您好,请问有什么可以帮到您的。 点击这里给我发消息
武汉新启迪生物科技有限公司
新启迪-您的生物科研好伙伴!
本企业通过iso9001质量体系认证

肿瘤来源的HMGB1诱导CD62L 暗淡嗜中性粒细胞极化和促进肺转移在三阴性乳腺癌

 二维码
发表时间:2020-09-18 15:10作者:武汉新启迪Xinqidibio来源:www.qidibio.com

肿瘤来源的HMGB1诱导CD62L 暗淡嗜中性粒细胞极化和促进肺转移在三阴性乳腺癌

三阴性乳腺癌(TNBC)具有高度侵袭性,难以治疗,通常会发展为内脏转移,包括肺转移。我们观察到高迁移率族框1蛋白(HMGB1)在人类TNBC中高表达,并与癌症转移呈正相关。缺氧的肿瘤环境可调节HMGB1的分泌,但对肿瘤衍生的HMGB1调节间质成分并促进乳腺癌肺转移的潜在机制的了解仍不清楚。本研究结果表明,CD62L的数目暗淡在小鼠TNBC模型中,嗜中性粒细胞具有很强的产生嗜中性粒细胞胞外陷阱(NETs)的能力,在外周血和肺组织中均显着增加,并通过TLR2途径受到肿瘤来源的HMGB1的调控。此外,血清HMGB1水平与CD62L相关暗淡在86例乳腺癌患者的中性粒细胞。我们证明了CD62L 昏暗的嗜中性粒细胞加速肺转移和干预措施,瞄准“HMGB1-CD62L 昏暗的中性粒细胞网”轴能抑制肺转移。我们的研究结果表明,HMGB1和CD62L的结合暗淡嗜中性粒细胞是乳腺癌肺转移的电位标记,是为将来的预防和治疗的新靶标。

介绍

乳腺癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一。它的发病率在妇女中排名第一,其死亡率在妇女中排名第三1乳腺癌患者的主要死亡原因是远处器官转移。三阴性乳腺癌(TNBC)的乳腺癌预后最差,并且优先转移至肺2但是,目前尚无明确的标志物可预测肿瘤转移。

HMGB1是在小牛胸腺中发现的高度保守的核蛋白,由两个结合DNA的HMG框结构域(N末端A和中央B)和酸性C末端尾巴3组成尽管越来越多的证据表明HMGB1对肿瘤的进展和转移有影响,但已报道了许多矛盾的发现。HMGB1在细胞核中充当DNA伴侣,并在大多数细胞中执行DNA修复和端粒稳定。此外,HMGB1已被报道结合于肿瘤抑制基因(如RB)来调节肿瘤发生和通过增强自噬和维持端粒稳定性来促进基因组稳定性和抑制肿瘤456有趣的是,作为主要的损伤相关分子模式蛋白(DAMP),HMGB1积极刺激后释放或由损伤或死亡的细胞被动释放78先前的研究已经证实,HMGB1通过激活促炎信号通路9诱导促炎细胞因子的释放与此同时,HMGB1抑制树突细胞和肿瘤杀伤在CD8的抗原呈递功能+ T细胞,这也促进了M2招募噬101112大多数研究集中于肿瘤微环境中HMGB1水平的变化,但其离开原发部位后的作用仍然未知3

缺氧是实体瘤微环境的标志,因为肿瘤的快速生长会导致缺氧,并在肿瘤中心形成缺氧环境。尽管缺氧在肿瘤中的存在与肿瘤的大小,等级,分期或组织学类型无关,但缺氧调节许多病理过程以促进肿瘤恶性发展,并且与癌症患者不良的临床预后显着相关[ 13]研究表明,低氧诱导因子1(HIF-1α)促进HMGB1从细胞14的释放,然后与线粒体DNA(mtDNA)形成复合物以促进肿瘤细胞增殖15

中性粒细胞是人类免疫系统中的主要白细胞,由于它们的寿命短和明显的抗菌能力,它们在肿瘤中的作用被低估了。但是,近年来,研究已经证实嗜中性粒细胞在存在肿瘤的情况下可以延长寿命16中性粒细胞在功能重塑(分泌MMP,VEGF,IL-6和其他因子)中发挥许多作用,以促进肿瘤进展17此外,嗜中性粒细胞发挥预转移性利基形成中心作用,甚至可以重新激活休眠的肿瘤细胞,以促进肿瘤复发和转移1819嗜中性粒细胞的异质性得到了很好的示出,与所识别的细胞类型,如肿瘤杀伤N1嗜中性粒细胞,肿瘤促进嗜中性粒细胞N2,低密度中性粒细胞(的LDN)和高密度的中性粒细胞(HDNS)2021此外,一些研究表明,慢性淋巴细胞性白血病中的肿瘤细胞可促进中性粒细胞分化为CD62L 表型,从而发挥免疫抑制功能22然而,尚未报道这些过程对肿瘤转移的改变和影响的影响。

在本研究中,我们证实了低氧原发性肿瘤会导致肿瘤细胞分泌HMGB1,并通过TLR2信号通路进一步促进嗜中性粒细胞极化至CD62L 表型,从而促进肿瘤转移的形成。此外,抑制HMGB1或TLR2信号通路显示出可减缓肿瘤转移。

结果

HMBC1在TNBC中的高表达水平与肿瘤转移有关

HMGB1与不同肿瘤的预后之间的相关性被观察到是多种多样的(图S1A),HMGB1在乳腺癌中的作用仍存在争议3根据GEO数据库,在所有最初被诊断出患有乳腺癌的患者中,高HMGB1表达的患者更有可能发生乳腺癌转移,特别是在基底样乳腺癌中(图1aS1B))。HMGB1表达增加的基底样乳腺癌表现出较早的肺转移,平均发生23个月。TCGA和METABRIC数据库的进一步分析还显示,基底样乳腺癌患者比非基底样乳腺癌患者在原发性肿瘤中显示更高水平的HMGB1表达(图1bS1C)。此外,我们根据肿瘤细胞中HMGB1的表达强度(图1c)和建立的评分标准(图S1D,选择了80个原发性乳腺癌病理切片并将其分为5组与数据库结果一致,TNBC表达了较高水平的HMGB1(图1dS1E)),而HMGB1的表达水平与肿瘤分期或淋巴结转移无关(图S1F,G)。此外,我们比较了在10年的时间里接受了根治性乳房切除术的有肺转移但无肿瘤转移的乳腺癌患者。HMGB1在乳腺癌肺转移患者的原发肿瘤中的表达高于无肿瘤转移的患者(图1e)。此外,我们测试了86例患者的血清,并观察到TNBC患者的血清HMGB1水平显着升高(图1f)。这些结果表明HMGB1与乳腺癌,特别是TNBC中的肿瘤转移密切相关。

