卵巢巨噬细胞分泌趋化因子配体，通过CCR 1促进卵巢癌大网膜定植

大网膜是卵巢癌转移最常见的部位。被称为乳白色斑点的免疫细胞簇在整个网膜中被发现。然而，这些免疫细胞是否与卵巢癌转移有关尚不清楚。在此，我们报告了巨噬细胞通过分泌趋化因子配体与趋化因子受体1(CCR 1)相互作用，促进卵巢癌细胞向大网膜迁移和定植。我们发现巨噬细胞的减少减少了卵巢癌大网膜的定植。从小鼠大网膜和肠系膜脂肪组织中分离出的巨噬细胞RNA序列显示，趋化因子配体CCL 6在巨噬细胞中有特异性的富集。CCL 6和人同系物CCL 23通过激活ERK 1/2和PI3K通路，促进卵巢癌的迁移。重要的是，CCR 1的抑制减少了卵巢癌的定植。这些发现表明巨噬细胞通过CCR 1信号途径诱导卵巢癌细胞定植的重要机制。

卵巢癌是女性中第七大最常见的癌症，2018年全球新增病例30万例，死亡人数185,000人。1。到2020年，估计美国将有21,750例卵巢癌新病例，13,940名妇女将死于这一疾病。2。卵巢癌起源于卵巢或输卵管，并在整个腹腔转移。3。转移性疾病，而不是原发肿瘤，是导致卵巢癌相关死亡的原因。4。然而，支持腹膜内转移的基本机制尚不清楚。

大网膜是卵巢癌细胞的首选转移部位。大多数诊断为高级别浆液性卵巢癌的妇女均伴有大网膜转移。5,6,7。在卵巢癌实验模型中，卵巢癌细胞在注射后1~6h内向大网膜转移。8。大网膜是一种脂肪组织，含有多种细胞类型的次级淋巴样结构，包括脂肪细胞、血管和称为乳白色斑点的白细胞簇。9,10,11,12,13,14,15。乳斑含有巨噬细胞、B细胞、T细胞和NK细胞，它们在致病性攻击过程中迅速流出腹膜。10,16。虽然不同类型的细胞，包括中性粒细胞、间皮细胞和脂肪细胞，已被证明支持卵巢癌向大网膜转移，但对于组织内免疫细胞在大网膜转移中的作用知之甚少。7,15,17.

巨噬细胞促进了几种肿瘤模型的转移。在乳腺癌中，巨噬细胞通过改变血管通透性和促进向血液中迁移，从而促进肿瘤细胞的早期血液传播。18。趋化因子在促进乳腺癌转移的趋化因子级联中增强癌细胞与巨噬细胞之间的相互作用。19。在卵巢癌中，巨噬细胞驱动的炎症可促进腹腔内转移和产生腹水。20。巨噬细胞特异性亚群可能参与促进大网膜转移17.

在本研究中，我们描述了巨噬细胞衍生趋化因子配体在促进大网膜卵巢癌细胞定植中的作用。与肠系膜脂肪巨噬细胞相比，小鼠大网膜巨噬细胞的基因表达谱显示出明显的基因表达模式，趋化因子配体CCL 6在卵巢癌细胞侵染大网膜之前和过程中表达明显上调。CCL 6通过趋化因子受体CCR 1诱导卵巢癌细胞迁移，这是卵巢癌细胞定植的重要步骤。此外，小鼠卵巢癌细胞CCR 1的失活可阻断CLL 6诱导的迁移，并消除其在大网膜上的定植能力。在卵巢癌患者中，CCR 1的表达与预后较差有关。此外，CCL 6的同源基因CCL 23在人大网膜分离的巨噬细胞上表达。这些观察证实了CCR 1及其配体CCL 23在卵巢癌中的重要性。

大网膜是卵巢癌转移的利基

大网膜血管的特点是存在许多分支血管，最终在大网膜周围的肾小球样毛细血管床中结束。免疫细胞聚集在这些毛细血管床周围和内部，形成乳白色斑点。乳白色斑点含有单核细胞簇(CD11b)。+)，B细胞，巨噬细胞，CD11c+细胞和T细胞都在间皮衬里的间隙之下(图)。1A)。毛细血管的内皮衬里和上覆的间皮适于促进免疫细胞的迁移。其他结构元素由成纤维细胞、间充质细胞、胶原和弹性纤维提供。1A).

a一个天真的未受刺激的乳白色斑点和卵巢癌转移激活的乳白色斑点在小鼠大网膜内的表现。与扩大的肿瘤免疫细胞区相关的巨噬细胞数量增加，癌细胞从乳白色斑点生长到中央脂肪区，最终取代它。b, c在人和老鼠的样本中可以检测到奥马尔乳白色斑点。幼稚大网膜组织切片IHC染色H&E、CD 45和巨噬细胞(小鼠F4/80和人CD 68)。人类未涉及的乳白色斑点(b内嵌a, b)和鼠标(c内嵌a)。在人网膜乳白色斑点内发现了卵巢微小转移瘤(b内嵌c)和鼠标(c内嵌b)；刻度尺=100公厘。dC57BL/6小鼠腹腔注射ID8癌细胞，连续9周检测腹腔转移(>1mm)，观察腹腔内转移情况。n=6)。e小鼠全网膜切片F4/80染色的典型数字扫描。乳白色斑点在注射后第0周(未注射大网膜)和第1周，第2周，第3周，第4周，ID8细胞注射后。(底部)×40放大，在每个时间点的乳斑区域。(刻度棒=1×，1000μM；40×，50μM)。

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为了研究组织内巨噬细胞在大网膜转移过程中的作用，我们首先证实了正常人和小鼠大网膜乳白色斑点中存在巨噬细胞(图1)。1B，c)。有趣的是，在无大体疾病的卵巢癌患者的网膜中，显微镜下的转移仅限于乳白色斑点，在此早期阶段没有在脂肪组织中观察到(如图所示)。1B)。同样，小鼠大网膜的微小转移局限于腹腔内早期时间点(24 H)的乳白色斑点(I.P.)ID8细胞的注射1C).

