在感染的2至3年中，广泛被中和的抗体（bnAb）在一部分被HIV-1感染的个体中产生。受感染的婴儿经常出现血浆bnAb，最早在感染后1年，提示控制婴儿bnAb诱导的因素与成人不同。了解早期bnAb反应的感染婴儿的病毒特征将提供有关驱动B细胞成熟途径诱导bnAb的抗原性触发因素的关键信息。本文中，我们评估了51名HIV-1进化枝C感染婴儿的血浆bnAb的存在，并确定了与早期bnAb反应相关的病毒因素。靶向env上的V2-apex的血浆bnAb在婴儿精华和广泛的中和剂中占主导地位。婴儿精华中和剂中的循环病毒变异株易受V2-apex bnAb的影响。在婴儿精英中和剂中，多变量感染与靶向多种自体病毒的血浆bnAb相关。我们的数据提供了支持能够诱导针对HIV-1的V2-顶点bnAb的多价疫苗接种方法的信息。
可以减少艾滋病流行的有效的人类免疫缺陷病毒1（HIV-1）疫苗是一个小时的需求。HIV-1包膜糖蛋白（env）是非共价连接的异二聚体（gp120 / gp41）3的三聚体，是广泛中和抗体（bnAbs）的主要目标。的bnAbs能够中和HIV-1的不同的循环变体和在受感染的个体的罕见子集生成的1，2。在动物模型中，例如bnAbs的被动给药已经从HIV-1感染中所示保护3，4，5。在感染了HIV-1的个体中进行的最新研究表明，bnAb的被动给药可有效抑制病毒血症6，7，8，9，10。HIV-1 bnAb的分类是基于它们对包膜刺突上五个不同且高度保守的表位的识别，这些表位有望成为疫苗的靶标：位于三聚体顶端V2环内的N160聚糖（V2-顶端），高甘露糖贴片围绕N332中V3区的CD4结合位点（的CD4bs），膜近端外部区域（MPER），和位于所述的gp120-gp41的界面上的N-聚糖1，2。在某些受HIV-1感染的成年人中观察到，在至少感染2到1次后会产生这种bnAb的成年人中观察到，自然感染过程中长时间暴露于病毒环境被认为是开发能够中和多种病毒株的bnAb的先决条件。 3年感染的11，12，13，14。
在HIV-1感染的儿童，血浆bnAbs较早出现的感染，与成人相比，表现出更高的效能及广效15，16，17，18，19。我们观察到交叉中和抗体在HIV-1进化枝C慢性感染儿童中的存在19，并且最近从精英儿科中和剂AIIMS_330 20中产生了bnAb AIIMS-P01 。此外，在这组慢性感染的儿童中，一对同卵双胞胎AIIMS_329和AIIMS_330显示出精制血浆中和活性21。对血浆抗体应答和循环病毒株的纵向分析显示，双胞胎中都存在多种循环病毒，血浆抗体和bnAbs中和的敏感性不同，无论它们的相似遗传构成和感染源如何。在婴儿进行的研究，然而，记载，HIV-1感染的婴儿早在一年后感染制定有效的血浆bnAbs 17，18这表明婴儿中的有效疫苗也许能够触发免疫系统并引起早期bnAb反应，从而为评估围产期感染婴儿的抗体反应提供了动力。此外，从受感染的儿童隔离bnAbs显示非典型成人bnAbs这表明执政bnAb诱导婴儿的因素应与成人不同的特点20，22。
通过母婴传播（MTCT）感染的婴儿，具有明确的遗传瓶颈，导致较小的变异体23感染，为了解与bnAbs诱导相关的病毒因素提供了独特的环境。在这里，我们评估婴儿中循环病毒株的特征，这些病毒株表现出早期的bnAb反应，以了解驱动B细胞成熟途径朝bnAbs诱导的抗原性触发。
为了在我们的51名婴儿中鉴定出具有有效血浆nAb的婴儿，评估了HIV-1特异性血浆bnAb的广度。我们首先通过评估基于TZM-b1的假病毒中和试验中MuLV感染的抑制作用来评估非特异性抑制作用。在51个血浆样品中，有4个显示出非特异性抑制作用，并被排除在进一步分析之外。以识别与早期bnAb响应婴儿，我们接下来执行剩余的47名婴儿的血浆中和活性的抗遗传12个发散假病毒面板24，25代表全球病毒多样性，目的是捕获靶向在全球HIV-1大流行中遇到的多样性的血浆bnAb。在47例婴儿中有19例在中位时间为12个月后观察到跨立群中和活性（CrNA），即在ID 50滴度> 50时中和非立枝C假病毒（不同于感染系）的能力。-感染（pi）（范围= 6-24个月）（图 1a）。此外，针对印度来源的8病毒面板血浆的中和活性进行了评估21，25。虽然整体平均数和印度C进化枝的婴儿的几何平均滴度是可比的，但婴儿对印度C进化枝的广度较高（补充图 1a–c）。