图1:三阴性乳腺癌患者中HMGB1的高表达水平与肿瘤转移有关。
图1

对基底样乳腺癌患者HMGB1表达与总生存期(OS),无复发生存期(RFS)和无远处转移生存期(DMFS) GEO数据库相关性分析。b TCGA数据库和METABRIC数据库分析HMGB1在基底样和非基底样乳腺癌中的表达。c HMGB1染色评分标准在乳腺癌中的代表性图像。d三阴性乳腺癌(TNBC)和非TNBC中的HMGB1染色评分。e HMGB1染色评分在原发性乳腺癌中有或没有肺转移已有10年。FElisa分析不同分子类型的乳腺癌患者的血清HMGB1浓度。数据是一个代表性实验的平均值±SEM。除非另有说明,否则在三个独立的实验中可以看到相似的结果。未配对学生的t检验,ns不显着。* p  <0.05,** p  <0.01,*** p  <0.001。也参见图S1

肿瘤细胞衍生的HMGB1导致乳腺癌的肺转移

为了阐明HMGB1在乳腺癌中的作用,我们使用了TNBC的4T1原位小鼠模型。作为保守的核蛋白,HMGB1通常在哺乳动物细胞中表达,并广泛分布在各个器官中(图2a)。越来越多的证据表明,HMGB1作为一种分泌蛋白,除了维持DNA稳定性之外,还具有其他功能23因此,评估了各个器官中HMGB1的分泌水平,并且原发性肿瘤表现出最高的HMGB1水平(图2b)。HMGB1在原发性肿瘤中的表达随肿瘤进展而增加(图S2A,B),血清中HMGB1的浓度也随时间而增加(图2c)。)。原发性肿瘤的组成很复杂,HMGB1 3的分泌涉及多种细胞原发性肿瘤中的免疫细胞和肿瘤细胞均表达高水平的HMGB1(图S2C)。但是,肿瘤组织培养上清液(TTCS)中HMGB1的主要来源是肿瘤细胞而不是免疫细胞(图S2D,E)。EMT6是一种具有低肺转移能力的肿瘤细胞系24与4T1细胞相比,EMT6细胞显示HMGB1表达降低(图2d,e)。因此,我们构建了分别沉默或过表达HMGB1的细胞系4T1-shHMGB1和EMT6-HMGB1。转染剂量在体外不影响这些细胞的增殖(图S2F)。用构建的肿瘤细胞原位接种小鼠。2周后,在肿瘤和脾脏大小之间没有观察到显着差异(图S2G,H)。然而,随着肿瘤的进展,在4T1和EMT6肿瘤中均观察到高HMGB1表达促进肿瘤生长(图2f),在4T1-Control和EMT6-HMGB1组中肺转移明显,而4T1-shHMGB1和EMT6-对照组在第4周(图2g)。4T1-shHMGB1组的生存时间明显长于4T1-对照组,而EMT6-HMGB1组的生存期缩短了(图2h)。)。为了排除肿瘤负荷对肿瘤转移的影响,我们在具有微小肿瘤差异的小鼠的荷瘤早期进行了一项研究。4T1-对照组和EMT6-HMGB1组的小鼠在原发肿瘤和血清中具有高HMGB1表达(图S2I,L)。在小鼠的肺组织中,转移前相关基因的表达在4T1-shHMGB1和EMT6-对照组中显着降低(图S2M),表明HMGB1有助于转移前小生境的形成。为了进一步了解转移前小生境的形成与肿瘤转移之间的相关性,我们建立了不同的短期观察小鼠肿瘤模型(图2i)。)。在接受非转移性乳腺癌EMT6-Control-EMT6组的小鼠中,影像学结果显示EMT6-荧光素酶肿瘤细胞(iv)返回了原发性肿瘤部位,但未返回肺。此外,EMGB6细胞(原位)中的HMGB1过表达会导致更多的EMT6-荧光素酶肿瘤细胞(iv)保留在肺组织中。与4T1-Control-EMT6组相比,肺中积累的EMT6-荧光素酶细胞(iv)比4T1-shHMGB1-EMT6组更多。综上所述,这些数据表明原发性肿瘤分泌的HMGB1在肺转移前的生态位形成中起着重要作用。

图2:源自肿瘤细胞的HMGB1导致乳腺癌的肺转移。
图2

HMGB1在幼稚小鼠和荷瘤2周小鼠的各种器官中 mRNA表达。b Elisa分析幼稚小鼠和荷瘤小鼠两周后各器官细胞质中HMGB1的浓度。c Elisa分析血清HMGB1浓度与肿瘤进展的关系。de不同肿瘤细胞系中HMGB1 的蛋白水平(d)和mRNA水平(e)。4T1-shHMGB1,HMGB1基因敲除的4T1细胞系; EMT6-HMGB1,HMGB1过表达EMT6细胞系。f由不同肿瘤细胞系接种形成的4周荷瘤小鼠的原发性肿瘤和脾脏的代表性图像。g H&E染色的4周荷瘤小鼠肺部转移(左)和肺转移的定量(右)。h  接种不同肿瘤细胞系(Kaplan–Meier试验)后小鼠的存活(每只n = 10)。i在2小时内观察到注射有荧光素酶表达的EMT6细胞的Balb / c小鼠的示意图(左)和代表性生物发光成像(中)和肺生物发光定量(右)。数据是一个代表性实验的平均值±SEM。在三个独立的实验中看到了相似的结果。未配对学生的t检验,ns不显着。* p  <0.05,** p  <0.01,*** p  <0.001。另请参见图S2

低氧调节HMGB1从细胞核到细胞质的释放

作为重要的DAMP,当细胞受到异常刺激时,HMGB1从细胞核进入细胞质25氧气是HMGB1定位变化的主要原因之一,肿瘤的局部特征包括低氧和低pH条件15在缺氧肿瘤中心,HMGB1位于肿瘤细胞的细胞质中,而在常氧肿瘤边缘,HMGB1存在于肿瘤细胞的核中(图S3A3a)。HMGB1在缺氧条件下从细胞核进入4T1细胞的细胞质中72 h(图3b)。缺氧对HMGB1的影响未反映在转录或蛋白质水平的变化中(图S3B,C),而是从细胞核到细胞质的移位(图3c)。随着缺氧时间的延长,肿瘤细胞培养上清液(TCCS)中HMGB1的浓度逐渐增加(图3d)。此外,低氧不会导致4T1或EMT6肿瘤细胞死亡,这表明HMGB1是细胞分泌而不是细胞裂解的产物(图S3D)。与4T1-shHMGB1组相比,4T1-对照组在缺氧条件下显示HMGB1表达增加,这可以通过使用抗氧化剂如α-硫辛酸和N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)来逆转(图3e))。另外,在缺氧条件下,HMGB1的过表达也可能增加EMT6的分泌。在这里,我们显示HMGB1的释放受缺氧控制。

