玻璃体白细胞介素-35水平与B细胞玻璃体视网膜淋巴瘤预后的关系

玻璃体视网膜淋巴瘤(VRL)是一种罕见的B细胞源性疾病，预后差.调节性细胞因子通过抑制包括B细胞恶性肿瘤在内的多种肿瘤类型的抗肿瘤免疫来促进肿瘤的发展。为了明确B细胞VRL患者预后不良的调节细胞因子，我们测定了VRL患者玻璃体体液中调节性细胞因子的分布。回顾性研究包括22例VRL，24例非感染性葡萄膜炎(NIU)，20例特发性视网膜前膜(对照组)。用细胞珠法测定玻璃体调节细胞因子的浓度，并与临床资料进行相关性分析。IL-35和可溶性IL-2受体α水平在VRL组和NIU组明显高于对照组。高玻璃体内IL-35组的5年总生存率(OS)明显低于在发病时被诊断为VRL的低玻璃体内IL-35组(P<0.0 5)。P=0.024，对数秩检验)。玻璃体腔内IL-35水平高于中位数和低于中位数的5年OS率分别为40.0%和83.3%.我们的结果表明，高水平的玻璃体内IL-35水平预示着B细胞VRL患者在发病时预后不良。

大多数玻璃体视网膜淋巴瘤(Vrls)与高级别非霍奇金淋巴瘤(Nhl)有关，非霍奇金淋巴瘤是原发性中枢神经系统淋巴瘤(Pcnsl)的一个子集，可亚型为弥漫性大B细胞淋巴瘤(Dlbcl)。1。VRL常发生在老年免疫功能正常的患者中，常发生在视网膜、玻璃体腔和/或视神经内。2。大多数VRL要么表现为原发淋巴瘤，要么继发于中枢神经系统(CNS)淋巴瘤，或与中枢神经系统(CNS)淋巴瘤同时发生。在少数病例中，VRLs来源于全身转移性淋巴瘤。1,3。原发性VRL(PVRL)是一种罕见的VRL，在最初诊断时仅限于眼睛；在日本的一家转诊眼科中心，其发病率估计为每10万名眼部疾病患者21例。4。60-90%的PVRL患者的CNS受累(预后差的指标)发生在眼部症状开始后。5,6。最近，一些前瞻性研究表明，玻璃体内注射hd-mtx的化疗可以延缓vrl向中枢神经系统的进展，从而提高整体生存率(OS)。7,8,9。然而，由于治疗引起的不良事件，如神经毒性和肾毒性，这些治疗往往很难对老年患者和一般情况较差的患者实施。10,11.

肿瘤微环境由反应性免疫细胞、基质细胞、血管和细胞外基质组成，调节肿瘤细胞的存活和增殖，以及免疫逃避治疗耐药性，与B细胞恶性肿瘤预后差有关。12。在PCNSL标本中，肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)位于血管周围，伴随着肿瘤血管周围淋巴瘤细胞的聚集。13。最近，一些研究报告说，调节性细胞因子，如白细胞介素-10和白细胞介素-35，通过抑制肿瘤的抗肿瘤免疫功能来支持肿瘤的发展。14,15,16。调节性T细胞(Tregs)属于高度抑制性T细胞亚群，通过增加调节性细胞因子的分泌来维持自身的耐受性和抑制自身免疫，从而导致肿瘤的发生。17,18。IL-10被广泛认为是一种免疫抑制的细胞因子，它不仅对Tregs的抗肿瘤免疫有抑制作用，而且是恶性B细胞的有效生长和生存因子，可导致B细胞淋巴瘤的加重。14。IL-35是一种异二聚体细胞因子，由IL-12p35和Epstein-Barr诱导基因3(EBI 3)组成，属于IL-12相关细胞因子.据报道，IL-35通过诱导IL-10、Tregs和调节性B细胞的增殖而抑制效应T细胞的功能，因而具有抗炎和免疫抑制作用。19。IL-35还显示，抑制性受体(如程序性细胞死亡-1(pd-1)、T细胞免疫球蛋白和黏液蛋白结构域3)在tme的TIL上表达增加，从而抑制强效的抗肿瘤免疫。16。此外，IL-10相关的细胞因子，如IL-22，已经在序列同源性研究中被发现。伊-1020并报告在葡萄膜炎等眼部炎症疾病中起调节作用。21,22,23。因此，对调节性细胞因子的评估可使人们更好地理解B细胞VRL的发病机制，从而使其在临床上得到应用，如诊断指标和治疗靶点。

