89kDa）的检测作为细胞凋亡的标志。如图5c所示，在抑制剂存在下产生了MDA5裂解产物，所述抑制剂的模式与在未处理的细胞中观察到的模式相似。另一方面，嘌呤霉素诱导的细胞凋亡未导致MDA5裂解。这些结果表明，MDA5降解特别归因于Lbpro的蛋白酶活性。
当分析与Lbpro共表达的RIG-I模式时，未检测到切割的迹象。尽管由于1prog LbWT导致蛋白信号丢失24 hpt（图S2B），这可能是由于Lpro诱导的翻译抑制所致，但随着LbWT量的增加，未检测到RIG-1降解产物（图S2C）。
我们进一步研究了MDA5和Lbpro是否在细胞内相互作用（图5d）。LbC51A与MDA5非常有效地共免疫沉淀，而LbWT被检测为微弱带。LbC51A比LbWT更有效地表达，并积累在转染的细胞36中。带有LbWT的全长24 hpt MDA5的量非常低，只能检测到N末端的裂解产物，这表明LbWT仍然能够结合该MDA5片段。总而言之，这些结果表明FMDV通过Lpro活性诱导MDA5裂解。
由于MDA5中存在LGP2中的Lpro靶位点（图6a），并且切割模式与Lpro在相同区域的切割一致，因此生成了MDA5TM突变体。在MDA5TM中，带正电的R氨基酸RGRAR的片段变为带负电的谷氨酸（EGEAE）（图6a）。等效的三重取代废除了Lbpro 36对 LGP2的切割。用DDK-MDA5或DDK-MDA5TM质粒转染SK6细胞，用O型FMDV（MOI为5）感染，并裂解4或8 hpi。虽然在4和8 hpi时可以清楚地检测到95 kDa N末端和25 kDa C末端的MDA5裂解产物，但未观察到MDA5TM降解产物（图6a））。类似地，通过与增加量的LbWT共表达（图6b）以及在FMDV感染高达24hpi的情况下（图6c），进一步证实了缺乏MDA5TM切割。然而，无论感染量增加（图6c）还是增加量的LbWT（图6b）或病毒编码的Lpro对过表达的MDA5TM帽依赖性翻译的影响），都与eIF4G裂解有关。我们的结果表明，Lpro在RGRAR基序处裂解MDA5，这表明FMDV在相同的保守域中靶向参与针对小核糖核酸病毒感染的抗病毒应答的两个关键病毒传感器MDA5和LGP2。据我们所知，这是病毒蛋白酶MDA5上特异性切割位点的首次报道。
显示了三个RLR和解旋酶基序VI的氨基酸序列的示意图，包括在MDA5TM（R820E，R822E，R824E）中修饰的残基。将SK6细胞模拟转染或用2 µg DDK-MDA5，DDK-MDA5TM质粒或EV转染，然后在24小时后以MOI为5的O型FMDV感染，并在感染后4或8小时裂解。通过免疫印迹分析裂解物以检测指示的蛋白质。在这种情况下，使用多克隆抗DDK抗体检测带有DDK标签的MDA5和MDA5TM。箭头指示MDA5的N-和C-末端裂解产物。还描述了eIF4G的110kDa裂解产物。b将HEK293细胞用2 µg编码DDK-MDA5TM的质粒和增加量的LbWT质粒（0.2、2、20、200和2000 ng）或2 µg EV模拟转染或共转染。24小时后将细胞裂解，并通过免疫印迹分析以检测指示的蛋白质。c用2 µg编码DDK-MDA5TM的质粒对猪SK6细胞进行模拟转染或转染，然后在24小时后以MOI为5感染O型FMDV。在感染后的不同时间裂解细胞，并通过免疫印迹进行分析以检测b中所示蛋白质的含量。
我们进一步询问Lpro对MDA5的切割是否参与了抗宿主抗病毒反应。为此，我们利用了蛋白质的不可切割MDA5版本（MDA5TM），有趣的是，它保留了针对FMDV感染的完全抗病毒活性（图7a）。当MDA5或MDA5TM在SK6细胞中表达时，FMDV感染后几次恢复的病毒滴度之间没有观察到显着差异，两者均比EV转染的对照低2个对数。接下来，我们分析了在8 hpi与FMDV（MOI为5）共表达MDA5或MDA5TM以及LbWT或LbC51A的SK6细胞中的病毒滴度，IFN-βmRNA水平和抗病毒活性。当LbWT与MDA5TM共表达时，与MDA5相比，FMDV滴度显着降低（1.76倍，p = 0.007），而在与LbC51A的共表达中未观察到相关差异（图7b）。