一个热图，代表来自47种婴儿样品的血浆nAb的HIV-1特异性中和滴度（血浆反向稀释）对12种病毒的总体评估。ID 50值按给定的键进行颜色编码，较深的颜色表示ID 50滴定度更高。b，c ^婴儿的几何平均效价广度的比较（假病毒表示>在1/50血浆稀释50％中和）和（Ñ = 47）与慢性感染的儿童先前建立的群组（标记为“少年”）（ñ = 27）和成人（n = 15）。用两尾曼恩-惠特尼U计算了婴儿，青少年与成人之间的统计学差异测试。***表示小于0.001 的p值。d修正的中和分数可预测几何平均滴度。
尽管婴儿对12种病毒的整体检测的血浆中和活性相对较宽，其中21％（10/47）的婴儿中和了≥50％的伪病毒，但与以前表征的慢性感染人群的血浆中和活性相比，它们的功效来自我们实验室的儿童和成人表现出相对较低的震级（图 1b，c），这促使我们在修改的广度-强度矩阵的背景下定义了儿科精英中和剂和广义中和剂。对于婴儿血浆样品，将每种血浆病毒组合的中和百分比记录为固定稀释度为1/50的广度-效能矩阵：> 80％中和得分为3，> 50％分值为2，> 20 ％的分数为1，<20的分数为0。给定血浆的最大累积分数为36，中和分数为各个血浆的累积分数与最大累积分数的比值，以提供中和分数在0–1的连续矩阵上，其值接近1表示强烈的血浆中和活性。计算归一化的中和分数，可预测几何平均滴度和跨包层中和（图。 1d）。临界值0.7定义了第90个百分位数边界，用于定义精英中和器（中和度≥90％伪病毒），临界值0.3定义了第75个百分位数（中和度≥50％）假病毒）（补充图 2a，b）。还基于相同的修改后的广度-效度矩阵计算了先前报告的儿科19和成人26队列中已知精英和广泛中和剂的中和得分，并且本文定义的归一化中和得分可以将儿科和成人精英和广泛中和剂分类（补充图） 。 2B）。根据标准化的中和分数定义中和类别，其中分数≥0.7预测精英中和活动，分数在0.3-0.7范围内预测广泛的中和活动，而分数在0.1-0.3范围内则预测交叉中和。活动。基于此评分系统，将四名婴儿分类为精英中和剂（AIIMS704，AIIMS706，AIIMS709和AIIMS743），将六名婴儿分类为中和剂（AIIMS731，AIIMS719，AIIMS736，AIIMS744，AIIMS732和AIIMS738）。
目前报道的bnAb主要靶向env上的五个表位：V2和V3中的聚糖依赖性位点，CD4结合位点（CD4bs），gp120 / gp41接口和MPER。为了描述这些婴儿精子和广泛的中和剂中血浆bnAb的表位特异性，我们使用了HIV-25710_2_43突变型伪病毒，在表位内包含针对V2-apex，V3-聚糖，CD4bs，gp120–gp41接口和MPER的关键突变。大部分婴儿（8/10）的所述的等离子体bnAbs分别针对V2聚糖，具有两个精英中和剂（AIIMS704和AIIMS706）表示多表位依赖性，特征报告给慢性抗原曝光典型地相关联16，21（图 2a）。对于AIIMS709和AIIMS736，未观察到对五个表位中任何一个的依赖性。为了进一步验证靶向V2-apex的血浆nAb的高频率不是HIV-25710_2_43伪病毒特有的功能，将显示V2-apex依赖性的婴儿血浆进一步与16055，CAP45和BG505 N160A突变型伪病毒作图（图 2b） 。对于AIIMS706，另外，BG505，CAP256和ConC的N332A突变体也被用作血浆，其血浆中还具有靶向V3-聚糖的nAb（图 2c）。）。尽管从一种伪病毒到另一种伪病毒的依赖程度有所不同，但扩展的图谱显示出与用HIV-25710_2_42进行的初始图谱相似的趋势，这证实了这一组婴儿中V2-顶点血浆bnAb的频率较高。有趣的是，在AIIMS704中，除了靶向血浆nAb的V2-顶点外，还观察到MPER依赖性。