出生后的早期生活的特征是一个关键时期，在这个时期中，正在发展的新生儿免疫系统从保护性母体抗体诱导的被动免疫转变为功能齐全的免疫系统的能力。母源抗体和新生儿抗体的炎症能力都由Fc区的N-联糖基化控制，尽管已在成年人中进行了广泛研究，但目前尚无关于产后早期抗体糖基化模式的信息。为了表征早期生命中的鼠IgG Fc糖基化谱，我们使用了纳米LC-ESI-Qq-TOF质谱分析来评估5-60天龄BALB / c小鼠血清中特定亚类的Asn-297糖基化模式。从出生到成年 我们观察到所有IgG亚类的促炎性Fc糖基化都有所下降。45和60日龄断奶后，无乳糖和单半乳糖基化的结构显着减少，同时唾液酸化增加，这表明了这一点。该信息表明小鼠的新生和成年之间的过渡伴随着炎症性IgG抗体的减少。我们的研究为越来越多的文献做出了贡献，这些文献表明IgG Fc糖基化的重要性及其在不同生命阶段与炎症的关系。该信息表明小鼠的新生和成年之间的过渡伴随着炎症性IgG抗体的减少。我们的研究为越来越多的文献做出了贡献，这些文献表明IgG Fc糖基化的重要性及其在不同生命阶段与炎症的关系。该信息表明小鼠的新生和成年之间的过渡伴随着炎症性IgG抗体的减少。我们的研究为越来越多的文献做出了贡献，这些文献表明IgG Fc糖基化的重要性及其在不同生命阶段与炎症的关系。
抗体通过与特定抗原结合并促进先天免疫细胞的吞噬作用，在适应性免疫反应中起关键作用。引发这种免疫的能力是由于其独特的Y形结构，具有两个介导抗原识别的抗原结合片段（Fab）和负责效应子功能的可结晶片段（Fc）。具有最长半衰期的最丰富的抗体类别是免疫球蛋白G（IgG），其在人血浆中占75％的抗体，并发挥一系列效应功能，包括抗原识别，抗体依赖性细胞的细胞毒性和补体系统的激活1。
抗体功能在很大程度上依赖于Fc区的糖基化状态，其诱导构象变化这种影响与Fc受体结合（即，FcγR的）和C型凝集素2，3。IgG分子显示单个N-连接的聚糖连接到其重链的Asn-297，从而指导抗体功能4。N-聚糖的核心结构由两个N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）和三个甘露糖残基组成（图 1）。可以通过以下方式来修改此核心结构：在最里面的GlcNAc中添加岩藻糖，通过与甘露糖残基结合的GlcNAc添加触角，用半乳糖延伸触角，将这些额外的半乳糖单元唾液酸化，或者将对等的GlcNAc添加到β中在三甘露糖基核心上连接的甘露糖。具体地，加成的末端半乳糖或唾液酸残基的与芯的Fc聚糖已经提出多的关注，因为已经显示出促进抗炎作用3，5，6，7（图 1）。
IgG抗体中Asn-297 N-联糖基化的示意图。IgG分子图，显示影响抗体炎症能力的两个Fc糖基化位点。聚糖分子由包含四个N-乙酰氨基葡萄糖残基（深蓝色）和三个支链甘露糖分子（绿色）的核心组成。可以通过添加岩藻糖（红色）或半乳糖（黄色）和唾液酸（浅蓝色）来修饰核心结构。唾液酸化的小鼠IgG聚糖带有N-羟基神经氨酸（Neu5Gc），为唾液酸。插图显示了双触角，岩藻糖基化，二唾液酸化的N-聚糖（FA2G2S2）。
抗体糖基化状态的改变与许多不同的病理生理状态有关。在人类和小鼠的疾病恶化期间，IgG抗体显示出降低的半乳糖基化和唾液酸化。这在炎症介导的免疫的条件看作如类风湿性关节炎8，9炎性肠病10，11和哮喘12，13。尽管在30年前的类风湿关节炎患者中注意到了这些促炎性IgG改变14，但是糖基化作为抗体功能决定因素的重要性直到最近才被认识到。
让人想起在疾病发病机理中观察到的糖基化变化，无糖基化的IgG分子的年龄依赖性积累也引起了人们的特别关注。有人建议将半乳糖基化的IgG称为IgG-G0，以促进与衰老过程相关的促炎状态15。在这种情况下，稳定状态下IgG糖基的表征与鉴定与病理学背景相关的变化高度相关。而与老化已经被广泛地在人类中表征从出生到衰老相关的促炎性变化14，16，17，18，19，20，关于小鼠糖基化的知识知之甚少，这些糖基化常用于模拟疾病的发病机理。具体而言，仍然缺乏有关早期生命中IgG糖基化状态的信息。出生后的头两个月是免疫系统成熟的关键窗口21，在此敏感时间内，促炎或抗炎IgG分子的存在可能会充分影响完全免疫能力的建立。因此，我们对本研究的目的是鉴定与BALB / c小鼠出生后这段时期有关的血清IgG库中亚类特异性Fc糖基变异。