我们接下来研究了小鼠卵巢癌模型腹腔内转移的动力学。腹腔注射ID8小鼠卵巢癌细胞。在C57BL/6小鼠中，转移定植的解剖分布随时间的推移而变化。有趣的是，大网膜在注射后一周内是第一个发生宏观转移的部位，并在6周内仍然是唯一的腹膜转移部位，此后转移出现在其他部位(图1)。1D)。这与卵巢癌患者的观察结果相似，他们在诊断时经常出现大网膜转移，但可能没有其他有重大疾病负担的部位。5,6。注射后第1周，癌细胞定植后，乳白色斑点数量和大小增加。免疫细胞，特别是巨噬细胞的数量在第2周增加。我们观察到肿瘤在早期定植后继续从乳白色斑点扩展到大网膜的脂肪组织。1E)。这些发现提示免疫细胞丰富的乳白色斑点是卵巢癌细胞在大网膜内早期转移的部位。

巨噬细胞促进卵巢癌大网膜定植

以前的研究在小鼠(ID8)和人卵巢癌模型(CaOV 3、HeyA 8或SKOV3ip.1)中都表明，大网膜的定植不依赖于B-、T-和NK-细胞。21。为了确定巨噬细胞在大网膜定植中的作用，我们在注射前用氯膦酸脂质体耗尽C57BL/6和无胸腺裸鼠的巨噬细胞。分别注射小鼠ID8或人SKOV3ip.1卵巢癌细胞(图1)。2A)。引人注目的是，我们观察到腹腔注射后7天，巨噬细胞耗竭小鼠大网膜的卵巢癌负担减少了11倍。肿瘤细胞的注射(图。2B)。有趣的是，当腹腔巨噬细胞在注射SKOV3ip.1细胞后第三天使用氯膦酸脂质体被耗尽时，我们未能观察到大网膜定植的减少。(补充图。1)。这些发现支持了我们的假设，巨噬细胞是启动卵巢癌大网膜定植的关键。

a氯膦酸脂质体治疗ID8/SKOV3ip.1 7 dpi体内转移实验设计b代表大网膜图像的是淋巴细胞(CD 45)、巨噬细胞(F4/80)和癌细胞(PAN-CK)。每一个模型的dda(pan-CK)染色区域的量化显示在右边(*)。p < 0.05; n=3)。(c–e) c主成分分析(PCA)基因表达的大网膜(OM)和肠系膜(My)脂肪组织巨噬细胞。每个数据点表示从三个欧塔中提取的巨噬细胞(n=3)。d所有趋化因子的热图(c). e与单纯肠系膜巨噬细胞相比，幼稚巨噬细胞趋化因子基因的表达高度上调(时点0)。fC57BL/6小鼠巨噬细胞CCL 6基因表达分析n(2)Q-RT PCR。以264.7细胞为阳性对照。g良性疾病患者巨噬细胞CCL 23基因表达分析(英文)n=2)。以PBMC为阳性对照。h体重匹配的幼稚大网膜和腹膜脂肪组织条件培养液中CCL 6水平的ELISA检测n=3)。i良性患者标本条件培养基CCL 23水平的ELISA检测。大网膜巨噬细胞(Hom-Mϕ1、2和3)和全网膜组织(OC 157、158和159)分别代表不同的良性组织。以PBMCs条件培养基为对照。jC57BL/6和无胸腺裸鼠幼稚大网膜组织CCL 6(红色)和F4/80(绿色)和细胞核(蓝色，DAPI)共定位的免疫荧光染色。k同样，CCL 23(红色)和CD 68(绿色)来源于良性患者的大网膜。(标尺=20m)。

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卵巢巨噬细胞条件培养液促进卵巢癌细胞迁移

以上发现提示巨噬细胞在卵巢癌转移定植中的重要作用。因此，我们研究巨噬细胞是否能诱导卵巢癌细胞迁移，作为转移定植的一个重要方面。为此，CD11b+从正常小鼠网膜中分离细胞，培养产生条件培养基(附图)。2A)。CD11b+从小鼠性腺脂肪中分离出的细胞被用来进行比较，因为我们先前的研究表明，在大网膜外腹膜内脂肪缺乏早期转移。21。CD11b产生的条件培养基+从小鼠网膜中分离出的细胞显著增加了ID8卵巢癌细胞的迁移(附图)。2B)。大网膜CD11b条件培养基的比较+性腺脂肪CD11b条件培养基+细胞对卵巢癌细胞迁移的影响较小。为了在人体组织中证实这些发现，我们从良性疾病患者的大网膜中分离出巨噬细胞(CD 45)。+CD 14+CD 68+细胞；附图3B)。类似于小鼠CD11b的效应+所有人巨噬细胞条件培养液均显著促进人SKOV3.ip1细胞的迁移(附图)。二维空间)。这些发现提示大网膜巨噬细胞分泌趋化剂进入肿瘤微环境，从而促进迁移，从而增强卵巢癌细胞的转移潜能。

