在SARS-CoV-2感染后，COVID-19患者表现出不同的疾病严重程度。目前尚不了解中和抗体（NAb）反应的幅度与COVID-19患者的疾病严重程度之间的相关性。在队列中的59名康复中的疾病严重程度（包括严重，中度，轻度和无症状）的患者中，我们观察到血清中和能力与疾病严重程度（尤其是严重疾病患者血清中最高的NAb能力）之间呈正相关，而缺乏无症状患者安装有效NAb的能力。此外，在具有严重症状和轻度至中度症状的康复患者之间，NAb亚型的组成也有所不同。
截至2020年7月28日，由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）感染引起的2019年冠状病毒疾病大流行（COVID-19）已在全球造成16,341,920例临床确诊病例和650,805例死亡。1受感染的患者表现出不同的临床表现，根据症状的严重程度，通常可将其分为严重，中度，轻度和无症状四类。2尽管确诊病例和死亡人数每天都在增加，但目前尚无批准用于预防SARS-CoV-2感染或治疗COVID-19患者的药物。
越来越多的证据表明，康复的COVID-19患者可以在疾病发作后不久产生免疫球蛋白G（IgG）型抗体，该抗体特异性结合SARS-CoV-2颗粒的各种结构蛋白，尽管其水平可变。3，4，5，6在这些病毒特异性抗体，只有那些能够阻断SARS-CoV的-2尖峰的（S）蛋白介导病毒附着和/或宿主细胞的条目，被称为中和抗体（NAb的），可有效减少感染。7在几项小型临床试验中，从康复患者身上收集的恢复性血浆或血清NAb在治疗危重病COVID-19患者中显示出可喜的结果。8，9，10，11此外，多种强效SARS-CoV的-2中和活性的人单克隆抗体（mAb）已被从记忆B细胞克隆的由回收COVID-19的患者， 12，13，14，15，16，17，18，19，20，21具有预防或治疗用途的巨大潜力。但是，关于从COVID-19康复的患者中疾病严重程度与SARS-CoV-2特异性NAb反应幅度之间的关系知之甚少。定义疾病严重性与NAb反应的关联将有助于筛选COVID-19康复患者作为治疗性血浆供体以及记忆B细胞提供者，以克隆高亲和力的人中和单克隆抗体来预防或治疗COVID-19。
高滴度NAb的循环提供了针对相应病毒感染的立即保护，可以通过从自然感染中恢复或通过疫苗免疫诱导来实现。迄今为止，没有疫苗批准用于COVID-19预防，虽然几种类型的COVID-19疫苗，包括失活，基于矢量的，DNA和mRNA疫苗，22，23，24，25正在接受临床试验的早期阶段。此外，NAb滴度可以预测从原发性病毒感染中恢复过来的患者再次感染的可能性。目前，关于从COVID-19中恢复的患者是否可以避免再次感染或在将来可获得有效疫苗后仍需要接种疫苗的线索很少。
为了探讨SARS-CoV-2 S蛋白特异性抗体反应与COVID-19康复患者疾病严重程度之间的潜在关联，我们纳入了59名成年患者，48例轻度（n = 4），中度（n = 34），并且严重（n = 10）进入广州市第八人民医院的症状和11例无症状的成年患者进入重庆市公共卫生中心医院。这些患者的中位年龄为47岁（33-62岁，四分位间距（IQR））。50.8％的患者为女性；在症状消除后的出院当天收集血清样品，通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）将SARS-CoV-2核苷酸检测两次为阴性。从症状发作到样本采集的中位时间为20（12-30，IQR）天。通过筛选与COVID-19患者有密切接触史的患者来鉴定无症状患者，并通过SARS-CoV-2 RT-PCR进行确认。疾病严重程度分为无症状，轻度，中度和重度，1）。