本研究旨在揭示VRL患者玻璃体体液中调节性细胞因子的分布，并与非感染性葡萄膜炎(NIU)患者进行比较。此外，我们还评估了调节性细胞因子与B细胞VRL患者临床参数的相关性，并观察到玻璃体体液中IL-35水平的升高与早期诊断为玻璃体视网膜病变的B细胞VRL患者预后不良呈正相关。

以下VRL患者(n=22)的临床资料见表1(1)VRL诊断年龄，(2)性别，(3)受累眼，(4)原发器官，(5)VRL初发后CNS预防或CNS病变是否有HD-MTX化疗，(6)VRL初发前是否有HD-MTX基础化疗治疗PCNSL，(7)脑受累，(8)恶性淋巴瘤最初诊断后复发，(9)B细胞VRL初步确诊与死亡之间的间隔时间。

玻璃体调节细胞因子水平

表中总结了对照组、VRL和NIU患者玻璃体调节细胞因子水平的数据。2。IL-10、IL-20、IL-22、IL-27、IL-35和可溶性IL-2受体α(sIL-2Rα)在正常对照组、vrl组和nIU组间差异有显着性(P<0.05)。2; P < 0.001, P < 0.001, P=0.0011，P=0.026，P < 0.001, P < 0.001, respectively). Vitreous levels of IL-22 (P=0.0044)和IL-10(P < 0.001) were significantly higher in patients with VRL than those with NIU and controls, whereas none was higher in patients with NIU than those with VRL and the control groups. IL-20 levels (PNIU组与VRL组和对照组比较，NIU=0.015)明显降低(P<0.05)。玻璃体IL-35水平(P < 0.001) and sIL-2Rα (P < 0.001) were increased in patients with VRL and NIU compared to controls, but were comparable in between patients with VRL and NIU. IL-27 levels (PVrl组与对照组比较，差异有显着性(P=0.027)，但与NIU组比较有显着性差异。IL-12p40和IL-26水平在三组间差异无显着性(P>0.05)。IL-2、IL-12 p70、IL-19、IL-28A/IFN-λ2、IL-29/IFN-λ1水平均在检测限(未显示数据)。

玻璃体IL-35水平升高可能是VRL患者预后的因素之一

对17例随访5年以上的B细胞VRL患者，5年生存率为58.8%(10/17)。1)。我们评估OS与玻璃体调节细胞因子水平及sIL-2Rα、CD3密度的关系。+VRL患者玻璃体体液、年龄和性别中的细胞。首先，将22例VRL患者分为“低”组和“高”组，根据上述参数是低于还是高于中位数，将其分为低组和高组。在这些因素中，高IL-35组的OS率低于低IL-35组(无显着性意义)。P=0.070，图1。2IL-35在VRL患者中的中位数为130.0 pg/mL。高IL-35组和低IL-35组5年OS率分别为28.6%(2/7)和80.0%(2/10)。

17例B细胞玻璃体视网膜淋巴瘤患者的生存曲线。

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高白细胞介素35组(≥130.0 pg/mL，红线10例)和低IL 35组(<130.0 pg/mL，蓝线12例)B细胞玻璃体视网膜淋巴瘤患者的Kaplan-Meier曲线(P<0.05)。P=0.070，对数秩检验)。P值<0.05者为显着性。