图3:低氧调节HMGB1从细胞核释放到细胞质中。
图3

a在2周荷瘤小鼠的HMGB1染色的原发性肿瘤切片上代表性图像。b分别在常氧或低氧条件下分别培养24、48和72 h的4T1肿瘤细胞中HMGB1定位的细胞免疫荧光分析。细胞用HMGB1(红色),α-微管蛋白(绿色)和DAPI(蓝色)染色。c在常氧和低氧条件下,肿瘤细胞系细胞质和核成分中HMGB1的蛋白质印迹分析。d Elisa分析常氧和不同程度低氧条件下培养的上清液(TCCS)中4T1肿瘤细胞的HMGB1浓度。Ë在常氧和低氧(72小时)条件下,使用或不使用α-硫辛酸和N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)处理的不同TCCS的HMGB1浓度的Elisa分析。数据是一个代表性实验的平均值±SEM。在三个独立的实验中看到了相似的结果。未配对学生的t检验,ns不显着。* p  <0.05,** p  <0.01,*** p  <0.001。还参见图S3

缺氧诱导的HMGB1从原发肿瘤的释放将中性粒细胞极化为CD62L 昏暗中性粒细胞

检查具有不同肿瘤细胞的荷瘤小鼠的嗜中性粒细胞。4T1-shHMGB1组中的中性粒细胞比4T1-对照组中的中性粒细胞显着降低了骨髓动员,外周血分布和肺组织浸润,而HMGB1的过表达促进了EMT6组中的这些状况(图4aS4A,B)。 。这些结果与先前观察到的HMGB1动员中性粒细胞的能力26一致重要的是,CD62L的数量暗淡中性粒细胞显著在与在4T1-shHMGB1和EMT6 -对照组相比,4T1-控领域和EMT6-HMGB1组(增加的图4BS4C)。该结果表明,CD62L 昏暗的中性粒细胞在转移前的利基形成中具有重要的功能,而HMGB1对于中性粒细胞的活化至关重要。此外,我们观察到重组HMGB1(rHMGB1)可以直接诱导嗜中性粒细胞向CD62L 表型极化(图4c)。从4T1-Control和EMT6-HMGB1组肿瘤组织培养的上清液(TTCS)具有诱导CD62L能力最强暗淡嗜中性粒细胞,而TTCS从4T1-shHMGB1和EMT6 -控制组具有相对较弱的影响(图4D)。体外培养肿瘤组织24 h不会导致肿瘤细胞死亡(图S4D)。此外,只有4T1-对照组和EMT6-HMGB1组的低氧TCCS有效诱导了CD62L 暗中性粒细胞(图4e)。通过中和HMGB1(用甘草酸)或抑制HMGB1从细胞质中释放(用丙酮酸乙酯)可抑制这种作用(图4f)。这些结果表明肿瘤细胞HMGB1对CD62L重要的影响昏暗的中性粒细胞。

图4:从原发肿瘤中低氧释放的HMGB1诱导嗜中性粒细胞至CD62L dim
图4

a量化由不同肿瘤细胞系接种形成的2周荷瘤小鼠的BM,PB和肺中的中性粒细胞。b CD62L的定量暗淡在PB中性粒细胞和通过不同的肿瘤细胞系接种形成2周荷瘤小鼠的肺嗜中性粒细胞浸润。c定量在体外用rHMGB1处理4 h的幼稚小鼠的BM中性粒细胞中性粒细胞上CD62L表达。d用不同浓度的荷瘤小鼠肿瘤组织培养上清液(TTCS)刺激的幼稚小鼠BM中性粒细胞CD62L 暗中性粒细胞的流量分析e CD62L 暗淡的流量分析比例在常氧和低氧(72 h)条件下,用不同浓度的TCCS刺激的天真小鼠BM中性粒细胞中的中性粒细胞。f从高氧或低氧(72 h)肿瘤细胞(含或不含甘草酸和丙酮酸乙酯)的浓缩TCCS诱导的幼稚小鼠BM 的CD62L 暗中性粒细胞的流量分析比例数据是一个代表性实验的平均值±SEM。在三个独立的实验中看到了相似的结果。未配对学生的t检验,ns,不显着。* p  <0.05,** p  <0.01,*** p  <0.001。还参见图S4

HMGB1极化中性粒细胞CD62L 昏暗的嗜中性粒细胞在乳腺癌患者

在TNBC患者的肿瘤切片中,在肿瘤中心,HMGB1位于细胞质中,而在肿瘤边缘,HMGB1位于细胞核中。然而,在肿瘤周围腺导管细胞中未检测到HMGB1(图5a)。我们评估了新诊断的乳腺癌患者的外周血(PB)中性粒细胞比例和配对的血清HMGB1水平,并观察到TNBC患者PB中CD62L 昏暗中性粒细胞的比例高于非TNBC患者(图5bS4E) 。另外,血清HMGB1表达水平与PB CD62L 暗中性粒细胞的比例正相关(图5c)。此外,rHMGB1诱导人CD62L 暗淡中性粒细胞呈剂量依赖性(图5d)。我们用不同的患者血清处理了来自健康供体的嗜中性粒细胞,并观察到患者的TNBC血清具有更强的诱导CD62L 暗中性粒细胞极化的能力(图5e)。这些结果进一步支持了“肿瘤分泌HMGB1-CD62L的假说暗淡嗜中性粒细胞”在人类乳腺癌患者轴线。

图5:HMGB1 在乳腺癌患者中诱导中性粒细胞生成CD62L 暗中性粒细胞。
图5

TNBC中HMGB1染色代表图像。b流式细胞术栅极策略(左)和人CD62L PB的分析的比例(右)暗淡嗜中性粒细胞的检测。Ç和配对PB CD62L血清HMGB1表达之间的Pearson相关性(通过ELISA)暗淡嗜中性粒细胞的乳腺癌患者的比例(流量)。d体外用rHMGB1处理4 h的人PB中性粒细胞CD62L表达的变化。e用不同患者血清治疗的健康供体PB中性粒细胞CD62L表达的变化。数据是一个代表性实验的平均值±SEM。在三个独立的实验中看到了相似的结果。非配对ŧ测试,ns,不重要。* p  <0.05,** p  <0.01,*** p  <0.001。还参见图S4