SARS-CoV-2 S蛋白由S1和S2亚基组成。S1亚基内的受体结合结构域（RBD）对于病毒与宿主细胞受体人类血管紧张素转化酶2（ACE2）的附着至关重要，而S2通过介导病毒膜融合到宿主细胞膜对于病毒进入至关重要。26，27，28这两个S1-RBD和S2代表的NAbs重要的潜在目标。7我们首先通过IgG酶联免疫吸附试验（ELISA）比较了COVID-19康复患者血清中与SARS-CoV-2的S1，RBD和S2特异性结合的抗体。值得注意的是，重症和中度症状患者分别安装了最多的和第二强的S1，S1-RBD-和S2特异性抗体，而轻度和无症状患者的S1-，S1-RBD-和S2-丰度则显着降低。特异性抗体（图1a–c），突出表明疾病严重程度是SARS-CoV-2 S蛋白特异性抗体水平的关键决定因素。
症状严重程度不同的COVID-19康复患者对SARS-CoV-2的抗体反应。a – c用SARS-CoV-2 S1（a），RBD（b）和S2（c）蛋白包被后，将100倍稀释的COVID-19患者血清与ELISA板的ELISA结合测定。中的虚线一个 - ç表示健康对照组的平均值。* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001和**** P <0.0001。ns不重要。a – c中的误差线表示SEM
接下来，我们评估了这些COVID-19康复患者中抗体阻断RBD和ACE2之间相互作用的能力。与SARS-CoV-2 RBD结合抗体相似，严重症状康复患者的血清阻断RBD–ACE2参与的得分最高，其次是中度症状患者，而轻度和无症状患者的血清抗RBD–ACE2的能力较差。抑制RBD-ACE2相互作用（图2a，b）。
COVID-19康复患者中和SARS-CoV-2的抗体反应。a分数显示ELISA通过COVID-19患者血清介导的SARS-CoV-2 RBD蛋白与ACE2蛋白结合的抑制作用。b饼图显示了在每种所示情况下具有较高（> 50，绿色）或较低（<50，红色）RBD-ACE2结合抑制评分的患者比例。c患者血清介导的荧光素酶编码SARS-CoV-2型假病毒进入ACE2 / 293T细胞的阻断。虚线表示通过ROC曲线分析确定的截止值（7.121）。d饼图显示了在每种所示情况下假病毒中和阳性（<7.121，绿色）或阴性（> 7.121，红色）患者的比例。Ë患者血清介导的SARS-CoV-2病毒进入Vero E6细胞的阻断。f一张表，显示e中所示两组之间SARS-CoV-2病毒RNA倍数减少的倍数变化。* P <0.05，** P <0.01和**** P <0.0001。ns不重要。a，c，e中的误差线表示SEM
随后，我们进行了SARS-CoV-2 S蛋白假型基于慢病毒的中和试验，以检查COVID-19康复患者血清的中和能力。已经证明这种测定法没有生物安全性问题，但与具有真实SARS-CoV-2的标准噬斑测定法一样可靠。17，19，21，我们观察到的血清中和能力呈正疾病严重程度（图相关2c中）。具体来说，有80％的严重症状患者和47.1％的中度症状患者产生了能够完全中和假病毒感染的抗体，而只有25％的轻度症状患者血清样品能够阻断假病毒感染。引人注目的是，在该试验中，无症状患者的血清没有中和假病毒感染的活性（图2d）。）。接下来，我们使用真实的SARS-CoV-2进行中和测定，以探索COVID-19康复患者血清的中和能力。根据基于假病毒的慢病毒中和试验，我们发现重症患者的血清中和能力最高，分别比中度，轻度和无症状患者高61.1倍，1319.1倍和2972.0倍，分别（图2e，f）。
此外，S1，RBD和S2的结合能力彼此正相关（补充图1a–c），还与假病毒中和能力（补充图1d–f）和真实的SARS-CoV- 正相关。2种病毒中和能力（补充图1g–i）。这些数据共同表明，疾病严重程度决定了恢复的COVID-19患者中SARS-CoV-2特异性抗体的大小和中和能力。