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然后，我们检查原发性玻璃体视网膜淋巴瘤(PVRL)和VRCNS病变(VRCNSL)患者的OS或无进展生存率(PFS)是否与中位IL-35水平相关。高IL-35组的OS率明显低于低IL-35组(P=0.024，图1。3在PVRL和VRCNSL患者中IL-35水平中位数为132.8 pg/mL.高IL-35组和低IL-35组5年OS率分别为40.0%(2/5)和83.3%(5/6)。此外，高IL-35组的PFS率低于低IL-35组(无显着性，P=0.068，图1。3b)。高IL-35组5例，低IL-35组6例，其中4例采用HD-MTX化疗和/或WBRT预防CNS，或接受CNS病变治疗。每组1例，均因年龄大、病情一般，单独应用四甲氧氨甲氧西林(IV-MTX)治疗。Pvrl和vrcsl患者的OS和pfs率与其他调节性细胞因子sIL-2Rα、CD3的密度均无显著相关性。+细胞、年龄和性别(数据未显示)。

(a)总体生存的Kaplan-Meier曲线(OS)和(b高白细胞介素35组(≥132.8 pg/mL，红线5例)和低IL 35组(<132.8 pg/mL，蓝线6例)无进展生存期(P<132.8 pg/mL)。POS=0.024；P=0.068为pfs，对数秩检验)。P值<0.05者为显着性。

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IL-35和sIL-2Rα水平与CD3浓度的相关性+VRL患者玻璃体细胞

有几项研究报道，IL-35是TIL在TME中分泌的。16,24,25,26。我们以前曾报道过，CD3的密度之间存在统计学上的显著正相关。+玻璃体切除细胞块细胞和玻璃体内sIL-2Rα水平。27因此，我们检测了玻璃体中IL-35和sIL-2Rα水平是否与CD3的密度有关。+VRL患者玻璃体切除细胞块中的细胞(n=16)。CD3密度呈显著正相关。+白细胞介素-35(IL-35)和sIL-2Rα水平在VRL患者中的表达(r=0.7148，r=0.7148，P<0.01)。P=0.0013；r=0.5519P=0.022；Spearman相关系数：图1。4A、B)。

玻璃体内IL-35或sIL-2Rα浓度与B细胞性玻璃体切除术后T细胞密度的正相关。(A)IL-35及(BSIL-2Rα(n=16)，r表示Spearman相关系数.P值<0.05者为显着性。

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在本研究中，我们确定了B细胞VRL和NIU患者之间调节细胞因子的差异谱。玻璃体体液调节细胞因子谱显示，VRL组IL-10和IL-22水平高于NIU组和对照组，IL-35和sIL-2Rα水平高于对照组，IL-27水平高于对照组。在我们分析调节性细胞因子与临床参数，较高水平的IL-35是一个不良的结果在玻璃体体液在B细胞VRL的最初诊断。此外，IL-35和sIL-2Rα水平与CD3的密度呈正相关。+B细胞VRL玻璃体体液中的细胞。

虽然在本研究中，以HDMTX为基础的全身化疗和/或WBRT对中枢神经系统或中枢神经系统病变的治疗是有效的或导致完全缓解(CR)，但治疗的效果是有限的，而不是持久的。最近，一种抗pd-1药物nivolumab被报道用于维持复发/难治性pcnsl患者的CR。28...Pd-1在活化的T细胞(如细胞毒性T淋巴细胞)上表达，与其配体pd-L1和pd-L2相互作用，这些配体通常由肿瘤细胞表达，从而增强了CTL中T细胞受体的抑制信号。29,30。IL-35可直接上调Tregs和骨髓源性抑制细胞(MdSCs)上pd-1受体的表达，通过促进TIL的抑制功能和T细胞耗竭而减弱T细胞介导的抗肿瘤免疫。16。提示针对PD-1或PD-L1的免疫检查点抑制剂对PVRL患者或复发或难治性DLBCL-VRL患者在最初诊断时玻璃体液中IL-35水平较高时预防中枢神经系统是有效的。此外，阻断IL-35是改善复发性或难治性DLBCL-VRL患者预后的重要指标之一。