CD62L 昏暗嗜中性粒细胞通过HMGB1经由TLR2诱导形成母语

中性粒细胞的形态和发育受Toll样受体(TLRs)27的活性影响很大HMGB1受体主要包括TLR2,TLR4,以及用于高级糖化终产物(RAGE)受体252829在来自荷瘤小鼠的肺中性粒细胞中观察到TLR2和TLR4水平升高(图6aS5A)。此外,CD62L 暗淡嗜中性粒细胞表达更高水平的TLR2和MyD88的比CD62L的嗜中性粒细胞(图6BS5B),但有在TLR4水平没有差异显著(图S5C)。然而,FLA-ST(TLR5激动剂)和FSL-1(TLR2 / 6激动剂)诱导CD62L 暗淡嗜中性粒细胞(图6C),而d核糖(RAGE激动剂)不影响CD62L的中性粒细胞上的表达(图S5D)。细菌鞭毛蛋白是TLR5 30识别的唯一配体TLR2作为TLR1 / 2和TLR2 / 6复合物31的一部分,而CD62L 暗中性粒细胞通过TLR2 / 6复合物的活化诱导。尽管TLR2和TLR4的下游靶标是MyD88,但它们的作用并不完全一致。仅邻香草醛(TLR2抑制剂)有效地抑制CD62L诱导昏暗通过rHMGB1(图嗜中性粒细胞。6D)。为了进一步评估TLR2和TLR4在CD62L的作用暗淡中性粒细胞,TLR2 - / -TLR4 - / -转基因小鼠中使用(图6E),结果表明,rHMGB1不诱导TLR2 - / -嗜中性粒细胞进入CD62L 暗淡中性粒细胞(图6f)。NETs的形成是嗜中性粒细胞的重要特性,越来越多的证据表明NETs不仅在感染中而且在包括癌症在内的非传染性炎性疾病中的作用32CD62L 暗淡嗜中性粒细胞显示出更强的能力,形式母语比CD62L 中性粒细胞(图6g)。此外,FSL-1和rHMGB1还在中性粒细胞中诱导NETs形成(图S5E),而TLR2 -/-中性粒细胞在被rHMGB1诱导时不能形成有效的NETs(图S5F)。结果表明,HMGB1对CD62L的影响昏暗的中性粒细胞可以通过TLR2介导的。

图6:HMGB1通过TLR2诱导CD62L 昏暗的中性粒细胞形成NET。
图6

通过流动,对幼稚小鼠和荷瘤小鼠的肺浸润中性粒细胞中TLR2表达 MFI。b通过流向肺部浸润荷瘤小鼠的CD62L dim和CD62L hi中性粒细胞中TLR2表达的MFI c流量分析(左)和CD62L在中性粒细胞上的CD62L表达的定量(右),这些中性白细胞来自用各种TLR激动剂处理过的BM,其中包括Pam3CSK4,FSL-1,Poly(I:C),MPLA-SM,FLA-ST, R848和TLR9激动剂套件。d用O-Vanillin(TLR2抑制剂)和TAK242(TLR4抑制剂),TTP488(RAGE抑制剂)预处理纯真幼稚小鼠的BM中性粒细胞,然后用rHMGB1刺激。CD62L 暗淡的比例通过流量分析中性粒细胞。e TLR2- /和TLR4 -/-小鼠的凝胶电泳图谱f定量在体外用rHMGB1处理4 h的不同天真小鼠的BM中性粒细胞中性粒细胞CD62L表达。肺嗜中性粒细胞的胞外陷阱(母语)浸润CD62L的细胞的免疫荧光分析暗淡嗜中性粒细胞和CD62L 2周肿瘤的小鼠的嗜中性粒细胞。NETs根据NE(绿色),Cytox橙色(红色)和DAPI(蓝色)染色。数据是一个代表性实验的平均值±SEM。在三个独立的实验中看到了相似的结果。非配对ŧ测试,ns不重要。* p  <0.05,** p  <0.01,*** p  <0.001。还参见图S5

在乳腺癌肺转移由“HMGB1-TLR2-CD62L介导的昏暗嗜中性粒细胞网”轴

为了评估CD62L的能力暗淡嗜中性粒细胞,以促进肿瘤转移,我们还建立不同长期观察组(图S6A)。4T1细胞的原位注射显着增加了肺中EMT6-荧光素酶细胞(iv)的生长(图7a)。连续注射rHMGB1或CD62L 昏暗的中性粒细胞也增加了肺中EMT6- 荧光素酶(iv)转移的形成。另外,我们还用rHMGB1预处理了小鼠,然后在原位接种了4T1细胞,观察到rHMGB1也提前促进了肿瘤细胞的肺转移(图S6B)。此外,对肿瘤转移模型进行了不同的干预(图7b)。),包括抑制HMGB1从细胞质中分泌,抑制HMGB1的HMG盒功能,抑制TLR2的激活或形成的NET的清除。治疗2周后,肿瘤的肺转移有不同程度的减少(图7c,d)。此外,我们测试了PB和肺CD62L 暗淡从小鼠的不同组中性粒细胞和观察到,通过甘草酸抑制HMGB1或丙酮酸乙酯和阻断TLR2的活化由邻香草醛减少CD62L的比例暗淡嗜中性粒细胞,而DNA酶I是没有效果关于CD62L的频率暗淡嗜中性粒细胞(图7E)。体外免疫荧光结果证实,DNase I有效减少了NET的形成(图S6C)。此外,我们对4T1-shHMGB1组进行了抢救实验(图S6D,E)。在第4周观察到转移(图7f,g),并且在不同干预下检测到CD62L 暗中性粒细胞(图7h)。这些结果再次表明HMGB1可能通过TLR2-CD62L 暗中性粒细胞促进乳腺癌的肺转移

图7:“HMGB1-TLR2-CD62L 暗淡嗜中性粒细胞,网”轴负责乳腺癌的肺转移。
图7

CD62L 嗜中性粒细胞或rHMGB1再注射2周后,注射表达荧光素酶的EMT6细胞的Balb / c小鼠代表性生物发光成像(左)和肺生物发光定量(右)bd示意图:(b),具有代表性的生物发光成像(c)和肺生物发光定量(d),是在多个干预者治疗2周后注射表达荧光素酶的4T1细胞对Balb / c小鼠的作用。È PB的流量分析和肺浸润CD62L 暗淡在荷瘤小鼠中中性粒细胞的多个干预后2周。˚F在抢救实验中,4T1-shHMGB1荷瘤小鼠的代表性生物发光成像(f)和肺部生物发光定量(g)。4T1-shH,4T1-shHMGB1; 4T1-shH-H,HMGB1过表达4T1-shHMGB1。ħ PB的流量分析和肺浸润CD62L 暗淡嗜中性粒细胞在用于拯救实验4T1-shHMGB1荷瘤小鼠。EP,丙酮酸乙酯。数据是一个代表性实验的平均值±SEM。在三个独立的实验中看到了相似的结果。未配对学生的t检验,ns不显着。* p  <0.05,** p  <0.01,*** p  <0.001。也参见图S6