鉴于NAb可能同时靶向S1和S2来阻断病毒感染，因此我们7提出了通过上述假病毒中和试验来区分COVID-19患者中S1和S2特异性NAb的方法。为此，我们使用了生物素标记的S1或S2重组蛋白来消耗25名COVID-19患者的血清中相应的抗体，这些患者在图2c，e中被确认具有高度中和作用（补充图2a，b）。耗竭后，我们发现，在所有中和血清中，有40％的患者同时产生了合格的S1和S2 NAb（即在S1或S2特异性抗体耗竭后，血清仍可以完全中和假病毒；标记为“ S1 / S2 -NAbs”）；而40％的患者仅产生S1适应性NAb（“仅S1-NAb”），而4％的患者仅产生S2特异性NAb（“仅S2-NAb”）；有趣的是，16％的血清样品严格依赖于S1和S2特异性NAb的协同作用以有效中和假病毒感染（即，血清中S1或S2特异性抗体的消耗会导致中和失败；标记为“（（S1 + S2）-NAbs”）（图3a，b）。在严重症状患者的NAb中，大多数血清（62.5％）有效中和S1介导的受体附着和S2介导的膜融合，而37.5％的血清仅阻断S1介导的受体结合（图3c）。对于轻度至中度症状患者，NAb的特征更为多样：其中41.2％仅由中和S1的NAb组成，29.4％具有阻断受体结合和膜融合的能力。值得注意的是，这些血清中的23.5％需要S1和S2特异性NAb的组合才能有效中和假病毒感染（图3c）。）。总的来说，我们的数据揭示了针对SARS-CoV-2 S蛋白的NAb反应高度异质性，这种多样性似乎与疾病严重程度密切相关。在具有不同程度症状的COVID-19患者中，NAbs反应多样性背后的免疫机制值得进一步研究。
COVID-19康复患者中针对SARS-CoV-2 S蛋白的中和抗体亚型。一个由患者血清（无损耗）或S1抗体耗竭血清（S1-ABS耗竭）或S2抗体耗竭血清（S2-ABS耗尽）阻断荧光素酶编码SARS-CoV的-2类型的假病毒的进入ACE2 / 293T细胞中。虚线表示通过ROC曲线分析确定的临界值（6.749）。HC健康对照，NC阴性对照。b，c饼状图显示了不同中和抗体（NAb）亚型反应的患者在总共25例患者（b），8例严重患者（c，左图）和17例中度和轻度患者（c，右图）的伪病毒中和阳性。d带有RBD抗体耗竭（RBD-Abs耗竭）或无RBD抗体耗竭（无耗竭）的“仅S1-NAbs”患者血清将编码荧光素酶的SARS-CoV-2型假病毒阻断进入ACE2 / 293T细胞。虚线表示通过ROC曲线分析确定的截止值（6.034）。HC健康对照，NC阴性对照。e饼图显示了“仅S1-NAbs”患者具有RBD-Nab依赖性或非依赖性抗体应答的比例。a，d中的误差线表示SEM
最后，我们调查了被S1重组蛋白耗尽的NAb是否实际上针对RBD具有中和能力。为了这个目的，我们通过显示生物素结合的RBD蛋白介导的下拉反应，去除了显示S1特异性中和的10个血清样品中的RBD特异性抗体（补充图2c）。RBD耗竭后的抗体显示丧失RBD结合能力，但仍保持与S1和S2蛋白的结合，表明RBD Ab耗竭的效率和特异性（补充图2c-e）。值得注意的是，在RBD特异性NAb耗尽后，所有具有S1特异性中和的血清均不能中和假病毒感染（图3d，e），证明RBD特异性NAb严格依赖于病毒脱离宿主受体。这些数据提供了在疫苗设计中专门使用RBD作为S1免疫原的理由，特别是考虑到一些报告显示，在整个S1免疫后该疾病的病情增强。29，30