相反，与表达催化活性的Lb的细胞相比，表达LbC51A和MDA5或MDA5TM的细胞中的病毒滴度降低了（比较相应的黑色和灰色条）。这些结果与表达活性Lbpro时观察到的eIF4G的完全切割相一致（图7b）。）。在共表达MDA5和LbWT的细胞中，未检测到解旋酶，这可能是由于FMDV编码的Lpro和过表达的LbWT的联合活性。一致地，LbWT的表达在表达MDA5的细胞中诱导了IFN-βmRNA水平的急剧降低，但在表达MDA5TM的细胞中却没有。LbC51A与MDA5或MDA5TM的共表达没有引起IFN-βmRNA的显着降低（图7c）。尽管在共表达LbC51A和MDA5或MDA5TM的细胞中检测到相似的抗病毒活性水平（图7d），但在共表达MDA5和LbWT的细胞上清液中未发现抗病毒活性。但是，在用LbWT和MDA5TM共转染的细胞中测得的抗病毒活性仅略低于表达LbC51A的细胞（图7d）。），表明尽管Lpro诱导了翻译关闭，但不可裂解的MDA5TM诱导的显着水平的IFN依赖性抗病毒活性仍保留在这些细胞中。相反，Lbpro裂解MDA5会导致抗病毒活性完全丧失。
一个 SK6细胞（1×10 6）用2μg编码DDK-MDA5，DDK-MDA5TM或EV的质粒的转染和感染24小时后与FMDV O 1 K分离物在1上清液的MOI在指定的时间收集感染后，通过噬斑测定确定病毒滴度。数据为一式三份的平均值±SD。使用Student 's t检验表明，在MDA5-或MDA5TM转染的和EV转染的SK6细胞（分别为黑色和灰色星号）中的病毒滴度之间存在显着差异（* p <0.05； ** p <0.01）。b – d SK6细胞（1×10 6）与指定的质粒（2 µg DDK-MDA5或MDA5TM； 1 µg LbWT或LbC51A）共转染，并在24小时后以FMI为5的FMDV Cs8分离株感染。收集上清液并裂解细胞8小时感染后。b通过噬斑测定法测定上清液中的病毒滴度。数据为一式三份的平均值±SD。通过免疫印迹分析裂解液中的指示蛋白；用抗MDA5（C端）多克隆抗体检测MDA5和MDA5TM；描绘了eIF4G的110-kDa裂解产物。c通过标准化为GAPDH的RT-qPCR确定细胞裂解液中猪IFN-βmRNA的诱导诱导倍数。数据为一式三份的平均值±SD。表示使用Student's t检验的显着差异（* p <0.05；** p <0.01；ns不重要）。d通过IFN生物测定法测量上清液中的抗病毒活性，并表示为将IBRS-2细胞上的VSV噬菌斑数量减少50％所需的最高稀释度的倒数。当指示时，上清液预先用单克隆抗体抗猪IFN-α处理。数据是重复数据的平均值±SD。
我们进一步证实了Lbpro裂解MDA5对IFN-β反应的有害作用，使用衍生自FMDV基因组（IRES）的合成RNA刺激了MDA5 39（图8）。HEK293细胞与MDA5和不同量的LbWT的共转染导致IFN-β启动子活性的快速有效降低，而其与MDA5TM共表达的作用则较温和，需要更高剂量的LbWT来削弱IFN-β。感应。如预期的那样，在两种情况下，LbWT的高水平表达都会严重干扰IFN-β的诱导。
将HEK293细胞（1×10 6）与50 ngpIFN-β-FL，25 ng pRL-TK和10 ng DDK-MDA5或DDK-MDA5TM共转染，并增加LbWT质粒的量（0.2，2和20 ng）。细胞也用EV或LbWT质粒（20 ng）共转染作为对照。24小时后，将细胞用FMDV IRES RNA转录物进行模拟处理或刺激。24小时后收获细胞，并通过双萤光素酶测定法测量IFN-β的诱导，检测萤火虫萤光素酶在人肾素-β启动子下的表达，所述人IFN-β启动子归一化为肾素活性。数据是两个独立测定重复的平均值±SD。与对RNA处理的MDA5或MDA5TM细胞（LbWT-）进行比较后，表明使用Student's t检验存在显着差异（* p <0.05; ** p <0.01）。
两者合计，我们的结果表明Lpro对MDA5的特异性切割会抑制解旋酶对病毒感染或PAMP RNA转染引起的抗病毒反应。