为了表征从出生到成年的过程中鼠IgG1的Asn-297糖变异，我们分析了出生后前两个月半乳糖基化和唾液酸化物种的频率分布。结果和表征的结构的代表性质谱显示在图 2中。如图3所示 ，我们观察到随着年龄的增长，半乳糖基化（IgG1-FA2G0）和单半乳糖基化（IgG1-FA2G1）IgG1逐渐下降。促炎性G0占整个出生后IgG1总量的30％，在泌乳阶段（出生后第5天和第15天）无变化，但断奶后逐渐减少，PN45和PN60的频率明显降低（图 3）。一个）。尽管不那么明显，但单半乳糖基化的结构（也占总IgG1的〜30％）显示出相似的变化模式，直到PN30为止没有差异，但与PN5相比，PN45处的百分比显着降低（图 3 B）。有趣的是，-G1结构的唾液酸化在成年过程中显着增加，显示PN45和PN60的百分比显着增加（图 3 C）。相比之下，我们观察到半乳糖基化（IgG1-FA2G2）物种的百分比没有年龄依赖性的差异，该比例不到总IgG1的10％（图 3 D）。然而，与单半乳糖基化的IgG1相似，双半乳糖基化的结构的唾液酸化程度随着成年期的增加而增加（图 3）。E–F）在PN45和PN60处IgG2-FA2G2S2的百分比显着增加（图 3 F）。IgG1-FA2G2Ga1糖型的百分比在发育的第一个月没有显示差异，但后来在PN45和PN60显着增加（图 3 G），唾液酸化的结构（FA2G2Ga1S1）显示出随年龄变化的相似模式（图 3 H） ）。值得注意的是，在我们的研究中分析的产后时期，雄性和雌性后代在IgG1糖基化动力学上均没有差异（参见补充图1）。
（A）来源于五个亚类的BALB / c小鼠IgG糖肽的代表性提取离子色谱图，在C 18纳米柱上分为三个峰。IgG2a / b / c糖肽不能在短时间的LC分离中分离出来，而是作为一个整体进行处理。等位基因变体IgG1f在该菌株中占主导地位，与IgG1i的氨基酸取代（苯丙氨酸变为异亮氨酸）不同。（B）对于每种IgG亚类具有对应的聚糖组成，结构和图示可靠地定量的八种糖型。1组成：H己糖，N GlcNAc，F岩藻糖，G Neu5Gc。2结构：F核心岩藻糖，所述的天线数目，GN半乳糖的数目，嘎半乳糖的α联动，联的Sn的唾液酸（Neu5Gc的）号码。3描述：蓝色正方形-GlcNAc，红色三角形-核心岩藻糖，绿色圆圈-甘露糖，黄色圆圈-半乳糖，浅蓝色菱形-唾液酸（Neu5Gc）。（C）带有双加倍（M + 2H）2+和三加（M + 3H）3+带电糖肽的IgG2a / b / c峰的总质谱图。
5-60天龄的小鼠血清IgG1 Asn-297糖基化。IgG1-（A）FA2G0，（B）FA2G1，（C）FA2G1S1，（D）FA2G2，（E）FA2G2S1（F）FA2G2S2（G）FA2G2Ga1（H）FA2G2Ga1S1的半乳糖基化和唾液酸化百分比。显示了平均值±SEM。男女后代年龄：5天（n = 11），15天（n = 9），30天（n = 10），45天（n = 9），60天（n = 9）。结果代表两个独立进行的实验。显着性用* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001，ANOVA或Kruskal–Wallis进行Dunnett多重比较检验。