巨噬细胞rna序列分析显示了不同的基因表达模式。

接下来，我们研究了调节巨噬细胞诱导的大网膜定植的机制。为此，研究了巨噬细胞在大网膜定植过程中基因表达的变化。巨噬细胞(CD 45)+/CD11b+/F4/80+)在注射ID8细胞前、注射后24小时和7天分别从小鼠网膜中分离得到(Dpi)。在相应的时间点对巨噬细胞进行RNA测序分析(补充图)。3A)。以肠系膜脂肪组织巨噬细胞RNA为对照。对腹腔巨噬细胞在腹膜内转移过程中表达的12756个基因进行层次聚类和主成分分析，得到了各种重要的观察结果。第一，在注射ID8细胞之前，新生巨噬细胞表现出与肠系膜脂肪组织来源的巨噬细胞不同的基因特征(1283个基因在大网膜和肠系膜来源的巨噬细胞之间有差异表达)。第二，注射ID8细胞后，大网膜巨噬细胞的基因表达有明显变化，而肠系膜脂肪组织源性巨噬细胞的基因特征无明显变化。(无花果)2C)。大网膜巨噬细胞在24 h和7 dpi表达的基因在细胞粘附、免疫应答、细胞因子-细胞因子受体相互作用和趋化性等方面明显富集(附图)。3C)。在趋化因子中，CCL 6基因在幼稚巨噬细胞中的表达量比未成熟的肠系膜巨噬细胞(时点0)高一倍。此外，我们观察到CCL 6在大网膜而不是肠系膜巨噬细胞中的表达在定植过程中显著增加。2D，e)。因为CCL 6主要由巨噬细胞表达22,23,24我们推测巨噬细胞来源的CCL 6可能通过与卵巢癌细胞上表达的CCR 1受体相互作用而促进早期网膜转移。

我们分别用qRT-PCR技术验证了CCL 6和CCL 23在流式小鼠和人巨噬细胞中的表达。2F，g)。从幼稚的小鼠中产生的条件培养基含有高水平的分泌CCL 6(图1)。2H)。高水平的CCL 23也检测到在条件培养基中从整个人的大网膜，没有肿瘤和人大网膜来源的巨噬细胞(图一)。2I)。组织切片的免疫荧光染色进一步证实了CCL 6表达F4/80的存在。+小鼠巨噬细胞及其表达CD 68的CCL 23+人网膜中的巨噬细胞(图1。2J，k).

CCL 6和CCL 23促进卵巢癌转移

我们推测CCL 6和CCL 23分别是小鼠模型和人类大网膜中重要的定植介质。这两种趋化因子配体都能诱导迁移，这是定植的一个重要方面。因此，我们研究了CCL 6和CCL 23促进小鼠和人卵巢癌细胞迁移的能力。小鼠ID8和人SKOV3ip.1细胞均呈浓度依赖性向CCL 6和CCL 23迁移。3A，b)。这种作用并不是由于细胞增殖增加所致，ID8和SKOV3ip.1细胞在100 ng/mL CCL 6或200 ng/mL CCL 23存在的无血清培养基中均未见细胞增殖的差异。3C)。抗体介导的CCL 6中和阻止了ID8细胞向小鼠网膜条件培养基的迁移(图)。三维空间)。同样，CCL 23中和抗体也能阻断SKOV3ip.1向条件培养基迁移。3E).

a, b典型结晶紫染色法检测ID8/SKOV3ip.1细胞对不同浓度CCL 6和CCL 23的Transwell迁移。统计意义(*)p < 0.05) was determined for all conditions versus the serum-free media control by ordinary one-way ANOVA analysis. cMTS法检测CCL 6/CCL 23(100 ng/mL~200 ng/mL)对ID8/SKOV3ip.1细胞增殖的影响。以10%FBS为阳性对照。d, e在抗CCL 6(2.5μg/mL和5μg/mL)存在下，用Transwell迁移试验检测ID8细胞；n=3)抗CCL 23(2.5μ/mL~5μg/mL)对小鼠大网膜条件培养基和SKOV3ip.1细胞；n=3)。对无血清对照(Sf)对照(*)的每一种情况进行双向方差分析，以确定其统计学意义。p < 0.05). fCCL 6(200 ng/mL)处理ID8和CCL 23(200 ng/mL)处理SKOV3ip.1的westernblot分析n=3)。g, h用CCL 6和CCL 23分别作用于ID8和SKOV3ip.1卵巢癌细胞上的磷酸辅蛋白(红色)、肌动蛋白细胞骨架(绿色)和细胞核(蓝色，DAPI)的免疫荧光染色。n(标尺=20m)。iCCR1-CCL 6/CCL 23信号通路的图式表现导致卵巢癌细胞迁移潜能的增加。jPI3K抑制剂BEZ 235处理SKOV3ip.1对CCL 23的Transwell迁移实验(**)p < 0.008). k, l用MEK抑制剂Trametinib处理ID8对CCL 6和SKOV3ip.1细胞对CCL 23的Transwell迁移实验。m, nID8对CCL 6和SKOV3ip.1细胞向CCL 23迁移的Transwell迁移试验(肌球蛋白抑制剂)。用Tukey多重比较法进行双向方差分析，确定统计学意义。t-与200 ng/mL CCL 23处理条件进行对比试验。

