埃博拉病毒（EBOV）是一种包膜的单链RNA病毒，可引起埃博拉病毒病（EVD）。据认为，EVD幸存者可免受随后的EBOV感染的侵害，而针对病毒表面糖蛋白（GP）的中和抗体是保护的潜在关联。血清学研究对于评估针对EBOV GP的中和抗体至关重要；但是，对EBOV的处理仅限于4级密闭实验室。在血清学和病毒进入试验中，伪型病毒可用作活病毒的替代品，后者需要高水平的生物控制。但是，中和能力在假病毒平台之间可能有所不同。与现场EBOV中和测定的结果相比，我们评估了EBOV GP假型1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）和水泡性口炎病毒（VSV）的适用性，以测量EVD幸存者血浆的中和能力。基于VSV的假型病毒系统的敏感性，特异性和与活EBOV中和的相关性更高，这在评估EBOV疫苗反应和免疫疗法时尤其重要。因此，此处报道的EBOV GP假型VSV中和测定可用于更好地理解针对EBOV的保护性假定相关性。基于VSV的假型病毒系统的特异性和与活EBOV中和的相关性更高，这在评估EBOV疫苗反应和免疫治疗时尤其重要。因此，此处报道的EBOV GP假型VSV中和测定可用于更好地理解针对EBOV的保护性假定相关性。基于VSV的假型病毒系统的特异性和与活EBOV中和的相关性更高，这在评估EBOV疫苗反应和免疫治疗时尤其重要。因此，此处报道的EBOV GP假型VSV中和测定可用于更好地理解针对EBOV的保护性假定相关性。
埃博拉病毒（EBOV）是丝虫科的一个成员，是一种有包膜的单链RNA病毒，可引起埃博拉病毒病（EVD），这是一种致命性很高的疾病，死亡率高达90％1。自1976年发现EBOV以来，它在中部非洲引起了零星的爆发，并导致了2013-2016年西非EVD流行2，这是有记录以来最大的EBOV爆发，导致28,600多例病例和超过11,300例死亡3。这次暴发构成了国际关注的突发公共卫生事件，并突出显示了迫切需要针对EBOV的疫苗和治疗剂。
EBOV RNA基因组的长度约为19 kb，编码7种主要蛋白质。EBOV的包膜糖蛋白（GP）形成从病毒颗粒表面4突出的同三聚体尖峰。表面GP为宿主细胞附着和融合关键5，6和是中和抗体的靶7。EVD幸存者被认为是保护，以防止后续的EBOV感染和中和抗体的病毒表面GP是保护的可能相关因素8，9。血清学检测，例如噬菌斑减少中和试验（PRNT），对于评估针对EBOV GP的中和抗体至关重要。但是，由于其严重的致病性，人与人之间的潜在传播以及缺乏经过批准的疫苗或抗病毒治疗，因此对EBOV的处理仅限于收容级别（CL）4实验室。高密闭设施昂贵且不易获得，特别是在资源有限的国家和组织中。此外，噬菌斑形成所需的化验形式和时间可能会花费大约9天，这既费时又限制了高通量样品的处理。10，11。
伪型病毒是复制缺陷型嵌合病毒粒子，其包含一种病毒的结构和酶核心，带有另一种病毒的包膜蛋白或糖蛋白，并编码可定量的报道基因。逆转录病毒，包括慢病毒和gammaretroviruses如人类免疫缺陷病毒（HIV）和鼠白血病病毒（MLV），分别和弹状病毒，例如水泡性口炎病毒（VSV），已被广泛用作磁芯假型病毒12，13，其中包括为EBOV 14，15。许多EBOV GP的假病毒中和试验已经发展到调查到EBOV感染和疫苗接种的免疫反应16，17，18，以及用于单克隆抗体（mAb）的疗法的评价19，20，21。
在开发和优化假型病毒中和测定时，需要考虑许多因素，以评估可能影响测定性能的实验参数，并确保准确性和可重复性。这些包括，核心病毒和报道基因的选择，靶细胞系的确定和假型病毒输入的数量，以及与活病毒中和的相关性22。这项研究的目的是评估EBOV GP假型HIV-1和VSV系统与实时EBOV中和测定结果相比，是否适合通过EVD幸存者血浆测量中和。