针对小核糖核酸病毒的抗病毒应答似乎依赖于MDA5对感染过程中产生的dsRNA中间体的检测。然而，RIG-I降解，并且在MDA5 RIG-I依赖性IFN-β诱导- / -肠道病毒感染期间的MEF已经报道16，21，22。在这里，我们揭示了FMDV和MDA5之间的复杂相互作用，提供了MDA5在检测和削弱FMDV感染中的作用的直接证据。我们在FMDV感染的猪细胞中通过MDA5下拉分离了刺激性病毒RNA，MDA5的表达对FMDV感染诱导了强烈的IFN依赖性抑制作用。在表达RIG-I的细胞中未检测到病毒生长的抑制作用，也无法从RIG-I下拉物中扩增病毒RNA。
有趣的是，我们发现了FMDV感染期间Lpro裂解MDA5的证据。LPRO是一个强大的毒力因子的增强FMDV的中和两者的能力，宿主先天和适应性免疫反应，在许多层次25，40。不幸的是，由于蛋白表达水平低和猪细胞中可用抗体的有限交叉反应性，我们无法检测到内源性MDA5的裂解。我们尝试通过在感染前用重组猪IFN-α或RNA转染处理细胞来诱导MDA5表达，从而检测到该蛋白的水平，但也能完全抵抗FMDV感染，而FMDV对I型IFN极为敏感。 。
MDA5和RIG-I的降解似乎并非所有小核糖核酸病毒都常见17。此外，迄今为止，尚未在MDA5或RIG-I上鉴定到特异性切割位点。一些报道肠道病毒感染过程中所描述的胱天蛋白酶或蛋白酶体介导的降解MDA5 19，20。在FMDV感染或Lbpro表达期间观察到的MDA5裂解模式与细胞凋亡，蛋白酶体或溶酶体途径的激活无关。EMCV对RIG-I的切割与3Cpro活性22或3Cpro和caspase活性的组合有关16。然而，冯等。报道说，EMCV感染期间MDA5和RIG-I保持完整，而肠道病毒感染期间MDA5降解与2Apro表达相关[ 21]。在FMDV感染或Lbpro表达期间，我们未检测到任何RIG-I衍生的降解产物。
我们先前报道了解旋酶结构域2（Hel2）36中的FMVI Lpro在基序VI中的RGRAR序列切割LGP2 。该序列存在于MDA5和其他RNA结合蛋白41中。突变蛋白（MDA5TM）带有三个被Lbpro 36消除的LGP2切割已知的取代，被证明具有抗切割性，将MDA5鉴定为Lpro的新细胞靶标，并将RGRAR基序鉴定为特定的切割位点。有趣的是，与MDA5或LGP2相比，RIG-1基序VI的氨基酸序列略有差异。
由于不可裂解的MDA5TM保留了完整的抗病毒活性，因此我们可以清楚地将Lbpro与MDA5的裂解联系起来，从而导致25 kDa C端片段的切除，从而减弱了针对猪细胞中FMDV感染的抗病毒应答。先前的工作表明，删除基序VI导致抗病毒信号的MDA5失活42。的CTD也是有效的dsRNA识别重要通过其与解螺旋酶域提供RNA特异性密切协作43，44。LGP2的少量已经报道，以增强MDA5介导的信号7，45。这种增强作用需要CTD和解旋酶均需保守RNA结合决定簇46。此外，通过其与LGP2 47的相互作用，鉴定出了具有EMCA感染，具有MDA5刺激活性的RNA 。RGRAR序列的Lpro裂解会从MDA5和LGP2中去除部分解旋酶基序VI和CTD，从而产生抗病毒信号的非活性蛋白。这些发现表明，FMDV已开发出一种“多合一”解决方案，可以防止两种蛋白质分别以及协同诱导的抗病毒反应，从而使该病毒具有明显的复制和在宿主中传播的优势。
RIG-1和MDA5的正负调节机制对于严格控制IFN信号是必需的。过MDA5的活化已经与自身免疫性疾病包括单例莫顿综合征（SMS），Aicardi-Goutières综合征（AGS）和系统性红斑狼疮（SLE）有关的48，49。在MDA5编码基因A的增益的功能的错义突变R822Q IFIH1导致I型干扰素和炎性细胞因子的异常和连续的信令，在已经SMS和SLE患者被鉴定50，51。突变小鼠中MDA5窝藏在G821的单个取代，旁边R822，狼疮样肾炎和全身性自身免疫症状发达49，52。R822和G821均位于MDA5的Hel2基序VI中。