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为了更好地了解CCL 6和CCL 23介导迁移的细胞机制，我们对CCL 6处理的ID8细胞进行了微阵列基因表达分析。发现CCL 6可诱导98个基因的上调和108个基因的下调。上调的基因聚集在调节细胞迁移的途径上，如整合素介导的细胞粘附、MAPK信号通路和RhoGTPases信号通路(补充表)。1)。在重要的迁移调节因子中，肌球蛋白9A(Myo9A)、LIMK 1和cofilin在CCL 6处理的ID8细胞中明显高于未处理细胞(补充图)。4A-C)。CCL 6处理的ID8细胞和CCL 23处理的SKOV3ip.1细胞的磷脂-蛋白质组学谱显示，pERK 1/2在两种细胞系中均升高，而在SKOV3ip.1细胞中则升高。4D，e)。PERK 1/2和Pakt部分通过磷酸化limk 1和p-cofilin来调节迁移。25,26,27,28(无花果)3F和补充图。4F-I)。我们证实免疫荧光法在ID8和SKOV3ip.1分别于CCL 6和CCL 23作用10 min后对p-cofilin有上调作用(图1)。3G，h)。我们推测CCL 6和CCL 23对ERK 1/2的磷酸化调控MYO9A，而MYO9A在迁移途径中调控下游的p-LIMK 1和p-cofilin(如图1所示)。3I)。MEK(Trametinib)和PI3K途径(BEZ 235)分别抑制ID8和SKOV3ip.1细胞向CCL 6或CCL 23的体外迁移(图一)。3J-l)。此外，肌球蛋白-9(博比司他汀)的抑制使ID8和SKOV3ip.1细胞分别向CCL 6和CCL 23的迁移减少了两倍(图1)。3m，n)。迁移试验中使用的BEZ 235、曲美替尼和布比司他汀的浓度不影响卵巢癌细胞的存活率(附图)。4J-n)。我们的发现提示CCL 6或CCL 23通过激活ERK和PI3-激酶途径诱导迁移，从而通过MYO9A和p-cofilin增强下游信号。

人和小鼠卵巢癌细胞CCR 1的遗传和药理抑制减少向CCL 6/CCL 23的迁移

CCL 6和CCL 23通过CCR 1趋化因子受体表达。为了确定CCR 1在巨噬细胞诱导的大网膜定植中的作用，我们首先验证了CCR 1在ID8和SKOV3ip.1细胞中的表达。5A)。CCR 1在ID8和SKOV3ip.1来源的肿瘤组织中表达。4A，b)。ID8和SKOV3ip.1细胞中CCR 1在CCL 6和CCL 23诱导迁移中的功能重要性CCR 1由CRISPR-Cas9。删除CCR 1通过测序和qRT-PCR检测CCR 1的表达(补充图)。5B-E)。在ID8中，CCL 6的诱导迁移被完全废除-CCR 1-空细胞(无花果)4C)。同样，CCR 1-缺失的SKOV3ip.1细胞对CCL 23诱导的迁移反应失败(图1)。4D)。肿瘤细胞增殖及存活率无明显差异。CCR 1-空细胞系相对于亲本细胞(附图)。5F，g)。接下来，我们利用CCR 1的小分子抑制剂(UCB 35625)来研究CCR 1阻断剂在减少卵巢癌迁移方面的治疗作用。UCB 35625抑制CCR 1可阻断CCL 6和CCL 23分别诱导ID8和SKOV3ip.1的迁移(图1)。4E，f).

aC57BL/6和无胸腺裸鼠ID8细胞向大网膜转移的CCR 1(红色)、细胞角蛋白(绿色)和细胞核(蓝色，DAPI)的免疫荧光(标度bar=20m)。bCcr 1(红色)、EpCAM(绿色)和细胞核(蓝色，DAPI)在高级别浆液性癌患者(标度bar=20m)上的免疫荧光。c, dID8和SKOV3ip.1与CCR 1基因缺失对CCL 6和CCL 23的Transwell迁移实验e, f用小分子拮抗剂UCB 35625(100 NM)对CCL 6和CCL 23进行Transwell迁移试验，观察ID8和SKOV3ip.1对CCR 1的药理学抑制作用。显示的数据表示技术复制的平均值和S.D值(n=3)每项条件。采用普通双向方差分析，比较各组血清无血清培养基(*)的统计学意义。p < 0.005; ****p < 0.0001).

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CCR 1卵巢癌细胞的敲除减少了大网膜的定植。

接下来我们研究CCR 1是否在体内卵巢癌细胞的大网膜定植中起重要作用。MRuby标记的ID8亲本细胞和ID8-CCR 1-空细胞注射。C57BL/6小鼠。在注射后24小时(HPI)和7 dpi时，取大网膜，用组织学和流式细胞术(见图)评估其转移情况。5A)。在大网膜24 HPI和7 dpi的乳白色斑点内可见大量的ID8亲本(对照)细胞灶。在这两个时间点，大网膜组织包含的ID8明显减少-CCR 1-空细胞与ID8-CRISPR对照细胞相比，24小时时减少3倍，注射后7天减少7倍(见图)。5B-d和补充图。6A-f).

aID8体内转移实验24 hpi和7 dpi的实验设计原理图。b代表切片在24 HPI和7 dpi处用IHC染色CK8/18(标度巴=100 m)。c定量显示ID8细胞在大网膜组织中的作用。dID8-mRUBY细胞在24 hpi和7 dpi(*)下大网膜定植的流式细胞术定量分析p < 0.05). eKaplan-Meier曲线显示百分比-注射ID8后存活率-父母，CRISPR-控制，或CCR 1-空单元(**)p < 0.001) (n=6/组)。f实验终点有代表性的H&E染色腹膜组织。ID8的H&E图像CCR 1空白组为小鼠安乐死97天，实验终点为ID8-CRISPR-对照组。(标尺=100平方米)。g不同卵巢癌组织学组织芯片CCR 1和IHC表达的3例子宫内膜样组织学标本(*)p < 0.0001). h, i卵巢癌患者无进展生存期CCR 1表达的Kaplan-Meier生存分析(log-秩检验)h所有阶段和i第一和第二阶段。

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然后，我们确定CCR 1是否与更积极的体内肿瘤生长及其对生存的影响有关。ID8-父母，ID8-CRISPR-控制，或ID8-CCR 1-空细胞注射。变成老鼠。小鼠注射ID8-CCR 1-与注射ID8-CRISPR-Control或ID8亲代细胞相比，空细胞的肿瘤生长进程明显减慢，存活时间更长(见图)。5E)。9周后，所有老鼠(n(5/组)注射ID8的亲代细胞已形成腹水和广泛的腹膜转移(见图)。5F)。相比之下，没有一只小鼠注射了ID8-CCR 1-空细胞此时已发展为腹水或其他疾病迹象。注射ID8小鼠的中位总生存期(OS)CCR 1-空细胞为156天，因此，与ID8-亲本(OS：64天)和ID8-CRISPR-对照(OS：97天)相比，空细胞明显延长(见图8)。5E).