通过测定一系列靶细胞系中的发光来产生并定量带有来自EBOV（Mayinga）的包膜GP的假型HIV-1和VSV，并对其进行定量，以便确定用于中和测定的最佳细胞系。仅细胞对照用于确定发光的背景水平（补充图S1）。在所有感染了EBOV GP假型HIV-1和VSV的细胞系中均检测到报告基因活性，尽管观察到发光差异，但证明了EBOV GP赋予的组织范围广（图 1a，b）。对于EBOV GP假型HIV-1，在293T / 17细胞中观察到最高TCID 50 / ml值，其次是Huh-7细胞（图 1）。C）。感染293T / 17细胞产生的滴度分别比感染Huh-7，HeLa和Vero E6细胞产生的滴度分别大3、33和73倍。对于EBOV GP假型VSV，在Vero E6细胞中获得最高滴度。Vero E6细胞感染产生的TCID 50 / ml值分别比293T / 17，Huh-7和HeLa细胞感染产生的TCID 值高1.5倍，22倍和30倍（图 1 d）。根据这些结果，选择293T / 17和Vero E6靶细胞系分别用于分别使用EBOV GP假型HIV-1和VSV的所有后续中和测定。
使用不同细胞系滴定EBOV（Mayinga）GP假型化（a）HIV-1和（b）VSV的滴定。测量每孔的相对发光单位（RLU /孔）。误差线是高于和低于平均值的一个标准误差，n =4。EBOV GP假型（c）HIV-1和（d）VSV滴度表示为每毫升50％组织培养物感染剂量（TCID 50 / ml），n = 1。
在测定开发的初始阶段，重要的是使用特征明确的抗体评估假型病毒的中和作用，以证明测定的有效性和准确性。用人抗EBOV GP mAb KZ52评估了EBOV GP假型病毒的中和作用。KZ52是从在Kikwit 1995年爆发的是中和EBOV体外，并且识别在GP的基部构象表位的人类幸存者中分离的抗体23，24，25。人抗EBOV GP的mAb，KZ52无法中和EBOV GP假HIV-1（图 2 A）的范围内进行测试，但是它能够以中和EBOV GP假型VSV（图 2b），表明基于VSV的假型病毒比基于慢病毒的病毒对中和更加敏感，可能在假型HIV-1上的EBOV GP的密度可能不同于在假型VSV或活EBOV上的密度。
EBOV（马英嘉）GP的中和假型（一）HIV-1，N = 2，以及（b）VSV中，n = 4，由人抗EBOV GP的mAb，KZ52。相对于仅假型病毒对照，计算了感染率百分比。显示了具有log（抑制剂）对标准化响应曲线的平均值的数据。误差线是平均值上方和下方的1个标准误差。虚线表示50％的传染性。
为了确定在基于HIV和VSV的检测中使用的最佳假病毒输入，评估了几内亚EVD幸存者供体或人抗EBOV GP mAb KZ52血浆对不同量的EBOV GP假病毒的中和作用。选择了KZ52，因为它是可商购的，并且随附有关其对EBOV GP假型表达荧光素酶的VSV的中和活性的信息。但是，由于EBOV GP假型HIV-1没有被KZ52中和（图 2）。a）在测试范围内，使用来自EVD幸存者的血浆评估了假型HIV-1输入对中和的影响。选择幸存者血浆样品CS001，因为它显示出对活EBOV中和的强中和能力，几何平均滴度（GMT）为1,218。EBOV GP假型病毒单独确定了相对于细胞感染性的百分比感染性（图3a，b ），假性病毒中和的50％抑制浓度（IC 50）通过非线性回归剂量反应曲线模型估算（图3a，b）。 。 3 C，d）。来自EVD幸存者CS001的血浆显示出对测试的所有EBOV GP假型HIV-1的中和活性（图 3一个）。较低的假病毒输入导致更大的变异性和更少的曲线拟合。因此，在随后的中和试验中，EBOV GP假型HIV-1输入至少为8.6×10 4 RLU /孔，目标输入为2.0×10 5 RLU /孔。KZ52中和EBOV GP的所有稀释度假VSV测试（图 3 b）和IC 50个值与假病毒输入的减少量的减少（图 3 d，补充表S1）。当使用3.9×10 4 RLU /孔的EBOV GP假型VSV时，IC 50中和病毒的量（0.07 µg / ml）与根据制造商的产品数据表（0.06 µg / ml）所预期的相似。因此，在随后的EBOV GP假型VSV中和测定中使用了大约3.7×10 4 RLU /孔的目标输入。