IgG2 Asn-297糖变异体的分析显示，在出生后发育的第一个月中，促炎物质逐渐增多，随后在PN45和PN60处显着下降（图 4）。FA2G0和FA2G1的频率均在PN30达到峰值，但后来在PN45和PN60显着降低（图 4 A，B）。这种趋势与在PN45（图中唾液酸化的显着增加相关联的 4 C），表示向抗炎表型的转变。有趣的是，IgG2-FA2G2频率的动力学表现出相反的趋势，在PN30达到最低水平，然后又向PN60升高（图 4）。D）。这种增加在G2与在单的频率的增加显著和二唾液酸化结构FA2G2S1（图链接 4 E）和FA2G2S2（图 4 F）起始于PN45。还通过α-1,3-半乳糖基化（α-gal）结构的频率分布验证了IgG2糖类变体的抗炎性转变，该结构直到PN30才显示出变化，后来随着PN45和PN60唾液酸含量的增加而显着增加。 （图 4 G，H）。与IgG1相似，雌性和雄性后代中IgG2糖基化的变化没有差异（补充图2）。
5-60天龄的小鼠血清IgG2 Asn-297糖基化。IgG2-（A）FA2G0，（B）FA2G1，（C）FA2G1S1，（D）FA2G2，（E）FA2G2S1（F）FA2G2S2（G）FA2G2Ga1（H）FA2G2Ga1S1的半乳糖基化和唾液酸化百分比。显示了平均值±SEM。男女后代年龄：5天（n = 11），15天（n = 9），30天（n = 10），45天（n = 9），60天（n = 9）。结果代表两个独立进行的实验。显着性表示为* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001，使用Dunnett的多重比较检验进行方差分析或Kruskal–Wallis。
我们对IgG3的分析还揭示了随着年龄增长的抗炎趋势，其特征在于Asn-297聚糖的唾液酸含量增加（图 5）。断奶后促炎性FA2G0种类下降，显示从PN30到PN60的频率显着下降（图 5 A）。对于FA2G1，观察到相似的动力学，其水平从PN45开始显着降低（图 5 B）。值得注意的是，此下降伴随着FA2G1S1结构的逐渐增加，从PN30开始（图 5）。C）。双半乳糖基化的物种在出生后的发育过程中没有年龄依赖性的变化，但是它们的唾液酸含量在断奶后显着增加。事实上，相比于PN5，显著增加FA2G2S1和FA2G2S2的丰度，观察到在开始PN30（图 5 E）和PN45（图 5分别F）。同样，直到PN60为止，消炎性α-gal种类的频率也没有显着差异（图 5 G），但显示了类似的唾液酸化动力学，其中-G2Ga1S1从PN30到PN60的含量显着增加（图 5 H）。雄性和雌性后代在IgG3糖变异体的频率分布上没有差异（补充图3）。
5-60天龄的小鼠血清IgG3 Asn-297糖基化。IgG3-（A）FA2G0，（B）FA2G1，（C）FA2G1S1，（D）FA2G2，（E）FA2G2S1（F）FA2G2S2（G）FA2G2Ga1（H）FA2G2Ga1S1的半乳糖基化和唾液酸化百分比。显示了平均值±SEM。男女后代年龄：5天（n = 11），15天（n = 9），30天（n = 10），45天（n = 9），60天（n = 9）。结果代表两个独立进行的实验。显着性表示为* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001，使用Dunnett的多重比较检验进行方差分析或Kruskal–Wallis。
我们分析了从婴儿期到成年期（5至60天）的亚类特异性IgG Fc糖基化模式。我们的研究表明，在产后发育过程中，IgG1和IgG3亚类的特征是随着年龄的增长，促炎性半乳糖基化和单半乳糖基化的结构稳定下降，同时所有抗体亚类中的α-1,3-半乳糖基化IgG均同时增加。IgG2的模式略有不同，单糖基和半乳糖基化的结构从5-30天龄开始略有增加，断奶后又显着下降。我们的结果与人类研究一致，后者显示6至25岁的儿童表现出随着年龄的增长19，半乳糖基化的总IgG聚糖含量降低，而半乳糖基化的总IgG聚糖含量增加，22，23。从成年起，人类研究在约25年代识别此图案的逆转，进行到在这被认为有助于老化过程agalactosylated的IgG连续上涨 15，16，18，19，20。