讨论区

L-选择素(CD62L)是在大多数白细胞中表达的I型跨膜细胞粘附分子,以及众多的研究表明,L-选择下游信号可影响嗜中性粒细胞,如轧制,粘附和迁移的运动3334随后,证明CD62L不仅影响嗜中性粒细胞的行为,而且还调节其活化35CD62L 昏暗的中性粒细胞被认为是一个独立的亚群,因为它们对急性炎症有独特的转录特性36,而另一项研究表明它们的抗菌活性很差37然而,学者在不同的领域都报告说,CD62L 暗淡嗜中性粒细胞表现为促进疾病进展,尤其是在慢性淋巴细胞性白血病免疫子集223839与此相反,文献表明CD62L 昏暗嗜中性粒细胞与患者的头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)改善生存相关联40这些结果表明,该子集的作用在不同背景下并不统一。CD62L的作用黯淡,尚未见报道在乳腺癌,尤其是转移性乳腺癌中性粒细胞。我们第一次建议CD62L 变暗中性粒细胞在肿瘤进展的早期阶段显着增加,并受原发肿瘤分泌的HMGB1调节。CD62L的持久性输血暗淡嗜中性粒细胞促进转移和低转移性电位EMT6肿瘤细胞甚至肺转移。

先前的研究报道,HMGB1募集嗜中性粒细胞以促进黑色素瘤进展28我们观察到缺氧肿瘤产生的HMGB1诱导中性粒细胞丧失CD62L。通过HMGB1击倒的肿瘤细胞形成肿瘤组织表现出CD62L的缩小比例暗淡嗜中性粒细胞和减少的肺转移瘤,有效地延长了小鼠的存活期。我们进一步证明,HMGB1过表达部分增加了EMT6的转移能力,更重要的是,显着增加了CD62L dim的数量。EMT6-HMGB1组中的中性粒细胞。为了进一步支持我们的发现,数据库和我们的原发性人类肿瘤样本的数据表明,TNBC患者比非TNBC患者表达更高水平的HMGB1。此外,与无转移10年的患者相比,具有肺转移的乳腺癌患者的HMGB1水平更高。此外,患者血清HMGB1曾与PB CD62L的比例显著正相关暗淡中性粒细胞。因此,CD62L诱导昏暗嗜中性粒细胞的生产高水平的HMGB1可加速TNBC的肺转移。

HMGB1促进CD62L 昏暗的中性粒细胞通过TLR2信号通路释放NETs。先前的研究表明,NETs具有抗肿瘤作用41然而,最近的研究表明,母语促进癌转移4243我们证明CD62L 昏暗的中性粒细胞具有强大的NETs形成能力,并且通过DNase I清除NETs减少了肿瘤的肺转移。综上,这些发现表明CD62L 昏暗的中性粒细胞通过增强NET的形成来加速肺转移。

预防和治疗癌症转移是癌症研究的最终目标。由于免疫系统的重要免疫监视作用和嗜中性白血球减少症的严重后果,在体内去除所有中性粒细胞是不明智的。体内干预靶向CD62L 暗淡中性粒细胞和它们的相关的途径减少肿瘤的肺转移。在这项研究中,我们表明CD62L 昏暗中性粒细胞是具有明确标记的中性粒细胞亚群,是有希望的干预目标。

总而言之,在本研究中,我们证明了低氧肿瘤细胞分泌的HMGB1诱导CD62L 暗中性粒细胞,从而通过增强的NETs促进肺转移。这些结果表明,CD62L 昏暗的中性粒细胞和HMGB1是预防乳腺癌肺转移的潜在目标。我们相信,与PB CD62L结合的肿瘤组织或血清HMGB1的表达水平暗淡嗜中性粒细胞百分比可以预测肿瘤转移的乳腺癌患者的可能性的前瞻性策略。

材料和方法

人体样本

外周血(PB)和组织石蜡切片取自浙江大学医学院附属第二医院。的包括在本研究患者临床病理学特征示于补充表格1 - 3在进行任何干预之前,应由有执业执业护士在早上6:00采集血样。将来自肝素钠血液收集管(BD vacuum™)的血细胞裂解15分钟(BD Biosciences,#349202),并洗涤以用于随后的流式细胞术分析。在3000 rpm,5 min离心后,从Rapid Serum Tube(BDVacutainer®)获得血清,并保存用于ELISA测试。所有患者均签署了知情同意书,该知情同意书经浙江大学医学院附属第二医院伦理审查委员会批准。

从数据库获取和分析数据

乳腺癌和全肿瘤的生存数据来自Kaplan–Meier绘图仪(http://kmplot.com/analysis/)。癌症基因组图谱(TCGA)乳腺癌患者队列数据可从TCGA网站(https://cancergenome.nih.gov)下载,而METABRIC队列数据可从cBioPortal网站(https://www.cbioportal)下载。 org)。入选了TCGA的714例和METABRIC的1903例。数据分类和分析通过R软件(V4.0.1)进行。

细胞系

4T1细胞系购自中国科学院上海细胞生物学研究所(SIBS,中国上海)。EMT6细胞系购自复旦IBS细胞中心(FDCC,中国上海)。两种细胞系均通过STR分析进行鉴定。在含有10%FBS(Gibco),2 mmol / L谷氨酰胺(Sigma-Aldrich)和1:100青霉素-链霉素(Gibco)的RPMI-1640培养基中培养细胞。将它们全部在提供有5%CO 2的加湿培养箱中于37°C孵育

为了在低氧条件下培养,将肿瘤细胞铺板并在细胞附着后置于低氧培养箱(1%氧气)中。加入了两种抗氧化剂,包括α-硫辛酸(1 mM,Solarbio,#IL0180)和N-乙酰基-L-半胱氨酸(1 mM,Solarbio,#C8460)(图3e)。

HMGB1短发夹RNA(shRNA)和过表达稳定细胞系

用shHMGB1慢病毒或非沉默对照感染4T1细胞48小时。使用嘌呤霉素(5μg/ mL)选择稳定的克隆。HMGB1 shRNA寡核苷酸序列如下:HMGB1 shRNA1:5'-CCGGGAAGATGATGATGATGAATAATCTCGAGATTATTCATCATCATCATCTTCTTTTTG-3'。HMGB1 shRNA2:5'-CCGGTTGGTGCACAGCACAAATTAGCTCGAGCTAATTTGTGCTGTGCACCAATTTTTG-3'。HMGB1 shRNA3:5'-CCGGATGCAGCTTATAGAAGATAACTCGAGTTATCTTCGTATAAGCTGCATTTTTTG-3'。非沉默shRNA(对照shRNA)用作模拟转染的对照。然后通过实时PCR和western blot验证HMGB1的表达。