ID8肿瘤模型中生成的数据表明CCR 1表达导致体内存活时间延长。为了评估临床标本中CCR 1的水平，组织芯片的IHC显示CCR 1在卵巢上皮性癌中高表达，这些亚型包括浆液型、子宫内膜样型和透明细胞组织学。有趣的是，交界性卵巢肿瘤，通常比侵袭性卵巢癌有更好的预后，没有显示任何CCR 1的显著表达。5G)。基于包括tcga在内的一组卵巢癌数据的基因表达数据。29与低表达的肿瘤相比，CCR 1高表达患者的无病生存期缩短。Ⅰ、Ⅱ期卵巢癌患者CCR 1表达水平与低表达组相比差异有显着性(HR2.13)，高CCR 1组中位无进展生存期为37个月；p=0.032)(图1。5H，i)。这些发现进一步支持了CCR 1对卵巢癌患者肿瘤预后的重要影响。

目前的研究，据我们所知，确定了一个新的机制，卵巢癌的大网膜定植介导的趋化因子配体分泌的大网膜驻留巨噬细胞。我们证明巨噬细胞分泌CCL 6或CCL 23促进卵巢癌细胞定植到大网膜乳白色斑点。在卵巢癌细胞中靶向CCR 1可显著减少癌细胞的迁移和大网膜转移，说明CCR 1在卵巢癌细胞转移中的重要作用。

巨噬细胞或其他免疫效应细胞在卵巢癌转移中的作用尚不清楚。我们以前已经证明卵巢癌细胞最初转移到大网膜上的乳白色斑点，但没有其他腹内脂肪组织，包括缺乏乳白色斑点的肠系膜组织。21。根据对免疫缺陷小鼠的研究，这种早期大网膜定植模式与B细胞、T细胞或NK细胞的存在无关。21。我们目前的研究表明，大网膜内巨噬细胞促进早期网膜转移定植。来自大网膜的巨噬细胞的基因表达谱与其他腹部脂肪组织相比显示出一种组织特异性的模式。包括肺或肝脏在内的其他器官中的巨噬细胞同样具有特定的基因特征，它们在各自的组织微环境中传递重要和特殊的功能。30。根据我们的资料，巨噬细胞分泌趋化因子配体支持卵巢癌细胞的早期转移，为卵巢癌患者大网膜的频繁参与提供了可能的解释。

趋化因子配体对细胞增殖、血管生成和转移有多种作用。31,32。CCL 6及其功能相同的人CCL 23主要由巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞表达。33。这些趋化因子配体在癌症、腹膜炎和慢性鼻窦炎中的表达可能被上调。34,35,36。CCL 6是已知的巨噬细胞趋化因子，其次是B细胞、T辅助细胞和嗜酸性粒细胞。37,38。在腹膜炎动物模型中，NK细胞活化可促进天然免疫应答。39。IL-4是免疫抑制型M2-巨噬细胞亚型的一种刺激物，能诱导巨噬细胞分泌CCl 6。40。同样，CCL 23是以依赖于STAT 6的方式诱导IL-4的。41。在小鼠肺癌模型中，CCL 6的过表达促进了肿瘤的生长和转移。32。同样，较高水平的CCL 23及其相应的受体CCR 1与乳腺癌患者无转移生存率降低有关。42.

大网膜和腹腔内的微环境，包括腹水，含有多种趋化因子配体。CCL 8(MCP 2)、CCL 13(MCP 4)、CCL 14(HCC 1)、CCL 15(MIP 5)和CCL 16(HCC 4)与CCR 1结合，尽管亲和力不同，因此有可能促进定植。35。然而，我们在巨噬细胞条件培养基上的实验强调了小鼠CCL 6和人类CCL 23的重要性。在这些复杂的环境中，CCL 6和CCL 23与其他多种趋化因子配体的中和完全抑制了卵巢癌细胞的迁移。因此，我们认为体内效应主要是由CCL 6和CCL 23介导的。相反，其他趋化因子受体可能在促进卵巢癌细胞向大网膜转移中发挥作用。例如，CCL 6可以与与转移相关的CCR 3结合。19。在我们的研究中使用的ID8和SKOV3ip.1细胞都没有表达CCR 3，因此我们排除了它在观察到的减少转移的作用。CCR 1删除的细胞。然而，CCR 3在卵巢癌中的表达，可能是促进卵巢癌转移的另一个重要受体。43.

CCR 1在肿瘤转移中的作用已在其他研究中得到证实，但不是在卵巢癌背景下，也不是由巨噬细胞来源的CCL 6/CCL 23介导的。发现大肠癌细胞在肝转移过程中CCR 1表达增加。44。在另一项研究中，ccr 1通过促进组织侵袭所需的骨髓来源细胞(Bm)分泌MMP 9和MMP 2金属蛋白酶来维持肝转移。45。通过CCR 1激活EGFR信号参与乳腺癌的侵袭和转移46。CCR 1介导的巨噬细胞与乳腺癌细胞的相互作用诱导趋化因子级联，促进转移。19。CCR 1活化增强“转移相关巨噬细胞”与癌细胞的相互作用，部分通过整合素α4促进癌细胞的外渗和转移。47。在朱等人的一项研究中，骨桥蛋白(OPN)在肝细胞癌中被发现上调了CCR 1的表达。CCR 1基因敲除可减少OPN在体内外诱导的迁移、侵袭和肺转移。48.