该部位与Lpro靶部位重叠，已被认为是引起小鼠和人类骨骼异常的“热点” 49。虽然在细胞中观察到与MDA5（图相比表达MDA5TM（轴承突变R822E）FMDV感染期间在IFN-β诱导略有增加7 c和8），无统计学进行它们之间观察到显著差异，和抗病毒活性在测定相应的上清液非常相似（图7d）。因此，当前数据不支持MDA5TM相对于MDA5诱导的IFN水平与与解旋酶基序VI中的突变相关的干扰素病之间的相关性。由于尚未建立针对干扰素性疾病患者的明确治疗方法，因此开始探索使用病毒IFN抑制剂来抑制过度活跃的信号蛋白的活性。副粘病毒蛋白V与MDA5和LGP2废除MDA5依赖性信号相互作用53，54，并通过其LGP2共激活55。这些蛋白质已显示出能够破坏MDA5蛋白质的慢性信号传导和抗病毒活性，其突变具有干扰素致病患者的过度活跃的信号传导特征56。
深入了解先天免疫机制似乎对于开发对抗微生物感染的新疗法至关重要。同样，从病毒病原体汲取的经验教训可能有助于治疗和预防涉及免疫系统的疾病。
HEK293（ATTC），SK6和IBRS-2（CISA-INIA）细胞在DMEM（GIBCO），10％FBS，2 mM谷氨酰胺和青霉素/链霉素（100 U / ml）中于5％CO 2于37°C生长。FMDV C型CS8，O型O1BFS，O1K和VSV在SK6或IBRS-2细胞中繁殖。通过噬斑测定36确定病毒滴度，并表达为噬斑形成单位（pfu）/ ml。
已经描述了编码FMDV LbWT或LbC51A的质粒36。AdolfoGarcía-Sastre提供了编码带有DDK标签的人MDA5和RIG-1和pIFN-β-FL的质粒。MDA5TM（R820E，R822E，R824E）是通过定点诱变（NZYMutagenesis，nzytech）生成的。除非另有说明，否则使用2 µg MDA5-，MDA5TM-，RIG-1-或2CARD编码质粒和1 µg LbWT或LbC51A质粒转染10 6个细胞。用EV将DNA平衡至3 µg。在某些实验中，培养基中补充了20μM嘌呤霉素（Sigma-Aldrich），20μMzVAD-FMK（Promega），10μMMG132（Cayman Chemical）或50μM氯喹（Sigma-Aldrich）。使用TriReagent（Sigma）从FMDV感染的细胞中提取的总RNA，来自RLR-pulldowns或IRES转录本的RNA 57 还用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染了N-氨基丁酸。
如36所述，使用针对MDA5（C-16，针对hMDA5的C末端肽），RIG-1（针对CRIG-15，针对hRIG-1的C末端肽）的一抗，eIF4G 进行蛋白质提取和免疫印迹（D-20，圣克鲁斯），抗FLAG（M2和F7425，Sigma-Aldrich），抗FMDV 3 A（2C2，Emiliana Brocchi 58），抗裂解的PARP（19F4，细胞信号转导），抗FMDV Lpro （针对Lab / Lb融合蛋白59，Ewald Beck）和抗βII-微管蛋白60。辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔，兔抗山羊（Invitrogen）或抗小鼠（Thermo Fisher Scientific）IgG用于检测膜结合蛋白。在某些情况下，通过ImageJ软件对带强度进行了定量。
IBRS-2细胞用DDK标签的-MDA5，-RIG-I或-2CARD质粒（1 µg / 10 6个细胞）转染，在24 h后用FMDV O1K（MOI为5）感染，并裂解5 hpi。将溶胞产物在4°C下用蛋白G-琼脂糖（Roche）进行过夜预纯化，并用抗DDK单克隆抗体（M2，Sigma-Aldrich）进行IP预处理。琼脂糖珠在冰冷的NT2缓冲液（0.05％NP-40、50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl，1 mM MgCl 2）中洗涤3次，重悬于DEPC处理过的水中，并在55°C加热25分钟15分钟 通过苯酚/氯仿提取并用1 µg 大肠杆菌 MRE600 tRNA（Roche）乙醇沉淀分离RNA ，并将其重悬于10 µl DEPC处理过的水中。