用过表达HMGB1(NCBI参考序列ID,NM_001313894.1)或其对照的慢病毒感染4T1-shHMGB1和EMT6细胞48小时。使用Blasticidin S(5μg/ mL)选择稳定的克隆。

老鼠

野生型BALB / c雌性小鼠购自Slaccas(中国上海)。TLR2 -/- C57BL / 10雌性小鼠是由Deborah A. Quinn博士(哈佛医学院马萨诸塞州总医院)送给的。TLR4 -/- C57BL / 6,野生型C57BL / 6和C57BL / 10雌性小鼠购自Gempharmatech(中国,南京)。

按照Deborah A. Quinn博士和Gempharmatech提供的方案对敲除小鼠进行基因分型。简而言之,将小鼠脚趾用液氮研磨,并使用动物基因组DNA分离试剂盒(Sangon Biotech,#B518221)获得DNA,并通过PrimerSTAR Max DNA聚合酶(TaKaRa,#R045A)进一步扩增。然后通过在1.5%琼脂糖凝胶(Sigma-Aldrich,#A9539)上的琼脂糖凝胶电泳检测扩增的DNA。对于TLR2 -/-小鼠基因分型,使用引物如下:(共同)5'-CTTCCTGAATTTGTCCAGTACA-3';(突变,334 bp)5'-GGGCCAGCTCATTCCTCCCAC-3'; (野生型,499 bp)5'-ACGAGCAAGATCAACAGGAGA-3'。对于TLR4 -/-小鼠基因分型,使用引物如下:TLR4突变体(140bp):(正向)5'-GCAAGTTTCTATATGCATTCTC-3',(反向)5'-CCTCCATTTCCAATAGGTAG-3';TLR4野生型(390 bp):(正向)5'-ATATGCATGATCAACACCACAG-3',(反向)5'-TTTCCATTGCTGCCCTATAG-3'。将六至八周龄的年龄匹配的小鼠随机分为不同的组。用0.8%戊巴比妥腹膜内(ip)注射麻醉BALB / c小鼠,并将100μl细胞悬液(4T1或EMT6,1×10 6细胞/ mL)植入右第四乳腺脂肪垫中。所有动物程序均经浙江大学医学院附属第二医院伦理审查委员会批准。

标本采集与处理

所有小鼠标本都在上午9:00进行处理,以防止昼夜节律的影响。提取并过滤小鼠后肢的骨髓(BM)细胞。将PB从眼球中取出并置于肝素管中,然后裂解15分钟。将原发肿瘤和肺组织切成小块,并在37°C振荡培养箱中的含有1 mg / mL胶原酶IV(Sigma-Aldrich,#V900893)的培养基中消化2小时。然后将细胞悬液通过40μm尼龙网(BD FALCON,#352340)过滤,用于随后的测试或体外培养。

中性粒细胞磁隔离

小鼠嗜中性粒细胞的分离是根据所提供的磁性激活细胞分选(MACS)协议(Mouse Neutrophil Isolation Kit,Miltenyi,#130-097-658)进行的。简而言之,从PB,BM或肺组织获得单细胞。每200μl细胞悬液添加50μl中性粒细胞生物素-抗体混合物作为一抗(MACS缓冲液中5×10 7个总细胞),并在4°C下孵育15分钟。洗涤两次后,每400μl细胞悬液添加100μl抗生物素微珠。LS柱和MidiMACS分离器(Miltenyi)用于随后的磁选。

根据提供的程序(EasySep™直接人类嗜中性粒细胞分离试剂盒,STEMCELL,#19666)进行人类嗜中性粒细胞的分离。简而言之,将分离混合物(50μl/ mL)和RapidSpheres™珠(50μl/ mL)添加到全血中,并在室温下孵育5分钟。然后添加高达10 mL的隔离缓冲液,并将试管放入EasySep™磁铁中5分钟。将富集的细胞悬浮液收集在新试管中,并与RapidSpheres™磁珠孵育5分钟。使用EASYSEP™磁铁进行5分钟的第二次分离,并收集富集的细胞悬液,用于随后的体外诱导。

原代组织培养和上清液收集

用无菌眼科剪刀将原发肿瘤组织切成小块。然后将样品放入无FBS RPMI-1640培养基的6孔板中。24小时后收集培养上清液,并以300× g离心  5分钟。肿瘤组织培养上清液用于体外中性粒细胞诱导。在含有1 mg / mL胶原酶IV的培养基中进一步消化肿瘤样品,并获得单细胞悬液用于凋亡检测(AnnexinV-FITC / PI凋亡检测试剂盒,BD Biosciences,#556547)。

原发性肿瘤和转移性肿瘤负荷计算

对于单个肿瘤,将肿瘤负荷计算为长径乘以短径,并将多个肺转移瘤的负荷加在一起。

组织缺氧检测

为了检测原发性肿瘤缺氧,应用了Hypoxyprobe™试剂盒(Hypoxyprobe Inc,#HP1)。将Hypoxyprobe™-1(盐酸吡莫尼唑)溶液(60 mg / kg)注射(ip)到2周的4T1荷瘤小鼠中,并于1小时后切除原发肿瘤。然后将肿瘤组织固定并包埋。获得组织切片,先用mAb1染色,再用缀有Alexa 594的第二试剂染色。

细胞表面标志物染色和流式细胞仪

从原发肿瘤,肺,PB或BM中分离出的单细胞用细胞染色缓冲液洗涤两次,然后用100μl细胞染色缓冲液(Biolegend,#420201)重悬。然后特异性针对CD45(克隆30-F11),CD11b(克隆M1 / 70),Ly-6G(克隆1A8),CD62L(克隆MEL-14),TLR2(克隆T2)的荧光染料偶联的抗小鼠单克隆抗体(mAb) .5),TLR4(克隆SA15-21),EpCAM(克隆G8.8)和CD45(克隆HI30),CD11b(克隆ICRF44),CD66b(克隆G10F5),CD62L(克隆DREG- 56)根据不同的实验要求添加。将样品在黑暗中于4°C孵育20分钟,并用细胞染色缓冲液洗涤两次。上述单克隆抗体购自Biolegend。对于流式细胞仪分析,将样品重悬于300μl细胞染色缓冲液中。使用FACSCanto II流式细胞仪(BD Biosciences)获取数据,并使用FlowJo软件(适用于Windows的V10.0)进行分析。对于荧光激活细胞分选(FACS),单细胞悬液用FACSAria III细胞分选仪(BD Biosciences)进行分选。细胞分选策略如下:1.CD45-APC / Cy7,CD11b-PE / Cy7,Ly6G-APC,CD62L-PE。2. EpCAM-PE,CD45-APC / Cy7。