EBOV（Mayinga）GP假型（a）HIV-1输入对被EVD幸存者（CS001）血浆中和的影响，n = 2，以及（b）对抗EBOV GP mAb，KZ52，n = 4的VSV的影响。相对于仅假型病毒的对照计算。显示了具有log（抑制剂）对标准化响应曲线的平均值的数据。误差线是平均值上方和下方的1个标准误差。虚线表示50％的传染性。EBOV GP假型（c）HIV-1和（d）VSV中和的IC 50是通过非线性回归剂量反应曲线模型估计的，n = 1。
为了比较EBOV GP假型HIV-1和基于VSV的检测方法的特异性和敏感性，我们使用从2013-2016 EBOV暴发和来自几内亚的10个阴性对照供体。假型病毒中和的IC 50通过非线性回归剂量反应曲线模型估算（补充表S2）。在几个独立的试验中评估了阳性（EVD幸存者）和阴性（英国供体）对照血浆对EBOV GP假型HIV-1和VSV的中和作用（补充图S2））。使用来自英国阴性对照供体的血浆确定中和的背景水平。对于基于HIV-1的测定，其计算为IC 506.28相互稀释。阴性对照血浆未显示出对EBOV GP假型VSV的中和活性，因此将中和的背景水平指定为测定中测试样品的最低稀释度（1/20）。在基于HIV-1的测定中，无法对30个EVD幸存者样品中的三个拟合剂量反应曲线，并且其中六个样品被认为低于中和的背景水平。相反，在基于VSV的中和试验中测试的EVD幸存者样本中，仅一个剂量-响应曲线无法拟合。在基于HIV-1的检测中，在基于VSV的检测中，所测试的10个阴性血浆样品中有3个高于中和背景水平，而仅一个阴性样品在中和背景水平以上。p = 0.0054）（图 4 a）和基于VSV的分析（Mann-Whitney，p <0.0001）（图 4 b，补充表S3）。值得注意的是，这种差异更显著和正和负血浆的分离是在基于VSV的测定（图更好 4 b）中。这些结果的总和清楚地表明，与基于HIV-1的测定相比，基于VSV的EBOV GP中和测定显示出更好的可靠性，特异性和敏感性。
EBOV（马英嘉）GP的中和假型（一）HIV-1和（b）由EVD幸存者和阴性血浆样品VSV。通过非线性回归剂量反应曲线模型估算假型病毒中和的IC 50。显示的是个人数据以及具有95％置信区间（95％CI）的几何平均值。虚线表示中和的背景水平。假型HIV-1中和的背景水平（IC 50 6.28倒数稀释）等于UK阴性对照血浆平均值加上两个标准差，n =7。假型VSV中和的背景水平等于测定中测试样品的最低稀释度（1/20）。突出显示统计上的显着差异（** p <0.01，**** p <0.0001; 曼·惠特尼（Mann-Whitney）。
通过活病毒中和测定法（补充表S3，补充图S3）评估各个血浆样品对真实EBOV的中和能力。当将30例EVD幸存者和10例阴性血浆样本的EBOV GP假型HIV-1中和的IC 50值与实时EBOV中和测定的GMT值进行比较时， 使用非参数Spearman相关性确定了正相关（r s = 0.54）系数（图 5 a），并且具有统计学意义（p = 0.0004）。值得注意的是，具有更强的统计显着性（p <0.0001）正相关（r s = 0.86）中观察到，当IC 50个 EBOV GP的值假VSV中和是与用于活EBOV中和测定GMT值（图相比 5 b）中。与没有阴性对照的活EBOV GMT相比，EBOV GP HIV-1和VSV IC 50的相关系数分别为0.38（p = 0.0375）和0.69（p <0.0001）。因此，基于VSV的EBOV GP假型病毒中和测定法与基于HIV-1的中和测定法相比，与实时EBOV中和效果更好。