MPER定向的bnAb在急性感染患者中很少见，这突出了我们在12个月大婴儿中观察到的MPER血浆bnAb的独特性。为了解决AIIMS704血浆nAb对全盘蛋白的泛中和作用是否是MPER介导的或具有两种不同血浆nAb特异性的累加效应，我们从AIIMS704去除了MPER抗体，并用MPER耗尽的AIIMS704检查了对全盘蛋白的中和作用等离子体。 3a，b）。耗尽MPER的AIIMS704血浆抗体中和了全球检测组的50％（6/12），并且显示全球检测组的GMT滴度略微降低了2.14倍。在MPER特异性血浆nAb耗尽后，来自全球专家组的所有循环重组病毒（246F3，BJOX2000，CH119，CNE8和CNE55）均具有抗药性（图 2d和补充图 3c）。AIIMS704 MPER耗尽的血浆nAb能够中和TRO.11，X2278、25710和CE1176。ID 50值可与未耗尽血浆nAb媲美（X2278的ID 50值为112 vs 152; 25710的ID 50值为188 vs 228; CE1176和ID 50的 ID 50值为78 vs 115 TRO.11的值为122 vs 142）。
一个表位作图通过突变病毒在HIV-25710_2_43骨干做了V2-顶点（N160A），V3聚糖（N332A），的CD4bs（R456W），接口（A512W-G514W）和MPER（W672L-F673L-T676A）。PG9（V2-顶点），10-1074（V3-聚糖），3BNC117（CD4bs），PGT151（接口）和10E8（MPER）bnAb被用作阳性对照。b具有多种假病毒主链的婴儿的V2-apex（N160A）依赖性。PG9（靶向bnAb的V2-顶点）用作阳性对照。ÇV3聚糖（N332A）抗各种pseudoviral骨干AIIMS706等离子体的nAb的依赖性。10-1074（靶向V3-聚糖的bnAb）被用作阴性对照。d ID 50的比较滴定的AIIMS704血浆（未标本）和MPER肽消耗血浆的滴度相对于12种病毒的总体水平。一式三份并重复三次进行中和测定。显示了平均Ic50值，并将其用于定义表位依赖性。
接下来，我们将分析重点放在三个参数（病毒载量，CD4计数和感染持续时间）上，以确定驱动bnAb诱导的因素。在CD4计数或感染持续时间与中和广度之间未观察到显着相关性（补充图 4a，b），这表明这些参数并不影响这一队列婴儿的bnAb诱导。高病毒载量与中和广度呈负相关（r = -0.497，p = 0.002）（补充图 4c）。影响bnAb诱导的另一个因素是病毒包膜糖蛋白（env）的多样性。多样性免疫选择压力（中和逃逸）或二重感染可以独立地驱动bnAb感应的结果而产生所述病毒的env 13，14，21。为了在bnAb诱导的背景下定义病毒多样性，我们对环境序列27进行了SGA分析（精英和广泛中和剂中循环的病毒变体的HIV-1 gp120的V2C5区，HXB2位置6690-7757），以评估病毒多样性对bnAb诱导的影响。从精英和广泛的中和剂中，每位婴儿共获得了390个env基因序列，其中大于或等于30个env序列，给出了以5％的群体频率出现的循环变异体测序的90％置信区间（表 1和补充图）。 。 5A-J）。如果是精英中和剂，则会生成45个SGA序列，从而在5％的群体频率下将测序的深度和置信度提高到95％。排除包含大缺失或G-to-A超突变的序列。在整个env基因阅读框中，所有序列都被预测为进化枝C，并且与HIV数据库中的参考序列C.IN.95IN21068.AF067155（GenBank登录号AF067155）具有最高的系统发育相关性。根据V3环序列推断出共受体的用法，并预测所有390个序列均使用CCR5。比对序列，使用荧光笔工具目视检查，并生成最大似然系统树以识别病毒传播的模式。评估成对的原始距离分布（每个位点的核苷酸取代）和env基因多样性（平均遗传距离）以计算宿主内多样性。