RNA分离和实时定量PCR

将小鼠组织在含有液氮的陶瓷研钵中研磨,并用TRIzol试剂(Invitrogen,#15596-018)提取组织样品的总RNA。根据制造商的说明将细胞样品直接加入TRlzol。通过NanoDrop(Thermo Fisher)测试纯化RNA的浓度。使用PrimeScript™RT Master Mix(TaKaRa,#RR036A)将1μg总RNA反转录为cDNA,通过TB Green Premix Ex Taq(TaKaRa,#RR420A)扩增,并由7500 Fast Real-Time系统(Applied Biosystems)检测。使用7500(V2.3)软件(Applied Biosystems)处理数据。根据管家基因β-肌动蛋白对结果进行归一化,然后表示为与对照相比的倍数上调。

核和细胞质蛋白提取

使用核和细胞质蛋白提取试剂盒(Beyotime,#P0027)按照制造商的说明分离核蛋白和血浆蛋白。简而言之,对于培养的细胞,用胰蛋白酶消化细胞并用PBS洗涤,然后加入200μl具有1mM PMSF的试剂A。需要高速涡旋5秒钟和冰浴15分钟。然后加入10μl试剂B,并在1分钟冰浴中将液体高速涡旋5 s。涡旋振荡5 s,以16,000× g离心  5分钟后,收集上清液作为细胞质蛋白。用PMSF核蛋白提取试剂进一步处理沉淀。涡旋并依次冰浴30分钟后,将液体以16,000× g离心 在4°C下放置5分钟。收集上清液作为核蛋白。

为了提取组织,获得了新鲜的组织并立即置于冰上。然后将组织称重并切成薄片。将具有200μl试剂A,10μl试剂B和1 mM PMSF的60 mg组织混合,并将玻璃组织匀浆器用于进一步研磨。将匀浆在冰上放置15分钟,并在4°C下以1500× g离心5分钟。收集上清液作为组织胞质蛋白,用于进一步的浓度检测和HMGB1含量检测。

免疫印迹

从分选的嗜中性粒细胞或培养的肿瘤细胞或新鲜的冷冻组织中收集总蛋白,并通过预冷的裂解缓冲液与蛋白酶和磷酸酶抑制剂的混合物进行裂解(Thermo Fisher,#78445)。蛋白浓度通过双辛可宁酸(BCA)分析试剂盒(Thermo Fisher,#23227)测定。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质,然后将其转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad)上。在室温下用5%(w / v)的无脂牛奶(BD Biosciences,#232100)封闭1小时后,我们将膜与相应的一抗在4°C下孵育过夜,然后加入适当的辣根过氧化物酶( HRP)偶联的二抗。使用增强的化学发光鉴定了免疫反应带(Thermo Fisher Pierce,#32109)。一抗,包括抗HMGB1(1:250,Abcam,#ab79823),抗β-肌动蛋白(1:2000,HuaBio,#EM21002),抗GAPDH(1:2000,HuaBio,#ET1601-4),抗-β-微管蛋白(1:2000,HuaBio,#EM1602-4),抗TLR2(1:1000,Abcam,#ab209217),抗MyD88(1:1000,Proteintech,#23230-1-AP),抗-组蛋白H 3(1:2000,HuaBio,#ET1701-64)被应用。应用了二抗,包括抗小鼠(1:5000,HuaBio,#G1006-1)和抗兔(1:5000,HuaBio,#HA1001)。应用抗组蛋白H3(1:2000,HuaBio,#ET1701-64)。应用了二抗,包括抗小鼠(1:5000,HuaBio,#G1006-1)和抗兔(1:5000,HuaBio,#HA1001)。应用抗组蛋白H3(1:2000,HuaBio,#ET1701-64)。应用了二抗,包括抗小鼠(1:5000,HuaBio,#G1006-1)和抗兔(1:5000,HuaBio,#HA1001)。

免疫细胞荧光(ICF)

将肿瘤细胞接种在12孔的无菌圆形玻璃上,并在常氧或低氧培养箱中培养指定的时间(24、48和72小时)。另外,将分选的嗜中性粒细胞亚群在完全RPMI-1640培养基中的12个孔中接种于Poly-D-赖氨酸(0.1 mg / mL,Beyotime,#C0312)包被的无菌圆形玻璃上1-3小时(取决于通过光学显微镜)。对于破坏性NET,添加了DNAseI(Roche,#11284932001,1000单位/ mL)(图S6C))。然后在室温下用4%多聚甲醛(PFA)将玻璃固定10分钟。与含0.2%TritonX-100的PBS(Sigma-Aldrich,#X100)孵育20分钟并被3%BSA(MP Biomedicals,#0218054990)封闭60分钟后,细胞通透性得到提高。将细胞与一抗在4°C下孵育过夜,然后添加荧光二抗,然后在4°C在细胞上添加2 h。洗涤后,加入DAPI(Invitrogen,#D1306)并用玻璃覆盖。用LSM 710共聚焦显微镜(卡尔·蔡司,德国)分析样品。一抗包括HMGB1(1:250,Abcam,#ab79823),嗜中性粒细胞酯酶(1:200,Abcam,#ab68672),Alpha Tubulin- AlexaFluor®488(1:1000,Abcam,#ab7291)和Sytox橙色核酸应用污渍(Thermo Fisher,#S11368)。

免疫组织化学(IHC)和免疫组织荧光(IHF)

获得用于H&E染色或免疫组织化学的小鼠组织,并用4%PFA覆盖至少24 h,然后用石蜡包埋。免疫组织化学使用标准方案(Absin,#abs9211)进行。简而言之,通过酒精梯度将4–5μm石蜡切片去石蜡,然后再水化为水。使用Tris-EDTA(pH = 9)缓冲液在98°恒温浴中进行抗原提取30分钟。HMGB1(1:350,Abcam,#ab79823)特异的抗体被用于这项研究。

人类和小鼠的肿瘤组织切片由个别研究人员(Z. Wang和CH CH Yang)进行审查和评分。使用Pannoramic MIDI(3DHISTECH Ltd)扫描幻灯片,并通过Pannoramic Viewer软件(3DHISTECH Ltd)捕获图像。

免疫组织化学染色评分通过染色位置,强度和阳性细胞百分比进行半定量评估。如果HMGB1仅在细胞核中染色,则得分为1。血浆染色强度分级为0(阴性),2(弱染色),3(中度染色)或4(强染色)。阳性百分比分为1(<30%),2(30-60%),3(> 60%)。将这两个等级加在一起即可得出免疫反应评分(IRS)。与其他病理学家讨论了IRS中有差异的病例,直到达成共识为止。免疫组化染色的评估是由两名不了解临床病理特征的研究人员(Z. Wang和CH CH Yang)进行的。

酶联免疫吸附测定(ELISA)