使用非参数Spearman相关系数n = 40，将假型（a）HIV-1和（b）VSV（IC 50）的EBOV GP 与实时EBOV（GMT）中和的相关性。虚线表示中和的背景水平。假型HIV-1中和的背景水平（IC 50 6.28倒数稀释）等于UK阴性对照血浆平均值加上两个标准差，n =7。假型VSV中和的背景水平等于测定中测试样品的最低稀释度（1/20）。实时EBOV中和测定中的血清阳性反应由GMT> 8定义。
伪型病毒可以在血清学检测中用作传染性病毒的替代品，以测量针对病毒包膜糖蛋白11的中和抗体。用于剖析对中和严重急性呼吸综合征相关的冠状病毒（SARS-CoV的）抗体应答假型病毒测定26，流感（H5N1和H7N9）27，28，29，狂犬病30，31和基孔肯雅病毒32，例如，发现结果与具有复制能力或活病毒分析的结果有很好的相关性。已证明EBOV CL4 PRNT与EBOV假型VSV CL2荧光还原中和试验（FRNT）33之间具有高度相关性。然而，假型病毒的测定可能不总是准确地确定中和34，35。活EBOV和EBOV GP假中和测定先前已被证明产生可变结果8，36，这可能是由于实验条件和病毒系统不同所致。因此，对于正在研究的特定病毒GP，优化假型病毒中和测定非常重要，以获得可靠的特异性和敏感性。这项研究的目的是评估与实时EBOV中和相比，EBOV GP假型HIV-1和VSV系统对测量EVD幸存者血浆中和能力的适用性。
在感染了EBOV GP（Mayinga）假型HIV-1和VSV的所有细胞系（293T / 17，Huh-7，HeLa和Vero E6）中检测到报告基因活性，尽管发光差异，但证明了EBOV GP赋予的广泛组织范围被观察。这可能反映了不同细胞中病毒进入的一般缺陷。Vero E6细胞表现出相对较低水平的EBOV GP假型HIV-1转导，这可能是由于固有的限制因子TRIM5α所致，该因子通过特异性识别HIV-1衣壳并促进其快速过早拆卸来限制逆转录病毒感染。37。最高TCID 50在分别用EBOV GP假性感染HIV-1和SVT感染293T / 17和Vero E6细胞后，获得了B值。基于VSV的平台的发光测量似乎有很大的差异，这可能是由于萤光素酶信号检测的敏感性所致。这突出了在用于中和测定之前滴定每个假型病毒批次的重要性，并包含多个重复样本。
EBOV GP假型病毒用于评估人抗EBOV GP mAb KZ52的中和活性。KZ52先前已经显示，以中和EBOV假型病毒17，19，38。但是，在此处测试的范围内，KZ52并未显示针对EBOV GP假型HIV-1的中和作用，这表明该假型HIV-1上的EBOV GP可能处于较高水平，从而降低了测定的灵敏度，并且使用更高浓度的KZ52。相反，KZ52能够中和EBOV GP假型VSV。
为了评估不同数量的假病毒输入对中和的影响，分别针对不同数量的假病毒HIV-1和VSV分别筛选了2013-2016 EBOV暴发的EVD幸存者和KZ52的血浆。假型HIV-1数量的减少导致更多可变且不可靠的结果，并且假性病毒中和的KZ52 IC 50随着EBOV GP假型VSV输入数量的减少而降低。在比较中和活性时，在不同数量的假病毒输入之间观察到的中和变异性凸显了包括具有已知活性或效价的标准品或标准物质的重要性，从而可以校准结果39。
两种假型病毒系统均能够测量EVD恢复期患者血浆中的中和抗体，其结果与实时EBOV中和测定呈正相关。但是，基于HIV-1的检测方法对于不同抗体滴度的区分能力似乎很低。测试的一些样品显示出对活EBOV的中和活性，但未显示出对假型病毒的中和作用，反之亦然，因此提出了关于假型HIV-1分析的敏感性和特异性的问题。