CCR 1促进单核细胞组织浸润，在其他各种疾病过程中起主要作用，包括类风湿关节炎等自身免疫性疾病。针对CCR 1治疗类风湿关节炎和多发性硬化症的临床试验表明，所使用的靶向药物耐受性好，但临床疗效有限。49。以CCR 1为靶点，减少肿瘤的转移或引起肿瘤微环境的改变，可能是由于单核细胞浸润减少而引起的抗肿瘤免疫应答。本研究的结果，以及CCR 1受体拮抗剂在人类临床试验中的安全性和耐受性，为将CCR 1拮抗剂作为治疗卵巢癌和其他癌症的新靶点提供了理论依据。

多种其他类型的细胞，如中性粒细胞、间皮细胞和脂肪细胞，已被描述为调节卵巢癌转移的细胞。15,17,50,51,52,53。中性粒细胞胞外陷阱(NET)的形成为卵巢癌细胞的种植提供了一个有利的转移前大网膜小生境。药物阻断网形成减少卵巢癌细胞的大网膜定植15。巨噬细胞的独特子集(CD 163)+Tim4+)能促进大网膜转移前的小生境。17。其他的研究集中在卵巢癌细胞与勾勒腹膜腔的间皮细胞之间的附着。这一过程受到多种粘附分子、蛋白酶和细胞外基质成分的调控。50,53。例如，纤维连接蛋白受体如α5β1-整合素在卵巢癌细胞表面表达，并通过肌球蛋白介导的牵引力介导粘附。54。此外，癌细胞分泌的转化生长因子-β激活了间皮细胞RAC 1/smad介导的信号通路，导致纤维连接蛋白基因转录上调，诱导间皮细胞出现emt样表型。50。癌细胞与间皮粘附后，间皮清除。3,51。在此过程中，间皮细胞被卵巢癌球体所取代，随后癌细胞侵入腹膜组织的深层。54。特别是低氧信号增强间皮和卵巢癌细胞中赖氨酸氧化酶(LOX)的表达，促进胶原交联和肿瘤细胞侵袭。52。此外，在卵巢癌的发展过程中，大网膜脂肪细胞提供脂肪酸作为卵巢癌细胞的能量来源。7.

在现有工作和文献的基础上，提出了一种大网膜定植的多步模型.间皮细胞促进卵巢癌细胞与大网膜的粘附。随后的迁移和归巢到乳白色斑点是由巨噬细胞通过趋化因子配体诱导的。巨噬细胞和癌细胞之间的相互作用创造了一个炎症环境，激发了包括中性粒细胞在内的其他免疫效应细胞。网状网的形成进一步促进了卵巢癌细胞的定植。脂肪细胞则为肿瘤细胞的持续生长提供所需的能量。需要进一步的研究来探索这一复杂的过程，并确定治疗干预的机会。

细胞株

人SKOV3.ip1卵巢癌细胞系在Dulbecco改良的Eagle培养基(10-013-CV，Corning Cell格罗)中培养37°C，加入10%(v/v)胎牛血清(S 11150，亚特兰大生物制品，Lawrenceville，GA，美国)和1%青霉素链霉霉素(Pen Stretomycin，v/v)(15240，Invitrogen)。同样，在DMEM中添加4%FBS、1%青霉素Strep和1%胰岛素-转铁蛋白-硒(25-800-CR，Corning)，培养小鼠ID8卵巢癌细胞系。原264.7细胞和人外周血单个核细胞(HPBMCs)分别在10%RPMI、10%FBS和1%青霉素链霉素中培养。用慢病毒载体pLVX-mRuby构建稳定表达mRuby(ID8-mRuby/SKOV3ip1.mRuby)的卵巢癌细胞株ID8或SKOV3ip.1。将mRuby标记表达载体与包装载体混合PMDL(PVSV-G)和PSPAX 2慢病毒表达质粒转染HEK293T细胞，形成病毒条件培养基。利用斯坦福流式细胞术核心设备中的BD FACS Aria II系统(BD生物科学，圣何塞，CA)对荧光激活的细胞进行分选，以筛选高表达mRuby的细胞。所有细胞均在标准组织培养条件下(即在37℃加加5%CO的加湿器中进行保存)。2).

病人样本

Omenta是根据批准的IRB方案在科室获得的。斯坦福医院妇产科主任。在采集样本之前，从每个病人那里获得知情同意。从良性疾病患者中分离出具有HGSC和网膜的卵母细胞标本，并进行组织学分析和体外检测，如下所述。

小鼠

所有小鼠按照APLAC协议并在斯坦福动物资源中心的监督下被安置、维护和安乐死。6-8周，雌性，近交系C57BL/6(C57BL/6NHsd；免疫能力)和裸露(无胸腺裸露-)FOXN 1从Harlan实验室(印第安纳波利斯，IN)获得Nu；T细胞缺陷小鼠。所有动物研究都是按照斯坦福APLAC批准的协议进行的。所有小鼠随机分为适当的治疗组。

体内实验转移试验

指数生长无标记或mRuby标记-ID8父母，ID8-CCR 1-空细胞，ID8-CRISPR-对照细胞被胰蛋白酶化，在2×10浓度下制成单细胞悬液。6细胞/mL在冰冷PBS中。动物腹腔注射细胞悬液500μL(1×10)。6)。在所有实验中，将500μL的PBS作为阴性对照在平行对照组小鼠中注射。在每项实验的实验终点(24小时或7 dpi)，根据apLAC协议通过CO对小鼠进行安乐死。2采用窒息和二次手术治疗颈椎脱位。在时间过程实验中，从每只小鼠中计算出明显可见的大于1mm的腹膜转移。然后，如“方法”所述，组织被采集、加工、切片和染色。