HMGB1浓度在三明治ELISA中进行测试。通过小鼠HMGB1 ELISA试剂盒(ArigoBio,#ARG81310)测试包含鼠血清,细胞培养上清液的样品,并通过人HMGB1 ELISA试剂盒(ArigoBio,#ARG81185)测试人血清。程序按照提供的手动协议进行操作。

体外中性粒细胞干预测定

从幼稚的BALB / c小鼠BM和人PB中分离出嗜中性粒细胞。将细胞悬浮在完全RPMI-1640培养基中,并接种在平板底部96孔中(1×10 5个细胞/ )。以下试剂/添加剂用于体外嗜中性白细胞干预。(1)4d,e用 3000× g超滤管离心15分钟得到的浓缩的组织和细胞培养上清液  (Millipore,#UFC900396)(2)TLR激动剂,包括Pam3CSK4(10 ng / mL,TLR2 / TLR1激动剂,InvivoGen,#tlrl-pms),FSL-1(10 ng / mL,TLR2 / 6激动剂,InvivoGen,#tlrl -fsl),Poly(I:C)(LMW)(100 ng / ml,TLR3激动剂,InvivoGen,#tlrl-picw),MPLA-SM(1μg/ mL,TLR4激动剂,InvivoGen,#tlrl-mpla), FLA-ST(1μg/ mL,TLR5激动剂,InvivoGen,#tlrl-stfla),R848(1μg/ mL,TLR7 / 8激动剂,InvivoGen,#tlrl-r848),TLR9激动剂套件,包含ODN 1585,ODN 1826,图6c中的 ODN 2395(1μg/ mL,TLR9激动剂,InvivoGen,#tlrl-kit9m); (3)图S5D中的 D-核糖(异构体的混合物,RAGE激动剂,MCE,#HY-W018772)(4)图6d中的 O-香兰素(100μM,TLR1 / 2和TLR2 / 6抑制剂,Sigma-Aldrich,#120804); (5)图6d中的 TAK242(10 µM,TLR4抑制剂,MCE,#HY-11109); (6)图6d中的 TTP488(4 nM,RAGE抑制剂,Selleck,#S6415); (7)图4c中的重组鼠HMGB1蛋白(Biolegend,#764004)和图5d中的重组人HMGB1蛋白(Biolegend,#557804); (8)添加了HMGB1抑制剂,包括甘草酸(200μM,Sigma-Aldrich,#PHR1516)和丙酮酸乙酯(1 mM,Sigma-Aldrich,#E47808)(图4f)。(9)图5e中 20%的人血清,包括健康供体,TNBC和非TNBC 4小时后收获中性粒细胞用于流式细胞术分析或RT-PCR。

体内重组HMGB1预干预

为了评估重组鼠HMGB1蛋白(rHMGB1)在4T1荷瘤小鼠中的作用,我们进行了如图S6B所示的实验年龄匹配的BALB / c小鼠随机分为两组。提前一周使用PBS(对照组)或rHMGB1(rHMGB1预处理)(每隔一天125μg/ kg(iv)),然后在小鼠体内原位注射4T1细胞,然后继续干预2周。肿瘤接种3周后处死小鼠,取肺组织进行H&E染色。

体内肿瘤细胞转移测定

短期观察组(图2i):为评估4T1和EMT6肿瘤细胞形成肺转移的能力,在雌性BALB / c小鼠中接种了4T1-Control,4T1-shHMGB1和EMT6-Control,并接种了EMT6-HMGB1肿瘤细胞。第四乳垫(1×10 5 /100μl)。然后在乳房垫接种2周后(iv)注射表达荧光素酶的EMT6(1×10 6 /100μl),并在2小时内进行体内成像。

长期观察组:以进一步评估rHMGB1和CD62L的功能暗淡在肺转移形成中性粒细胞,实验分组被表现为图 图7aS6B简而言之,在EMT6或4T1原位植入后两周注射(iv)表达萤光素酶的EMT6(iv)(1×10 6 /100μl),然后从4T1 2周荷瘤后获得rHMGB1(125μg/ kg)或CD62L 昏暗中性粒细胞小鼠的PB(1×10 7每隔一天注射(iv)细胞(100μl)2周,同时给予PBS进行对照。给小鼠注射D-荧光素(ip)(Promega,#E1601,100 mg / kg),并用异氟烷(RWD,#R510-22)进行气体麻醉,然后使用IVIS Lumina LT(Perkin Elmer)在体内进行生物发光成像。 4周。

体内治疗干预

为了进行体内成像,在4T1肿瘤乳垫接种(1×10 5细胞/ 100μl)后第2周注射(iv)表达荧光素酶的4T1(1×10 6细胞/ 100μl),然后持续干预2周。干预策略在图7b中进行了描述:分别注射(ip)甘草次酸(20 mg / kg),丙酮酸乙酯(100 mg / kg),邻香兰素(50 mg / kg)和DNAseI(Destroy NETs,Roche,每隔一天注射(iv。)#11284932001,2.5mg / kg)给小鼠注射D-荧光素(ip),并用异氟烷进行气体麻醉,然后使用IVIS Lumina LT进行体内生物发光成像。

为了进行流式细胞术分析,同时开始进行4T1肿瘤乳垫接种和干预。每隔一天注射一次(ip甘草酸(20 mg / kg),丙酮酸乙酯(100 mg / kg),O-香兰素(50 mg / kg )和DNAseI(2.5 mg / kg)。2周后,获得肺组织和PB用于随后的流式细胞术分析。

救援测定

将成年的配对BALB / c小鼠随机分为4组:1)4T1-shHMGB1组,2)4T1-shHMGB1和rHMGB1干预组,3)4T1-shHMGB1-HMGB1过表达(4T1-shH-H)组,4)4T1 -shH-H与丙酮酸乙酯(EP)干预组。为了进行体内成像,在接种不同肿瘤细胞(1×10 5细胞/ 100μl)后第2周注射(iv)表达荧光素酶的4T1(1×10 6细胞/ 100μl)。然后每隔一天注射一次(iv)EP(100 mg / kg)和rHMGB1(125μg/ kg)。干预持续2周,另外两组均给予PBS,同时给对照组小鼠注射D-荧光素(ip)并用异氟烷进行气体麻醉,然后使用IVIS Lumina LT进行体内生物发光成像。

对于流式细胞术分析,同时开始不同的肿瘤乳垫接种和干预。2周后,获得肺组织和PB用于随后的流式细胞术分析。




武汉新启迪生物科技有限公司联系邮箱:
service@qidibio.com  techsupport@qidibio.com  
武汉新启迪生物科技有限公司咨询客服:周一至周五8:30-17:30
联系我们
服务保障                        支付方式
武汉新启迪生物科技有限公司联系电话:
027-87610298
027-87610297