所有四个精英中和器（AIIMS704，AIIMS706，AIIMS709和AIIMS743）均显示出多变量HIV-1感染的证据（荧光笔图上的明显簇和系统发育树上的明显分支，具有高度的自举支持）28，29，30，31，32，33），其中一个婴儿，AIIMS709，示出了两个高度不同的变体，振振有词由于二重感染，即需要进一步探索（图 3A，3B和 图4a-d ）。来自广泛中和剂（AIIMS731，AIIMS719，AIIMS736，AIIMS744，AIIMS732和AIIMS738）的SGA env序列是单系的（图 3a）。精英中和剂的患者内差异在2.6至15.1之间（表 1）。内患者多样性的这样的程度，是典型的多元感染的 27，29，30，32。AIIMS709具有最大的患者内多样性，进一步证实了高度分化病毒的感染。对于广泛的中和剂，患者内的差异范围为0.3到0.7，这是单个病毒或多种紧密相关病毒感染的典型特征（表 1）。与宽广的中和剂相比，在精英中和剂中观察到显着更高的进化差异（每个位点的核苷酸取代）（p = 0.0095）（补充图 6a，b）。此外，该婴儿队列的多变量感染 与血浆广度的发展显着相关（比值比> 35，p = 0.043），尽管少量样本可能使这种相关性偏斜。
一个 ENV SGA扩增子的最大似然树（V2C5区域，HXB2位置6690-7757）从与精英和宽血浆中和活性的婴儿循环病毒变异体的。BG505.W6M.C2（Clade A，标记为BG5，黄色）和HXB2（Clade B，标记为HXB，棕色）用作分组。观察到AIIMS704（红色），AIIMS706（绿色），AIIMS709（蓝色）和AIIMS743（深粉红色）的明显多个分支。b来自四个精英中和器（AIIMS704，红色； AIIMS706，绿色； AIIMS709，蓝色；和AIIMS743，深粉红色）的全长环境序列（HXB2位置6225–8795）的最大似然树。BG505.W6M.C2（A类，标记为BG5，浅粉红色）和HXB2（B类，标记为HXB，紫色）用作分组。节点上的数字表示引导程序值。水平比例尺代表遗传距离。nt，核苷酸。
a – d荧光笔图，每个婴儿有40个SGA env序列的最大似然树，表明生产性感染了两种以上不同的病毒。最大似然树用颜色编码（AIIMS704-红色，AIIMS706-绿色，AIIMS709-蓝色和AIIMS743-深粉红色）。与该图顶部的序列相比，每个荧光笔图上的彩色哈希标记代表核苷酸差异（A-绿色； T-红色，C-蓝色和G-橙色）。水平比例尺代表遗传距离。nt，核苷酸。
为了获得洞察力并评估与婴儿精英中和剂血浆nAb的发展相关的多变量感染和破译病毒特征的影响，我们接下来从所有四个婴儿精英中和剂中生成了功能性假病毒。通过自体nAbs测试产生的假病毒的中和作用。每个感染婴儿中不同的病毒种群对自体血浆nAbs的敏感性不同，其中几种变异体对自体血浆bnAbs敏感（另一些对中度敏感）（图 5a），我们先前报道这一观察结果是合理的血浆中和活性驱动力21。而且，四个婴儿中没有一个循环病毒株对自体血浆nAb有抗性，这表明在两个不同的病毒变体的背景下产生的env特异性抗体可以靶向两个包膜上的表位。此外，还评估了来自这些婴儿精制中和剂的假病毒对已知bnAb和非nAb的敏感性。大多数伪病毒显示出与靶向V2顶点的bnAb相似的中和敏感性，而对其他bnAb类的敏感性在伪病毒之间有所不同。在所有四个婴儿精英中和剂的假病毒的V2环的B和C链中观察到明显的序列相似性（补充图 7））。对于大多数假病毒，未观察到非nAb的反应性，表明三聚体结构排列良好（图 5a）。为了研究完整的天然env三聚体的抗原和构象特征，我们用来自每个婴儿中和剂的env克隆瞬时转染了HEK293T细胞，这些克隆对自体血浆nAbs和已知的bnAbs表现出最大的敏感性。观察到sCD4对2g12的结合没有影响，该2G12与gp120上暴露的聚糖表位结合，表明CD4结合不诱导gp120解离（图 5b-e和补充图 8）。）。结合开放三聚体的CD4诱导的非中和抗体17b和A32没有结合，在sCD4存在下，只能观察到弱结合。观察到三聚体特异性bnAbs PGDM1400和CAP256.25的主要结合，尽管10-1074和PGT151的结合在env之间确实有所不同。因此，来自这些婴儿精英中和剂的病毒变体易受bnAbs感染，对自体血浆nAbs表现出多种敏感性分布，并且可能采用了封闭的三聚体构象。