用两套引物通过RT-PCR分析从IP馏分（1 µl）中提取的RNA：48°C 30分钟和95°C 10分钟；35个周期分别为94°C 30 s，55°C 45 s和72°C 50 s，然后72°C 7分钟。用SB3（5´-TAAGTTTTACCGTCTGTCCCGAC-3´）和ATG2（5´-CAGTTCCATTTTCCCTGTGGTGCG-3´）进行扩增，得到796 bp的产物，其中包含假结和IRES区，直至第二个引发剂AUG。用3DNEST（5′-GGTCCATGCTTCTTAAAATGAAGG-3′）和SB10（5′-GGCACGTACTTTCTCCATCATCGGGCG-3′）进行扩增，可得到3C-3D区域的576-bp片段。来自FMDV O1K全长克隆和水的RNA转录本（10 pg）分别用作阳性和阴性对照。在1％琼脂糖凝胶上分析等分试样。猪IFN-β和GAPDH引物已有描述39。
通过RT-qPCR定量分析猪IFN-β基因的表达。将经TriReagent（Sigma）分离并经DNase处理（不含Turbo DNA的Ambion）的总RNA（500 ng）在20°C的SuperScript III RT（Invitrogen）上于55°C用于RT 30分钟。RT等分试样（1/10）与SYBR green I（Roche）一起用于qPCR。相对表达使用ΔΔ计算Ç Ť方法正火至GAPDH。先前已经描述了IFN-β和GAPDH引物57。
抗病毒活性是通过VSV感染对IBRS-2细胞的抑制作用57来确定的。简而言之，将SK6细胞质粒转染并用FMDV（MOI为5）感染24 hpt。收集上清液7 hpi，并通过酸性处理随后中和来灭活感染性颗粒。将IBRS-2单层细胞与上清液在37°C下孵育24小时，洗涤并用VSV（50-60 pfu / 1×10 6个细胞）感染。抗病毒活性定义为诱导24 hpi噬菌斑减少50％的最高上清液稀释度。在某些测定中，将上清液与1 µg抗猪IFN-α抗体（K9，PBL）在37°C下孵育1小时。
将HEK293细胞与2 µg DDK-MDA5或DDK载体和1 µg LbWT或LbC51A质粒共转染。在100 µl裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl [pH，7.5]，150 mM NaCl，0.5％NP-40和蛋白酶抑制剂混合物）中以24 hpt收获裂解物，并在4°C下以10,000 x g离心 5分钟。并在4°C下用25 µl蛋白G-琼脂糖（Roche）预清洗1 h。然后，用抗DDK抗体（M2，Sigma-Aldrich）36进行IP 。通过8-10％-SDS-PAGE和免疫印迹分析IP组分和裂解物。
将HEK293细胞（1×10 6）与50 ng在hIFN-β启动子（pIFN-β-FL）下表达萤火虫荧光素酶的报道质粒，25 ng肾性萤光素酶报道质粒（pRL-TK）（Promega）共转染），10 ng DDK-MDA5或DDK-MDA5TM，并增加LbWT质粒的量（0.2-20 ng）。将EV或LbWT质粒（20ng）共转染为对照。24小时后，将细胞模拟处理或用FMDV IRES转录本（0.2 µg / ml）刺激。24 hpt收获细胞并测量IFN-β诱导（Dual-Luciferase Reporter Assay，Promega）。萤火虫的萤光素酶活性被标准化为海肾，并表示为相对于模拟转染细胞的倍数差异。
使用独立样本的未配对Student t检验，使用IBM SPSS软件比较数据。在图中，星号表示统计上的显着差异（*** p <0.001，** p <0.01，* p <0.05）；ns不显着（p > 0.05）。
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