COVID-19患者显示分层症状，包括无症状，轻度，中度和重度。2使用RBD–ACE2封锁，假病毒中和和真实的病毒中和，我们观察到疾病的严重程度与NAb反应呈正相关。从严重疾病中康复的患者表现出最强的NAb反应。令人惊讶的是，无症状患者无法产生有效的NAb。与疾病严重程度相关的NAb反应的潜在机制尚不清楚。一种可能的解释是，SARS-CoV-2特异性NAb反应的诱导需要增强和延长B细胞受体（BCR）刺激。实际上，在患有严重疾病症状的COVID-19患者中观察到BCR重排增强。31 这可能为COVID-19疫苗设计提供重要的见识，其中疫苗方案应在较长的时间内释放足够的SARS-CoV-2免疫原。
鉴于NAb在保护气道病毒感染中的关键作用，无症状康复的患者可能会遭受SARS-CoV-2再感染。在这种情况下，只要有有效的疫苗，就需要为这些患者接种疫苗。迄今为止，关于防止无症状患者发展为更严重疾病的保护性免疫尚不清楚。这些患者可能会出现强烈的SARS-CoV-2特异性CD8 + T细胞反应，这可能通过直接清除病毒感染的靶细胞来提供保护。但是，此假设需要在以后的研究中得到证实。
我们的结果还证明了能够诱导高滴度NAbs的患者存在巨大的异种NAb反应。大多数患者（80.7％）可以产生S1特异性NAb，其中一半可以产生S2特异性NAb。但是，只有约40％的患者产生了S1和S2特异性感受态NAb。特别是，大约7％的患者必须依靠S1和S2特异性抗体之间的协作才能有效地进行病毒中和。恢复的患者中异质NAb反应的潜在机制仍然未知，需要进一步研究。值得注意的是，所有S1特异性NAb都严格依赖RBD，而RBD特异性抗体的缺失会导致S1特异性血清中和失败。这些结果突显了S1 RBD本身的重要性，但不包括S1蛋白的其他部分，
总之，我们证明了从COVID-19中恢复的患者中NAb反应的幅度与疾病严重程度之间呈正相关。我们还发现疾病的严重性也影响SARS-CoV2特异性抗体的中和异质性。我们的结果突出了需要将轻度疾病和无症状患者纳入未来疫苗接种的需求，并且还建议从COVID-19康复患者中收集血浆应限于被动抗体疗法具有中度至重度症状的患者。我们的数据也为在SAV-CoV-2 RBD作为COVID-19疫苗接种方案中的S1-免疫原专门使用时提供了重要的依据。
参加该研究的59名COVID-19康复患者提供了书面知情同意书，来自不同来源。重症，中度和轻度患者的血清来自广州市第八人民医院。无症状患者的血清来自重庆市公共卫生医疗中心。健康对照受试者为研究中的四个成人参与者。该研究在广州市第八人民医院（KE202001134）和重庆市公共卫生医学中心（2020-023-01-KY）获得了机构审查委员会的批准。
如前所述，1550 ng SARS-CoV-2 S1蛋白（Sino Biological，40591-V08H）或SARS-CoV-2 RBD蛋白（Sino Biological，40592-V08B）或SARS-CoV-2 S2蛋白（Sino Biological，40590-V08B）将每孔100μl磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的PBS包被在ELISA平板（Costar，42592）上于4°C过夜。将ELISA板用100μl封闭缓冲液（5％胎牛血清（FBS）和PBS中的0.1％Tween 20）封闭1 h，然后与稀释的患者或健康对照血清在100μl封闭缓冲液中孵育1 h。用PBST缓冲液（PBS中的0.1％Tween 20）洗涤后，将ELISA板与抗人IgG辣根过氧化物酶（HRP）抗体（Bioss Biotech，0297D）孵育45分钟，然后进行PBST洗涤并添加3,3 '，5,5'-四甲基联苯胺（TMB）缓冲液（Beyotime，P0209）。使ELISA板反应5-10分钟，并用1 M HCl终止缓冲液终止。在450nm处检测到光密度（OD）值。