使用TZM-bl细胞评估了从精英中和剂到自体血浆nAbs和已知bnAbs循环病毒的中和敏感性。血浆和bnAbs的效力按给定的键进行颜色编码。用针对V2顶点的bnAb可以看到最有效的中和作用。b – e以不同浓度的三聚体特异性V2-顶点针对bnAb（PGDM1400，CAP256.25），V3-聚糖针对bnAb 10-1074，gp120-gp41界面针对bnAb PGT151，CD4诱导的nnAbs（17b和A32，存在和不存在sCD4）以及面向bnAb的gp120外域（2G12，存在和不存在sCD4）。一式三份并重复三次进行中和测定。平均IC50值用于绘制热图。将所有结合实验重复三次，并显示平均MFI值。MFI，中值荧光强度。
在感染了HIV-1的成年人中，bnAbs反应已得到充分确立，而评估在HIV-1感染的儿童中这些反应的研究数量有限。除了选择的研究，缺乏关于婴儿血浆抗体中和活性的信息。在本文中，我们观察到42％的感染婴儿具有跨包中和活性，即使我们使用了较严格的1/50截止值，该研究中使用的病毒组也具有相对较高的难中和假病毒的百分比（2.5-3归一化层分）24，34。在Goo等人进行的研究中。17，有71％的感染婴儿表现出交叉感染的中和作用。研究表明，在不同人群中，HIV-1感染者中跨群体中和活性的发生率为10％至30％。在这项研究中观察到的GMT值偏低，可能是由于有限的抗原暴露时间，中位感染持续时间为12个月。有效的血浆抗体的发展通常需要两到四年血清转换后，由慢性抗原暴露辅助11，12，19，26，35。
目前报道bnAbs主要目标上的env 5组的表位：在V2和V3（V2-顶点和V3聚糖）区，CD4内聚糖位点依赖性结合位点（的CD4bs），gp120的/ gp41的接口，和MPER 1，2。发现这项研究中的婴儿精华和广泛的中和剂的血浆抗体针对V2-顶点。尽管在HIV-1包膜的V2-顶点的序列，糖基化和长度方面的高可变性，针对V2-顶点bnAbs相对早期引起，而且是最有效的类bnAbs中的一个1，2，11，12。本文发现，具有跨包中和活性的婴儿中高频率的V2-apex bnAb与先前在感染儿童中的观察结果一致16。鉴于在拆卸过程中的病毒进入的相对更高的频率，早期诱导，体细胞超突变的中等水平，并且与跨物种保护给出了三聚体其临界函数的表位的结合V2-顶点bnAbs的一致的横进化枝中和活性11，12，35，36，37，38因此，这种bnAb表位一直是近期免疫原设计方法的重点。我们的结果进一步支持了在HIV-1疫苗学领域中探索针对V2顶点靶向bnAb的想法，作为预防或免疫原靶向诱导。在两个婴儿精英中和剂中，观察到多表位依赖性。针对儿童多表位的抗体已有报道，但长期接触已被建议作为多个抗体谱系的发展的机制之一16，19。然而，尚不清楚儿童易患多种bnAb谱系发展的确切因素，需要加以解决。在儿童中很少会产生针对MPER的抗体，这可能是由于获得MPER的结构限制以及MPER bnAb的自身反应性所致。我们在12个月大婴儿中发现的MPER nAb（AIIMS704）表明，有针对性的疫苗接种策略可能会早期诱导类似的bnAb，从而有可能克服阻断此类nAb的相关免疫耐受机制。
在病毒的env，通过免疫选择压力（中和逃逸）或任一二重感染产生多样性，已经被证明是bnAb感应的一个独立的驱动器13，14，21。在我们的队列研究中，观察到多变量感染与血浆中和活性之间存在显着相关性，尽管在募集时，所有婴儿均处于Fiebig VI期，但是观察到的多样性程度无法用建立的突变模型来解释。逃脱由于等离子体的nAb突变选择的结果27，29，33。多元HIV-1感染较常见于成年人比在谁已经通过垂直传播而感染的儿童27，28，29，39。在儿童和成人，用于传输的严格遗传瓶颈通常是由单个病毒变体导致感染40，41，42。HIV-1多变量感染定义为一个人感染了两种或多种不同的HIV-1毒株。根据第二株感染的时机，可以将多变量感染分为共感染41（同时或在血清转化之前获得第二株）和超级感染42。，43（血清转化后获得第二个菌株），但鉴于这项研究的横断面性质，我们只能从类别上解读多变量感染的时间表，因此使用了多变量感染的广义术语。