产后期间表示其间后代依靠被动免疫，以防止感染的关键发展的窗口，直到建立完整的免疫能力的21，24。除了增加半乳糖基化作用外，我们的分析还揭示了从婴儿期到成年期，所有鼠类IgG亚类中唾液酸化的显着增加，表明出生后体液免疫应答的成熟与抗体糖基化朝着较少促炎性的转变有关。因此，这些变化可能与后代从被动免疫到内源性IgG合成的转变有关，后者从25岁的第4周开始。在我们的研究中，在PN5和PN15处测得的IgG糖基化可能反映了从母乳中直接进行IgG转移，这种转移一直持续到大约PN16为止，并由鼠肠道26中新生Fc受体（FcRn）的表达介导。由于IgG具有21天的半衰期27，因此在我们的研究中，后面的时间点（PN30至PN60）代表了从内源性IgG产生与母体转移抗体残留减少的混合开始的过渡阶段。我们的数据强烈支持这一点，因为在5天和15天的纯母乳喂养期间，我们观察到IgG糖基化模式没有差异，但IgG2-FAG2S1除外。
在我们的研究中观察到的鼠类IgG亚类的糖基化动力学差异可能与母体转移的亚类特异性差异有关（即，胎盘转移与通过母乳喂养的肠道通过的差异率）。考虑到胎盘IgG的转移，尽管在人类中已显示IgG Fc唾液酸在怀孕期间增加28，但也已知IgG糖基化在抗体的优先胎盘转移中起作用29。在小鼠中，关于驱动被动免疫的机制的开创性研究表明，虽然鼠IgG1仅通过母乳转移30，但IgG3多数是在产前通过鼠卵黄囊获得的，而IgG2的转移涉及两种途径30，31岁。在就糖基化如何通过胎盘和母乳影响IgG抗体对母体的贡献做出进一步结论之前，需要进行更多的鼠类研究。最后，应考虑的另一个因素是糖基化本身会影响特定IgG亚类的清除率。例如，已经表明，小鼠IgG2a的agalactosylated表现出20-40％的较长的半衰期在循环中比其完全半乳糖基化对应物32。关于在我们的研究中观察到的IgG2糖基化动力学，从PN30开始向消炎模式的更明显转变可能反映了归因于每个IgG亚类的不同功能特性。
检查在IgG的糖基化亚类特异性差异其它鼠的研究已经均匀地报道说，是主要的亚类的IgG1和IgG2之间观察到的最对比变化，agalactosylated结构中的IgG1占优势和增加的末端半乳糖和唾液酸的含量为IgG2的糖型33，34。在小鼠中，在它们的效应子功能这两个亚类相反，用IgG1的是主要免疫调节，Th2细胞相关的免疫球蛋白和IgG2显示强效的促炎作用，由于其优先结合与激活Fc受体35，36。在这种情况下，在我们的研究中观察到，IgG2糖基化朝着末端半乳糖基化和唾液酸化的快速转变，与内在抗体产生的开始有关，可能构成一种保护机制，以减轻与IgG2效应子功能相关的潜在有害的免疫反应过度。
我们的数据提供了有关Balb / c小鼠从婴儿期到成年期IgG Fc糖基化变化的重要信息。但是，当将此数据外推到其他小鼠品系时，应谨慎行事，如de Haan等。发现BALB / c和C57BL / 6小鼠之间IgG糖基化有明显差异37。这提出了令人信服的想法，即IgG糖基化可能在这两种小鼠品系中常见的炎症差异中起作用。的确，众所周知，BALB / c小鼠的免疫反应主要受Th2细胞因子谱的控制，而C57BL / 6小鼠更倾向于促炎性Th1反应38。迄今为止，已经报道了关于鼠IgG糖基化中性别依赖性差异的对比结果。虽然我们的研究是在缺乏通过德哈恩在成年小鼠以前报道的不同协议37，其它报道证实二分法和唾液酸化水平较低，增加女性的半乳糖比男性39。人体研究还发现，在IgG Fc的糖基化的女性，主要变化特别是在青春期和更年期接近22，23。这突显了在IgG糖基化中可能的激素作用，应进行更详细的研究，尤其是根据先前的研究表明IgG半乳糖基化与唾液酸化和类固醇激素信号传导之间存在关联40，41。关于小鼠研究中IgG糖基化的性别差异的不同结果可能归因于研究之间的技术差异（即，使用不同的分析方法检测不同组糖型），或更重要的是，如本研究中那样，与年龄有关，因为可以预期，类固醇激素的调节不会对青春期之前的IgG糖基化产生重大影响（在大多数小鼠品系中，这是在6-8周龄时达到的）。