在当前的研究中，人类胚胎肾（293T / 17）细胞用于假型HIV-1中和检测，而非洲绿猴肾（Vero）细胞用于基于VSV的检测以及活EBOV检测。因此，这可以解释两种测定之间观察到的结果的某些差异，以及与实时EBOV中和相关的基于VSV的测定的更好性能。另外，当前研究中评估的基于HIV-1-和VSV的假型病毒系统采用了不同的转染方法，这可能会对假型病毒的组成，表面病毒包膜蛋白的密度和/或糖基化产生影响，从而中和结果。这突显了在开发和优化假型病毒中和测定时评估实验条件和方法的重要性。该研究的局限性在于无法评估每种假型病毒类型的EBOV GP掺入水平。同样，对于基于VSV的假型病毒系统，来自rVSV-ΔG-Luc-VSV-G病毒的VSV-G痕迹可以回收到新的假型病毒体中40。因此，使用抗VSV-G杂交瘤细胞培养上清液可产生被抗VSV-G抗体覆盖的假型病毒体，但由于埃博拉病毒GP仍具有感染力。由于结合的抗VSV-G抗体比EBOV GP特异性反应性更多，因此可能引起病毒体的血浆特异性反应性。
在EBOV GP假型与活EBOV中和试验之间存在若干差异，可能影响其结果8。由于其非复制性质，此类假型系统无法概括病毒生命周期中可能被中和抗体41靶向的所有步骤。此外，与真正的EBOV的丝状相比，EBOV GP假HIV-1的圆形，球形或EBOV GP VSV的子弹形状可能会影响其中和的敏感性。此外，GP的假型病毒的表面上的密度可能不一样活EBOV该发现可能导致损失或季表位的掩蔽11，42。此外，活EBOV中GP的成熟和组装在EBOV假型病毒的生成中可能会有所不同，并且与假病毒中单独使用EBOV GP的情况相比，使用完整的活EBOV时，可能导致不同的靶标和/或构象表位。与不存在EBOV GP假型病毒分析的情况相比，在实时EBOV分析中存在脱落的GP或分泌的GP（sGP）也可能对中和产生影响。在现场EBOV分析中，脱落的GP和sGP可以通过与表面GP的交叉反应抗体减少循环病毒的中和作用。但是，在当前的研究中，在基于HIV-1的假型病毒分析中观察到了较弱的相对中和作用。因此，聚乙烯亚胺（PEI）转染在EBOV GP假型HIV-1生产过程中产生的细胞碎片或游离GP可能会干扰中和作用。最后，与实时EBOV中和测定中噬斑形成相比，在EBOV GP假型病毒中和测定中通过测量发光来检测感染的细胞可能会影响中和读数。
EBOV GP假型病毒中和测定对于疫苗评估以及恢复期的血液制品和用作免疫疗法的mAb的评估具有价值。但是，与针对活病毒的中和相比，假型病毒测定可能并不总是准确确定中和。在这项研究中，EBOV GP假型HIV-1和VSV检测均能够检测到来自EVD幸存者的血浆中和，并且与活EBOV中和呈正相关。但是，基于VSV的检测在特异性，敏感性以及与活EBOV中和检测的相关性方面比基于HIV-1的检测要好。这项研究突显了在研究特定病毒GP的情况下优化假型病毒中和测定的重要性，
HIV-1 gag-pol质粒p8.91 43，萤火虫荧光素酶报道基因构建体pCSFLW 44和pCAGGS EBOV（Mayinga）GP（GenBank登录号NC_002549）表达构建体是爱德华·赖特（Edward Wright）赠予的礼物[萨塞克斯大学，布赖顿，美国王国（英国）]。
人类胚胎肾脏（HEK）293T克隆17细胞（293T / 17;美国典型培养物保藏中心（ATCC），英国泰丁顿，CRL-11268）用于所有转染，并用作滴定和假型HIV-1中和的靶细胞系分析。Vero E6 [Vero 76，克隆E6，Vero E6（欧洲认证细胞培养物（ECACC），英国索尔兹伯里，85020206）和Huh-7（Arvind Patel，英国格拉斯哥大学）被用作靶细胞系。所有细胞系在5％CO培养2在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM），高葡萄糖，以升-谷氨酰胺（Gibco，佩斯利，英国）补充有10％的胎牛血清（FBS），经热灭活（Sigma-Aldrich，英国吉林汉姆）。HeLa细胞（ECACC 93021013）也用作目标细胞系，并在补充有10％FBS和1×MEM非必需氨基酸（NEAA）的最低必需培养基（MEM）+ GlutaMAX（Life Technologies，Paisley，UK）中培养）解决方案（Life Technologies）。