对确定广泛的中和敏感性和循环抗原HIV-1分离株抗原构象的机制的更好理解将提供有关HIV-1 env的天然结构和构象多样性以及这如何影响中和表型的重要信息。由于免疫选择压力而引起的突变，发展出有效血浆bnAb的受感染个体中的循环病毒特征性地产生了对自体血浆nAbs的抗性。在本文中，在所有四种精英中和剂中均观察到对自体血浆nAb敏感的循环病毒。有趣的是，尽管存在针对血浆nAb的V2-顶点，但AIIMS704，AIIMS706和AIIMS743的循环病毒变体仍在V2-顶点保留了表位定义序列和N-糖基化位点。此外，定义所有bnAb类（V2-apex，V3-聚糖，CD4bs，gp120-gp41接口和MPER）的关键残基的表位保留在AIIMS704和AIIMS706的循环病毒上。HIV-1疫苗策略的一个基本挑战是开发能够表达bnAb表位同时封闭免疫优势的非中和抗体表位的天然三聚体。bnAbs而非nnAbs的优先结合与env gp160多肽有效切割成其组成亚基（gp120和gp41）有关。对于免疫原设计，候选envs的有效裂解是理想的特性。对于大多数来自精英中和剂的env，靶向CD4i的抗体（17b，48d和A32）在sCD4触发后显示可忽略的结合，而三聚体特异的bnAb显示出显着的结合，提示稳定和均一的构象和抗原状态。此外，最近的证据表明，选定的HIV-1病毒变异株具有启动bnAb反应的能力44。鉴于这些婴儿在感染后的一年内产生了显着的抗体反应，因此可以将这些婴儿的envs作为潜在的免疫原候选物进行研究。
在这项针对一小群受HIV-1进化枝C感染的婴儿的横断面研究中，我们证明了多变量感染与血浆bnAb反应的发生有关。虽然暴露于成人两个不同的病毒变异体已被证明是不充分的，以扩大中和抗体应答45，46，我们在多元感染的上下文中的早期bnAb响应的结果可以是婴儿免疫应答的显着特点对HIV-1感染。这需要在已建立的HIV-1感染婴儿队列中进行验证。我们的数据为探索针对儿童HIV-1感染的多价疫苗接种方法提供了关键证据。由于HIV-1具有免疫优势，因此对多价疫苗的研究较少，反过来又会降低疫苗的功效47，48。我们观察到多变量感染婴儿的血浆nAb靶向两种变体，表明在两种不同的病毒变异体的背景下产生的env特异性抗体可以靶向两种包膜上的表位。此外，可以将这些婴儿的病毒变异体作为候选的引发免疫原，以引发靶向V2顶点的bnAb。此外，应在已建立的婴儿队列中进行纵向分析，以了解婴儿的免疫系统如何应对多种HIV-1毒株，这将为指导此类bnAb的早期发展提供重要见识。总而言之，我们的研究结果进一步增加了越来越多的文献，表明婴儿可能具有不同的免疫耐受机制，并且可能允许bnAb的发展。
当前的研究旨在破译影响HIV-1感染婴儿早期诱导血浆bnAb的病毒特征。随机招募了在研究期间访问AIIMS儿科胸科诊所的2岁以下的抗逆转录病毒初治和无症状HIV-1感染婴儿。该研究共招募了51名初次接受抗逆转录病毒和无症状HIV-1感染的婴儿。在获得监护人的书面知情同意后，将血液抽入3 ml EDTA小瓶中，将血浆等分以进行血浆中和测定，病毒RNA分离和病毒载量。该研究已由全印度医学科学研究所的伦理委员会批准（IECPG-307 / 07.09.2017）。受感染婴儿的中位年龄为12个月（IQR，8-19岁），3-（IQR，1498–2562），对数刻度的中位病毒载量为5.804 RNA拷贝/毫升（IQR，5.331–6.301）。
编码代表不同进化枝，单克隆抗体和TZM-bl细胞的HIV-1 env基因的质粒是从NIH AIDS Reagent Program获得的。10-1074和BG18表达质粒由美国洛克菲勒大学的Michel Nussenzweig博士提供。CAP256.09，CAP256.25和b6是从美国IAVI中和抗体中心购买的。HEK293T细胞购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。