我们的研究观察到从出生到成年的鼠类抗体亚类之间Fc糖基化的年龄依赖性差异，这可能与表征从被动免疫到完全免疫能力过渡的出生后发育期相关。由于抗体功能不仅取决于其对特定Fc受体的亲和力，而且还取决于Fc糖基化作用，因此在稳态下分析不同抗体亚类中的糖基化作用是确定与疾病发病机制相关的变化的绝对前提。特别是，鉴于小鼠模型已越来越多地用于疾病进展研究和新治疗剂安全性评估中，因此，本文报道的数据对于与发育性免疫毒性相关的转化研究设计以及生命早期免疫干预和疫苗策略的设计至关重要。近年来，免疫功能障碍和慢性疾病之间的直接联系变得越来越明显。因此，对免疫系统发育过程中重要的干预窗口的更全面的了解可能有助于减少以后慢性疾病的发生。
Protein G sepharose快速流购自GE Lifesciences。Tris，甘氨酸，碳酸氢铵和三氟乙酸购自Sigma-Aldrich。LC-MS级乙腈来自JT Baker。测序级胰蛋白酶来自Promega Corporation，C 18珠用于Macherey-Nagel的糖肽纯化，超纯水由Direct-Q 3 UV净水系统（Merck Millipore）内部产生，其质量为18MΩ或更高。
从Janvier Labs（法国勒·圣·圣岛）获得12周龄雌性BALB / c小鼠，每个笼子以12/12 h光照/黑暗周期饲养四只动物。食物和水可随意获得。所有动物实验均由地方当局LandesamtfürGesundheit und Soziales（LAGeSo）的伦理委员会批准（已批准批准进行动物实验），并根据德国和国际准则进行。
使BALB / c雄性和雌性小鼠交配，并且将粘液栓的可视化视为妊娠日（G）0。从交配的笼子中取出雌性雌鼠，一起饲养直到G17，然后将它们单独饲养以生下孩子。在出生后第5天和第15天，分别从断头或颈椎脱臼安乐死的幼犬中收集血液。其余幼崽在PN21断奶，然后在30、45和60天龄时从安乐死的后代中收集血液用于抗体糖基化分析。
将血液在室温下保存1 h，离心，并将血清保存在-80°C。为了纯化，使用Protein G亲和珠从15 µl血清中捕获IgG。摇动1.5小时后，蛋白质与小珠相互作用，此后，小珠用1.5 ml PBS洗涤7次。IgG用100μl100 mM甲酸洗脱，洗脱液在60°C的真空浓缩器中干燥2小时13。
如先前所述进行亚类特异性小鼠IgG N-连锁糖基化分析33。简而言之，将干燥的IgG溶于40 µl 25 mM碳酸氢铵中，并加入0.2 µg测序级胰蛋白酶。在37°C下温育18小时后，将获得的糖肽在C 18珠上脱盐，在真空离心机中干燥，然后重新溶于40 µl超纯水中。通过注入5 µl样品，在紧凑型飞行时间质谱仪（美国，比勒里卡，布鲁克）上进行Nano-LC-ESI-Qq-TOF分析，并在HALO C 18上实现分离纳米液相色谱柱（150×0.1 mm，5 µm，90Å，先进材料技术，美国威尔明顿）。用于Fc特异性小鼠IgG糖基化分析的高通量LC-MS方法已在其他地方进行了描述33。光谱以2×0.5 Hz的速率在50/3500的m / z范围内采集。为了进行数据分析，首先使用ProteoWizard msConvert 42（v。3.0）将文件转换为.mzXML格式，然后使用LaCy Tools软件43处理文件。（第1.0.1版）。然后进行手动数据整理，以从进一步的定量分析中排除质量准确度，信噪比和同位素模式质量低的分析物。对于每个检测到的亚类，将作为质子加合物观察到的双电荷和三电荷离子的糖肽峰面积相加并归一化。补充表1中详细描述了用于数据提取的LaCy Tools参数以及检测到的糖形，理论m / z值和手动数据管理标准。
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