2013-2016年EBOV暴发的EVD幸存者的血浆样本在几内亚两个地区（Guéckédou和Coyah）以及英国和几内亚的阴性对照献血者在感染后3到14个月募集，这些人没有明知暴露于EVD并未参加高葬礼等高风险事件，因此在56°C加热灭活30分钟。样品是从已有的生物库中获得的，其活的EBOV中和度为45可用链接匿名格式获得数据（Thomas Strecker，德国菲利普斯大学马尔堡分校）。所有涉及实时EBOV的实验都是在德国马尔堡Philipps大学的CL4实验室中进行的。该生物库是由Horizon 2020年欧盟研究计划“ EVIDENT”建立的。这项研究中使用的所有实验方案均已获得几内亚国家研究与健康伦理委员会的批准[CN全国伦理委员会。所有方法均根据相关指导原则和规章进行，符合道德认证编号33 / CNERS / 15。所有参与者均已获得知情同意。
还在EBOV GP假型病毒中和试验中测试了蛋白A纯化的人抗EBOV GP mAb KZ52（IBT Bioservices Rockville，马里兰（美国），美国）。
如前面详述的进行的HIV-1假型病毒的产生44，46，47。转染前二十四小时，将约8×10 5 293T / 17细胞接种到无菌的6孔细胞培养板（Corning，Ewloe，英国）中，并在37°C，5％CO 2和95％湿度下孵育直到60-80％汇合为止。艾滋病毒GAG-POL质粒p8.91和萤火虫荧光素酶报道基因构建体pCSFLW与EBOV（Mayinga）GP表达载体同时转染，比例为0.6：0.9：0.6 µg（核心：报告基因：包膜），使用10 µl 1 µg在Opti-MEM培养基（Gibco）中，每1 µg DNA含/ ml聚乙烯亚胺（PEI）（Sigma-Aldrich）。过夜转染后，将细胞与新鲜培养基孵育，并在37°C，5％CO 2下孵育。转染后48和72 h收集假型病毒上清液，通过0.45 µm孔滤器（Millex，Millipore，沃特福德，英国），并保存在-80°C。
使用重组VSV制备EBOV GP假型VSV，其中VSV-G基因已被缺失（rVSV-ΔG），并通过荧光素酶报告基因（rVSV-ΔG-Luc）被替换，其方法类似于先前所述的方法48。转染前二十四小时，将约2.4×10 6 293T / 17细胞接种到100 mm无菌无菌培养皿（Corning）中，并在37°C，5％CO 2和95％湿度下孵育直至60–80％合流。使用Trans，用EBOV GP表达载体转染细胞按照制造商的说明进行IT-LT1转染试剂（Mirus Bio，美国威斯康星州麦迪逊市（WI））。过夜转染后，去除培养基，并用伪装有VSV糖蛋白的rVSV-ΔG-Luc（rVSV-ΔG-Luc-VSV-G）感染细胞（Masayuki Saijo，日本国立传染病研究所）在Opti-MEM培养基中的感染复数（MOI）为5，并在37°C，5％CO 2下孵育。2小时后，取出接种物，将细胞用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Gibco）洗涤两次，然后加入新鲜培养基。感染后18-24小时收集假型病毒上清液，通过200x g离心澄清两次在10°C下放置5分钟，然后在− 80°C下保存。在使用前，将假型病毒与抗VSV-G杂交瘤细胞培养上清液（Masayuki Saijo，日本国立传染病研究所，日本东京）以1：125的稀释度在37°C孵育1小时，以减少背景感染由具有VSV-G的残留病毒介导，可以在制备过程中结转48。