使用TZM-b1细胞进行中和测定，TZM-b1细胞是基因工程改造的HeLa细胞系，可组成性表达CD4，CCR5和CXCR4，并在HIV-1 tat启动子下包含荧光素酶和β-半乳糖苷酶基因。中和研究包括47种来自婴儿的热灭活血浆，19种bnAb（PG9，PG16，PGT145，PGDM1400，CAP256.09，CAP256.25、10-1074，BG18，AIIMS-P01，PGT121，PGT128，PGT135，VRC01，N6， 3BNC117，PGT151、35O22、10E8和4E10）和6个非nAb（b6，F105、17b，48d，A32、447-52D）。在连续稀释的热灭活血浆，bnAbs或非nAbs存在下，将包膜假病毒孵育一小时。孵育后，添加新鲜胰蛋白酶消化的TZM-b1细胞以及25 µg / ml DEAE-Dextran。将板在37℃下孵育48小时，在Bright Glow试剂的存在下裂解细胞，并测量发光。使用连续稀释的bnAb或血浆的发光，可生成非线性回归曲线，并以bnAb浓度或血清的倒数稀释度计算滴度，与未处理的病毒对照相比，血清的倒数显示发光减少了50％。对于血浆样品，将每种血浆病毒组合的中和百分比记录为固定稀释度为1/50的广度-效能矩阵：> 80％中和得分为3，> 50％分值为2，> 20％得分为1，<20得分为0。给定血浆的最大累积得分为36，中和得分为各个血浆的累积得分与最大累积得分的比值，连续提供中和得分0至1的矩阵，其值接近1表示强烈的血浆中和活性。21，ID 50滴度下降超过3倍被归类为依赖性。HIV-25710-2.43突变体包括N160A（V2-顶点），N332A（V3-聚糖），R456W（CD4结合位点），A512W-G514W（接口）和W672L-F673L（MPER）。对分别显示V2-apex和V3-聚糖依赖性的样品进行了16055_2_3，CAP45_G3和BG505_W6M_C2的N160A突变体以及CAP256_SU，BG505_W6M_C2和ConC的N332A突变体的扩展映射。
将96孔ELISA板中的4孔在4°C下用MPER-C肽包被过夜。加入100 µl血浆，孵育45分钟后，血浆被反复吸附在其余三个孔中。简而言之，将96孔ELISA板（Corning，美国）在4°C下用2 µg / ml的MPER-C肽包被过夜。用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤涂覆的板。在封闭缓冲液中用5％脱脂乳封闭板。加入血浆的50倍稀释液，以2倍稀释液系列滴定，并在37°C下孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤未结合的血浆抗体，并将板与过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG以1：1000的稀释度温育。在第二抗体温育之后，洗涤孔，并添加TMB底物。显色后，在0.2 MH下停止反应2 SO 4，在450 nm处测量吸光度。
通过单基因组扩增从血浆病毒RNA中扩增HIV-1包膜基因，并直接进行商业测序。使用Sequencher 5.4（Gene Code Corporation）组装SGA扩增的扩增子的各个序列片段。SGA序列的亚型是使用REGA HIV亚型工具（400 bp滑动窗口，步长为200 bp）进行的。使用RIP 3.0（重组识别程序）和jpHMM检查进化枝间重组。在MEGA X 10.1中将核苷酸序列与MUSCLE比对。使用包含5个不变位点的离散伽玛分布的通用逆向替换模型，使用MEGA X 10.1计算最大似然树。在MEGA X 10中进行了每个婴儿的SGA序列内的进化差异。1，并通过平均所有序列对计算为每个位点的碱基取代数。使用最大综合可能性模型进行了分析。站点之间的速率变化采用伽玛分布（形状参数= 5）建模。该分析涉及18个核苷酸序列。所包括的密码子位置是第一+第二+第三+非编码。对于每个序列对，删除所有歧义位置（成对删除选项）。最终数据集中共有2622个职位。对于每个序列对，删除所有歧义位置（成对删除选项）。最终数据集中共有2622个职位。对于每个序列对，删除所有歧义位置（成对删除选项）。最终数据集中共有2622个职位。