氯膦酸脂质体在巨噬细胞耗竭中的应用

在癌前和癌后注射实验中，腹腔巨噬细胞被注射含氯膦酸酯的脂质体(clodronateliposome.org)耗尽。用流式细胞仪和F4/80抗体对巨噬细胞进行细胞学检查，观察巨噬细胞在体内的耗竭情况。选择1 0 0μL的脂质体稀释于PBS中，经腹腔注射。每隔一天给老鼠。对照组用PBS作为对照组，对未受刺激的巨噬细胞或生理盐水脂质体进行对照，以控制脂质体的非特异性作用。实验期间维持巨噬细胞耗竭状态。

小鼠和人巨噬细胞的分离

从C57BL/6小鼠中摘除Omenta(n=9)并作为三组处理(n=每组3人)。采用改良的脂肪组织解离试剂盒(130-105-808，Miltenyi Biotech)获得小鼠网膜的单细胞悬液。用人肿瘤分离试剂盒(130-095-929，Miltenyi生物技术)将人大网膜标本分离成单细胞悬液。在含1%FBS的PBS中进行ACK裂解和再悬浮，应用流式细胞术对小鼠或人巨噬细胞进行分析和分类。

抗体与流式细胞术

分离的小鼠和人大网膜细胞在添加1%FBS的PBS中重新悬浮。小鼠巨噬细胞分类实验包括CD45-FITC(克隆-30-F11，eBioscience)，CD11b-APC(克隆-M1/70，eBioscience)，F4/80-PE(克隆-BM8，eBioscience)。同样，设计用于人类巨噬细胞分类的人类面板包括CD45-FITC(克隆-HI30，eBioscience)，CD 14-PE(克隆-61D3，eBioscience)，CD68-PECy7(克隆-eBioY1/82A，eBioscience)。在小鼠和人流板上，采用水胺(L 34957，Fisher Science)作为活/死染色，补偿珠(01~1111，eBioscience)作为补偿对照。用流式细胞仪在BD InfluxFlow分选仪上对标记细胞进行分类，或在斯坦福共用FACS设备上对BD-LSRⅡ进行分析。为进行RNA-seq分析，将CD 45+CD11b+F4/80+细胞分为RLT缓冲液，并立即进行RNA提取。

RNA序列分析

对于整个转录组测序库中的每一个样本，从测序器中获得了43-66亿个75碱基配对末端读图.用FastQC 0.11.4测定阅读质量。读取与小鼠参考基因组(NCBI 37/MM9)比对使用STAR 2.4.2a，剪接连接由GTF文件(UCSC)定义。平均而言，93%的读取与参考基因组一致，87%的读取与参考基因组唯一一致。用量子模式、基因计数法测定基因在原始计数中的表达。用袖扣2.2.1使每百万对齐读(FPKM)中的每千碱基酶片段(FPKM)中的基因表达正常化。此外，用DEseq 2 1.12.4计算了条件间的差异表达。每个样本之间的折叠变化使用DEseq 2计算。选择上调2倍或下调2倍的基因，用david(David)进行基因集富集分析。Https://david.ncifcrf.gov/)用基因集注释Go BP和KEGG数据库。前10位的基因只用于可视化。

CRISPR/Cas9基因组编辑

人(AACTTTAGTCGATCCAGAA)和小鼠(GACTTAGATACAGG)CCR 1利用广域研究所遗传扰动平台WebPortal的sgRNA设计工具对sgRNA序列进行了鉴定55。从人和小鼠GeCKOv 2文库中的非靶向序列中提取人(ACGGAGGTAAGCGTCGCAA)和小鼠(GCGAGGTATTCGCTCCGCG)的非靶向序列。56。寡核苷酸克隆入pLentiCRISPRv 2(冯章馈赠；Addgene质粒52961)56)转化为Stb 3细菌。将含有sgRNA指南的pLentiCRISPRv 2载体pMD2.G和pSPAX 2(来自DidierTrono；Addgene质粒12259和12260)转染293 T细胞，获得慢病毒载体。培养24h后，收集上清液，经0.45μm滤膜过滤，加入ID8(小鼠)或SKOV3ip.1(人)细胞单层。转染ID8/SKOV3ip.1细胞后，在含有0.6/0.4g/mL普罗霉素的培养基中培养1周，用有限稀释法筛选单个克隆，然后在含嘌呤霉素的培养基中扩增。

用PCR技术扩增小鼠靶基因组区。CCR 1前进：5‘-TTCCTGCTTCTT-3’和反向：5‘-TCATTCTGTTCCTCTT-3’和人CCR 1正向：5‘-TACCACAAAGAGGTTCA-3’和反向：5‘-TGACACACACAGTTTGA-3’)，并进行了潮汐-seq分析57。为了鉴定每个细胞系的特异性损伤，我们克隆了TOPO(LifeTechnologies)PCR产物，并对每个分离细胞系的10个菌落进行了序列测定。

细胞增殖试验

细胞增殖试验：细胞接种96孔板(1.5×10)。3细胞/井)。在指定的时间点，MTS法(Promega，G 3530)根据制造商的指示检测细胞增殖。数据以平均±S.D表示。三个独立的实验。

实时RT-PCR

总RNA用RNeasekit(前胶原)提取，用上标StrandIII cDNA重排(Invitrogen)反转录成cDNA。采用SSO快速常绿超混合(Biorad)技术，在斯坦福功能基因组学设施的应用生物系统7500快速实时PCR系统上进行了实时PCR。目标基因的表达被归一化为管家基因18S。以小鼠生264.7细胞和人外周血单个核细胞为阳性对照，进行基因表达研究。

目的基因特异性引物是从集成DNA技术(IDT)中获得的.本研究中使用的引物序列在补充表中显示。2。所有实时rt-pcr均分为三组，各靶基因的相对mRNA表达采用公式2测定。−ΔCT(C)T，周期阈值)，其中ΔCT=CT(靶基因)−CT(18s)。各靶基因在不同样本间的相对表达水平为2。−ΔΔCT.