IL-35不仅由Treg分泌，而且由B细胞、单核细胞、内皮细胞和平滑肌细胞分泌较少。25。IL-35能激活Tregs，将天真的T细胞转化为产生IL-35的诱导Treg细胞(iTr35细胞)，这些细胞在TME中积累，并具有较强的抑制活性。31。萨万特等人表明Treg衍生的IL-10和IL-35通过调节CD8中多种抑制性受体的表达和T细胞耗竭而共同限制抗肿瘤免疫反应。+-TIL24。对乳腺癌标本的组织学分析表明，TILs中IL-35的高水平与晚期癌症的分期密切相关，导致pfs和OS水平下降。32。此外，在结直肠癌患者中，IL-35的表达与肿瘤的严重程度、肿瘤的临床分期、外周血Foxp 3的数量有关。+-Tregs33。此外，IL-35的表达被定义为复发的独立预后因子，并与CD 39呈正相关。+Foxp 3+-TIL在肝细胞癌中的浸润34。因此，这些报道和我们自己的结果表明TIL中的Tregs是IL-35的主要来源，IL-35参与了B细胞VRL患者TME的形成和随后的肿瘤进展。此外，据报道，肿瘤来源的IL-35能促进mdSCs在tme中的积聚，促进肿瘤血管生成，并抑制ctl反应以支持肿瘤生长。19。此外，dlbcl的基因表达分析表明，在接受全身化疗的dlbcl患者中，肿瘤细胞中IL-35表达的增加与OS的恶化有关。35。因此，我们的结果表明，DLBCL-VRL细胞和Tregs可诱导较高水平的IL-35在高IL-35组而非低IL-35组中表达，从而抑制抗肿瘤反应。此外，IL-10和IL-35通过诱导抑制性受体(包括pd-1)和T细胞耗竭CD8，增强了抗肿瘤免疫的协同作用。+肿瘤细胞一旦复发，白细胞介素10在B细胞VRL中大量分泌。

据报道，IL-27在几种癌症的抗肿瘤免疫中也发挥了抑制作用。36。IL-27是一种异二聚体细胞因子，它的一个亚基EBI 3与IL-35共有。IL-27在自身免疫性疾病中具有促炎或保护作用。36。然而，IL-27能促进ctl和自然杀伤细胞进入tme，从而增强抗肿瘤免疫。36。Dlbcl的免疫组织学分析显示，IL-27的另一个亚基IL-27p28没有表达，尽管他们都过表达了作为IL-35组成部分的EBI 3和IL-35p35。35。在本研究中，IL-27水平升高，但与B细胞VRL患者的预后无关，提示IL-27可能与抑制B细胞VRL的抗肿瘤免疫无关。

在此之前，我们已经证明sIL-2Rα水平预测了rvl中T细胞浸润到神经视网膜和/或视网膜下引起的组织破坏事件。27。在本研究中，我们发现sIL-2Rα水平与VRL患者的OS和PFS不相关。然而，有几项研究报道，血清sIL-2Rα水平对系统性dlbcl预后不利。37,38,39,40。SIL-2Rα和IL-2复合物促进IL-2依赖性Tregs的发育和功能，抑制CD8。+T细胞支持B细胞淋巴瘤生长41。最近，Yoshida等人。提示血清sIL-2Rα水平依赖于肿瘤相关巨噬细胞(TAM)向tME的浸润；tam-衍生的基质金属蛋白酶-9在结外dlbcl和滤泡淋巴瘤T细胞上的IL-2Rα的切割中起着关键作用。42。TAM在TME内积累，促进肿瘤的发展、侵袭和转移。43。总的来说，我们的数据与这些研究相一致，表明sIL-2Rα水平与TAM和CD3的浸润有关。+在VRL中，T细胞进入神经视网膜和/或视网膜下促进肿瘤侵袭，而不是抑制抗肿瘤免疫的Tregs。

Th22细胞与包括B细胞NHL在内的多种癌症的发生和发展有关。Th22细胞是新定义的T辅助细胞亚群，是IL-22和TNF-α的来源。44。最近发现，IL-22通过IL-22受体A1的异常表达促进多发性骨髓瘤和外套细胞淋巴瘤的肿瘤生长。45,46。此外，虽然Th22细胞的增加与B细胞NHL对化疗的不良反应有关，但Th22细胞的频率与血浆IL-22水平无关，因为IL-22不仅是由Th22细胞产生的，而且还有其他各种类型的细胞，如活化的T细胞和NK细胞。44。我们对IL-10相关细胞因子的评估显示，VRL患者的IL-22水平高于NIU患者和对照组，但与VRL患者的预后无关。因此，这些结果表明IL-22水平的升高与B细胞VRL的形成有关，IL-22的来源并不局限于Th22细胞，导致IL-22水平之间没有关联，导致我们的研究结果更糟。进一步研究Th22细胞在B细胞VRL发病机制中的作用是必要的。