GenBank中提供了用于推论系统发育和荧光图的SGA扩增的HIV-1包膜序列，登录号为MN703343-MN703404和MT366192-MT366197。
从AIIMS704，AIIMS706，AIIMS709和AIIMS743（精英中和剂）生成自体复制无能的包膜伪病毒。使用QIAamp病毒RNA迷你试剂盒从140 µl血浆中分离病毒RNA，使用基因特异性引物OFM19（5'-GCACTCAAGGCAAGCTTTATTGAGGCTTA-3'）和Superscript III反转录酶逆转录为cDNA，用于两轮巢式PCR使用High Fidelity Phusion DNA Polymerase（New England Biolabs）扩增包膜基因。第一轮引物由正向引物VIF2（5'-GGGTTTATTACAGAGACAGCAGAG-3'）和反向引物OFM19（5'-GCACTCAAGGCAAGCTTTATTGAGGCTTA-3'）组成。第二轮引物由正向引物ENVA（5'-CACCGGCTTAGGAATTTACTATGGCAGGAAG-3'）和反向引物ENVN（5'-TGCCAATCAGGGAAAAAGCCTTGTGTG-3'）组成。并连接到pcDNA3.1D / V5-His-TOPO载体（Invitrogen）中。通过将PEI-MAX作为转染试剂，以PEI-MAX作为转染试剂，以摩尔比1：2共转染1.25 µg含HIV-1包膜的质粒与2.5 µg包膜缺陷的HIV-1骨架（PSG3Δenv）载体，以接种HEK293T细胞，制备假病毒在6孔培养板上。转染后48小时收获含有假病毒的培养上清液，通过0.4 µ过滤器过滤，等分并保存在-80°C下直至进一步使用。TCID 转染后48小时收获含有假病毒的培养上清液，通过0.4 µ过滤器过滤，等分并保存在-80°C下直至进一步使用。TCID 转染后48小时收获含有假病毒的培养上清液，通过0.4 µ过滤器过滤，等分并保存在-80°C下直至进一步使用。TCID通过在DEAE-右旋糖酐存在下用系列稀释的假病毒感染TZM-b1细胞，并在感染后48小时裂解细胞来确定50。通过在Bright Glow试剂（Promega）的存在下测量发光活性来确定感染滴度。
1.25×10 5使用PEI-MAX，用1.25 µg env编码质粒（带有克隆的env / rev盒的pcDNA3.1）瞬时转染接种在12孔板中的HEK293T细胞。转染后48小时，收获细胞，并根据实验要求将其分配在1.5 ml微量离心管中。为了触发sCD4，添加10 µg / ml的2域sCD4，并在室温下孵育30分钟。对于单克隆抗体染色，使用10 µg / ml抗体，并在染色缓冲液中滴定2倍。将100 µl一抗（HIV-1特异性单克隆抗体）添加到表达envs的HEK293T细胞中，并在室温下孵育30分钟。洗涤后，加入100 µl 1：500稀释的PE偶联的小鼠抗人IgG Fc稀释液，温育30分钟后，在BD LSRFortessa X20上总共获得50,000个细胞。
两尾Mann-Whitney U检验和Kruskal-Wallis检验分别用于比较两个参数和三个参数。所有统计分析均在GraphPad Prism 8.3上进行。甲p的<0.05 -值被认为是显著。一式三份并重复三次进行中和测定。显示平均ID 50值，并将其用于统计比较。重复两次进行结合ELISA，重复三次。OD450的平均值用于绘制曲线。进行三次表面结合测定，并使用平均PE-MFI（藻红蛋白中值荧光强度）值绘制曲线。
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