如前所述，15将每孔100μlPBS中的200 ng ACE2蛋白（Sino Biological，10108-H08H）在4°C下涂于ELISA板上过夜。用100μl封闭缓冲液（PBS中的5％FBS和0.1％Tween 20）封闭ELISA板1 h；同时，将50μl10倍稀释的患者或健康对照血清与7.5 ng SARS-CoV-2 RBD小鼠FC蛋白（Sino Biological，40592-V05H）在50μl封闭缓冲液中孵育1小时。然后将孵育的血清/ SARS-CoV-2 RBD-小鼠FC蛋白混合物添加到ELISA平板中，使其发育30分钟，然后进行PBST洗涤，并与抗小鼠FC HRP抗体孵育（Thermo Fisher Scientific，A16084） 30分钟 接下来，将ELISA板用PBST洗涤并用TMB缓冲液（Beyotime，P0209）处理。5分钟后，用1 M HCl终止缓冲液终止ELISA反应，并在450 nm处测定。
先前描述了伪病毒中和测定。15，32简言之，HEK-293T细胞用pLenti萤光素酶，psPAX2，并且通过使用2019-nCov小号质粒转染跨IT-293转染试剂（Mirus，MIR 2700）。12小时后，将培养基更换为新鲜培养基。转染后64小时，收集含有SARS-CoV-2型假病毒的培养上清液。接下来，将200倍稀释的患者或健康对照血清与SARS-CoV-2型假病毒在37°C混合1小时。然后将表达ACE2的HEK-293T（ACE2 / 293T）细胞与血清/伪病毒混合物孵育过夜，然后用新鲜培养基培养。在混合物温育后40小时，通过荧光素酶报道试剂盒（Promega，E1910）测量SARS-CoV-2型假病毒感染的ACE2 / 293T细胞的荧光素酶活性。
将患者血清在Dulbecco的改良Eagle培养基中稀释（40倍稀释），并与等体积的80-100噬菌斑形成单位SARS-CoV-2（EPI_ISL_444969）在37°C下混合1 h。然后将血清-病毒混合物添加到48孔板的Vero E6细胞单层中，并在37°C的5％CO 2中孵育1小时。除去接种物后，将平板用培养基覆盖，并在37°C下培养48小时。随后，从培养上清液中提取病毒RNA，并根据病毒检测试剂盒的方案（中山大学DAAN Gene Co.，Ltd。）通过定量PCR确定病毒RNA的拷贝。与真实病毒有关的所有实验均在中山大学获得BSL-3认证的机构中进行。SARS-CoV-2病毒RNA减少倍数= 2（样本的CT值-模拟的CT值）。
首先，按照制造商的方案，将SARS-CoV-2 S1蛋白（Sino Biological，40591-V08H）或SARS-CoV-2 RBD蛋白（Sino Biological，40592-V08B）或SARS-CoV-2 S2蛋白与生物素结合。 （Thermo Fisher Scientific，A39257）。然后将与生物素偶联的蛋白与BeaverBeads Mag Streptavidin Matrix（Beaver，22305）在4°C下孵育1.5小时。用PBS洗涤后，将SARS-CoV-2 S蛋白偶联的磁珠与稀释的患者血清在4°C孵育1.5小时。然后收获上清液并通过ELISA测定的SARS-CoV-2 S蛋白质量进行控制。
将具有不同严重程度的患者的血清的SARS-CoV-2抗体滴度或病毒中和功能与单因素方差分析（Tukey多重比较检验）进行了比较。每个假病毒中和功能测定中的临界值通过受体工作特征曲线分析确定，并且具有最高似然比。使用皮尔森相关系数分析了不同SARS-CoV-2抗体效价之间或SARS-CoV-2抗体效价与假病毒效价之间或SARS-CoV-2抗体效价与SARS-CoV-2病毒效价之间的相关性。P值<0.05被定义为具有统计学意义。使用Prism 6软件进行统计分析。
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