本研究存在一定的局限性。首先，由于这是一个单一的中心回顾性研究，注册信息，病人数量，和变量评估无法事先设计。选择的偏见可能已经发生。其次，由于样本不足，样本规模小。更大样本的多中心研究可能需要澄清IL-35水平是否与VRL的预后有关。

通过对VRL患者玻璃体标本的多重珠分析，发现IL-35可能抑制VRL的抗肿瘤免疫，促进VRL的肿瘤生长，导致VRL患者预后不良。免疫介质的潜在靶向性，如免疫检查点抑制剂和中和IL-35，需要进一步的研究，以制定新的诊断和治疗策略。

病人

这项研究是根据“赫尔辛基宣言”的指导方针进行的，并得到九州大学临床研究机构审查委员会的批准。在进行任何学习程序或考试之前，我们获得了所有参与者的书面知情同意。

我们对22例免疫功能正常的VRL患者(男10例，女12例，平均年龄65.4±10.6岁)进行了检查，其中PVRL和VRL合并CNS病变(VRCNSL)11例，继发性VRL 11例(PCNSL 6例，睾丸1例，全身病变4例，CNS和睾丸除外)。我们还于2008年1月至2019年12月在九州大学医院眼科检查了24例NIU患者(男性7例，女性17例；平均年龄62.0±9.88岁)和20例特发性视网膜前膜(ERM)患者(男性7例，女性13例；平均年龄66.3±7.55岁)作为阴性对照。所有患者均为亚洲成年人。在最初诊断时仅限于眼睛的VRL被定义为PVRL。VRL伴CNS病变的初诊定义为VRCNSL。二级VRL被定义为svrl。VRL患者的诊断依据是用细胞学涂片或玻璃体切除术细胞阻滞技术对眼睛中的恶性淋巴细胞进行明确的鉴别。47.

排除了术前外伤、原有黄斑病变、玻璃体出血、糖尿病等可能影响玻璃体体液免疫介质的患者。

调节性细胞因子和CD3浓度的测定+细胞

用10×磷酸盐缓冲液稀释上述玻璃体上清液后，用Luminex 100(Luminex，奥斯汀，TX，美国)测定下列调节细胞因子的浓度；IL-2，IL-10，IL-12(P40)，IL-12(P70)，IL-19，IL-20，IL-22，IL-26，IL-27(P28)，IL-28A/IFN-λ2，IL-29/IFN-λ1，IL-35。从标准曲线中获得调节细胞因子水平和sIL-2Rα。当浓度低于检测限值时，它们被编码为零，并包括在统计分析中。

在研究调节性细胞因子与CD3浓度的相关性时+细胞，我们使用我们之前报告的数据来计算CD3的密度。+细胞27.

统计分析

数据用跳跃软件14(SAS业务单元，CARY，NC)进行分析。如果数据分布正常且分布均匀，则采用单因素方差分析(ANOVA)比较各组间各细胞因子的玻璃体浓度，然后进行土耳其-克莱默试验，以检测VRL、NIU和对照组之间的显着性差异。如果数据分布不正常或不均匀，则用Kruskal-Wallis试验比较各调节细胞因子和sIL-2Rα的玻璃体水平，然后用Steel-Dwass试验检测三组间的显着性差异。用Mann-Whitney方法对数值变量进行了两组比较。U 测试一下。OS测定从VRL确诊时起至任何原因死亡。用DLBCL法测定从VRL确诊到复发或死亡的PFS。根据调节性细胞因子和sIL-2Rα的中位玻璃体水平，将VRL患者分为两组。用Kaplan-Meier法计算各玻璃体调节细胞因子水平的存活曲线和sIL-2Rα(CD3的密度)。+用对数秩检验评价玻璃体腔细胞、年龄、性别及曲线之间的差异。为确定T细胞密度与IL-35或sIL-2Rα水平的相关性，采用Spearman相关检验。P其值<0.05，差异有显着性(P<0.05)。