所有涉及假型病毒的实验均在英国Porton Down的英国公共卫生（PHE）的CL2设施中进行。
滴定和中和测定法在96-孔白色固体平底聚苯乙烯TC处理的微板（Corning）中进行并基于先前描述的方案44，46，48。
对于假型HIV-1滴定分析，应在Opti-MEM培养基中一式四份制备初始稀释度为1：5的假型病毒五倍系列稀释液，最终体积为100 µl /孔。然后将100 µl大约2×10 4 293T / 17，Huh-7或Vero E6细胞或1×10 4 HeLa细胞添加到每个孔中，并在37°C，5％CO 2下孵育持续48小时。除去培养基，并向每个孔中加入50 µl Bright-Glo荧光素酶测定试剂（Promega，英国南安普敦）的50:50混合物：新鲜培养基，并在室温下孵育至少2分钟，以使细胞完全裂解。使用Glomax-Multi +检测系统发光仪（Promega）测量发光，并确定每毫升的相对发光单位（RLU / ml）。负临界值设置为仅对照孔的细胞平均RLU的2.5倍。使用Reed-Muench方法49确定50％的组织培养物感染剂量（TCID 50）/ ml值。
对于假型HIV-1中和测定，分别在Opti-MEM培养基中一式两份制备血浆样品的2或3倍系列稀释液，起始稀释度分别为1：5或1:10，最终体积为50 µl /孔并在Opti-MEM培养基中与每孔50 µl标准化RLU（由滴定分析计算）一起在Opti-MEM培养基中孵育1小时，在37°C下孵育。然后将100 µl大约2×10 5 293T / 17细胞添加到每个孔中，并在37℃，5％CO 2下孵育48小时，然后如上所述进行化学发光读数。使用以下公式计算传染性：百分比（％）传染性= [（有样品的RLU）/（无样品的RLU）]×100。
对于假型VSV滴定测定，在24小时之前，将约2.5×10 4 293T / 17或1×10 4 Huh-7，HeLa细胞或Vero E6细胞接种在96孔微孔板中，并在37°C，5％CO中孵育2和95％的湿度。除去培养基，并在Opti-MEM培养基中从纯假型病毒开始，将假型病毒的两倍系列稀释液一式四份加到每个孔中，最终体积为100微升/孔。24小时后，获取化学发光读数，并如上所述测定TCID 50 / ml值。
在假型VSV中和前二十四小时，播种约1×10 4 Vero E6细胞，并进行上述滴定孵育。在Opti-MEM培养基中一式两份制备起始浓度为1:10的血浆样品的两倍系列稀释液，在96孔微孔板中以120 µl /孔的最终体积一式两份制备，然后每孔与120 µl标准化RLU孵育在Opti-MEM培养基中制备的假型病毒（根据滴定分析计算），在37°C下放置1小时。从细胞中除去培养基，在37℃，5％CO 2下孵育的条件下，一式四份地向每个孔中加入50μl血浆-假型病毒混合物。1小时后，将50 µl新鲜培养基添加到每个孔中。24小时后测量发光并如上所述计算感染性。
将假型病毒中和试验原始数据标准化为相对于仅假型病毒对照（平均值为100％感染）平均值的感染百分比（％），然后通过非线性回归模型拟合log设置估算假型病毒中和的IC 50（抑制剂）与归一化响应曲线的比较，使用GraphPad Prism v5（美国加利福尼亚州圣地亚哥）。
使用Mann-Whitney检验（GraphPad Prism v5）对两个未配对的组进行统计学比较。使用Spearman非参数相关性（GraphPad Prism v5）量化了两个变量之间的相关性。
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