组织和细胞条件培养基的产生

三只刚切除的小白鼠被混合处理，制成一个细胞悬液，细胞损失最小。性腺脂肪同样被平行处理。巨噬细胞(CD11b)+用CD11b微球(Miltenyi Biotech)(附图)进行阳性选择，从基质和血管细胞(SVC)中分离细胞。2)。评估1×10的功能表型6细胞被镀后24小时内进行无血清培养基的培养，然后采用标准的Transwell迁移试验。

Transwell迁移试验

趋化因子CCL 6/CCL 23

细胞迁移试验，1.5×105(ID8)或3×105(SKOV3ip.1)细胞在无血清培养基上镀于8.0~μm 12孔板跨井插入(12孔格式，8μm孔；BD制药)。将CCL 6(250~06，PeproTech)CCL 23(300~29，PeproTech)或大网膜条件培养液(35~3503，BD Falcon)作为趋化剂加入板底。在中和实验中，将抗CCL 6(MAB 000487，R&D系统)和抗CCL 23(MAB 371，R&D系统)抗体添加到大网膜条件培养基中。药物抑制方面，采用CCR 1抑制剂UCB 35625(2757)、PI3K抑制剂-BEZ 235(S 1009、Selleckchem)、MEK抑制剂-trametinib(S 2673，Selleckchem)和肌球蛋白抑制剂-白比司他汀(1760，Tracis)进行迁移试验。对每一份样品进行一式三份的分析。细胞在37℃(5%CO)孵化器中孵育16h。2)。细胞孵育后，用PBS清洗细胞顶部和底部，用4%多聚甲醛固定细胞10 min。用PBS洗涤细胞后，用0.05%结晶紫染色40 min。然后用自来水冲洗两个房间，插入物顶部的细胞用棉签轻轻擦拭。显微镜下观察贴壁阳性染色细胞。数据以平均±S.D表示。三个独立的实验。

蛋白质分离与蛋白质印迹

从ID8和SKOV3ip.1细胞中提取蛋白质，在不同时间点用CCL 6/CCL 23处理，在4°C下搅拌30 min，用含有HIT(#1861278，热裂变剂)和EDTA(0.5%)的RIPA裂解法(pH7.4)提取蛋白质。采用双软骨酸法测定总蛋白浓度(皮尔斯，罗克福德，IL，美国)。在(4~12%)SDS-PAGE上分离出等量的蛋白质，并转移到硝化纤维素膜(Sigma，St Louis，MO，USA)上。在TBS-T中用5%的低脂干乳在室温下封闭1-h，然后在4°C下孵育一夜。根据制造商的推荐，采用原抗体稀释液。本研究所用的主要抗体有：抗pERK 1/2(p44/42)(#9101S，细胞信号技术)，抗总ERK 1/2(#9102S，细胞信号技术)，抗-Pakt(#4058S，细胞信号技术)，抗总AKT(#9272S，细胞信号技术)，抗pLIMK(#ab194798，ABCAM)，抗p-cofilin(Ser3)(#3313L，细胞信号技术)，抗-cofilin(#5175 S，细胞信号技术)，抗α-tubulin(#3873S，细胞信号技术)。第二天，在TBS-T中洗3次10 min后，用IRDye-680 nm结合山羊抗兔(#925-32211，Licor)和IRDye-800 Nm结合抗驴抗体(#926-32212，Licor)在室温下1：5000孵育1：5000。膜在TBS-T中冲洗10 min后，再由许可人奥德赛CLX成像系统成像.蛋白质条带的强度用Imagstudio软件(Windows应用程序VIO.02)半定量，每种蛋白对α微管蛋白的表达都是标准化的。

磷蛋白阵列

以CCL 6或CCL 23刺激的ID8和SKOV3ip.1细胞为研究对象，采用蛋白质组-剖面蛋白激酶阵列(#ARY003B，R&D系统)，在30 min时间点对蛋白裂解物进行处理和测定。每种条件下分别用ID8蛋白裂解物(500μg)或SKOV3ip.1蛋白裂解液(250μg)孵育膜。采用LICOR OdyseyCLX成像系统对膜进行化学发光成像。蛋白质条带使用Imagestudio软件(Windows应用程序VIO.02)半量化，按照制造协议使用标准化控制。

免疫组织化学

先用二甲苯处理60 min，30 min，10 min，每次3次。在1×枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)中，在常规蒸馏器中进行5 min的再水化处理。在室温下，将玻片置于封闭缓冲液(蛋白质块无血清随时可用，DAKO)中孵育60分钟。如上文所述，在制备标准幻灯片后，幻灯片与一次抗体和随后的二次抗体(补充表)一起孵育。1)。冲洗后，用免疫组织化学或DAPI孵育切片，用Evos荧光显微镜成像。应用Halo图像分析软件面积量化算法(Indica Labs，Corrales，NM)测定组织芯片上患者组织核心标本CCR 1水平。

统计与重现性

所有分组数据均为均值±S.E.M。单因素方差分析各组间的显着性差异t-使用GraphPad棱镜进行测试。公里绘图仪Https://kmplot.com/analysis/)分析卵巢癌患者CCR 1的预后。分析的所有浆液样本具有“自动选择最佳截止”的特征。对同一细胞类型的不同样本在不同时间内进行生物复制的数据进行统计分析，得到相似的结果。生物复制的数量包括在图中。人CCL 23 ELISA数据如图所示。2I作为单独的数据点来显示病人间的变异性。