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树突状细胞上的pd-l1可减弱T细胞的活化，调节免疫检查点阻滞的反应。

二维码

发表时间：2020-09-25 11:02作者：武汉新启迪Xinqidibio

摘要

免疫检查点阻断疗法在多种癌症中显示出临床应用前景，但肿瘤浸润性T细胞如何被激活尚不清楚。本研究探讨了PD-L1在树突状细胞(DC)中的作用。树突状细胞在树突状细胞中高表达Pd-L1。我们观察到DC上的PD-L1在限制T细胞反应中起着至关重要的作用。1型常规DC对Pd-L1的阻断是必需的，在摄取抗原时会上调Pd-L1的表达.Pd-L1在DC上的上调是由Ⅱ型干扰素介导的。DC是肿瘤抗原交叉提呈T细胞的主要抗原提呈细胞，而随后的PD-L1上调则保护其免受细胞毒性T淋巴细胞的杀伤，但抑制了抗肿瘤反应。阻断已建立的肿瘤中的PD-L1促进肿瘤浸润T细胞的再激活，以控制肿瘤。我们的研究确定了PD-L1在DC中的关键和动态作用，需要利用它来更好地增强抗肿瘤免疫反应。

导言

抗原呈递是有效的抗肿瘤免疫应答的动态事件。1。在此过程中，抗原提呈细胞捕获肿瘤抗原并将其呈现给T细胞，导致它们的启动、激活和可能的再激活。2。传统的树突状细胞(CDCS)是最有效的APC细胞，由两个功能特殊的子集组成。1型cdc 1(Cdc 1)交叉表达肿瘤抗原与CD8。+T细胞3,4。相比之下，cdc 2主要与cd4有关。+辅助T细胞反应。一般来说，人们认为DC通过介导T细胞的启动和激活而在抗肿瘤免疫反应中起核心作用。5,6,7。有趣的是，随着肿瘤的进展，DC可能从免疫刺激变为免疫抑制。8,9,10。但是，调解这种过渡的机制仍然不清楚。

近年来，pd-1/pd-l1阻断治疗是一种很有前途的治疗癌症的新方法。11,12,13,14,15。针对pd-L1的抗体能够在各种癌症患者中产生持久的临床反应。在肿瘤微环境中，pd-l1高表达于肿瘤细胞和免疫细胞，如dc、巨噬细胞、髓源性抑制细胞(Mdscs)和胸腺细胞。16。然而，PD-L1在这些细胞上的相对贡献仍不完全清楚。肿瘤细胞上的pd-L1被广泛用作检查点阻断治疗的生物标志物。检测pd-l1在肿瘤细胞上的表达已被美国食品和药物管理局批准作为pd-1/pd-l1阻断治疗的辅助诊断，以确定患者是否能从治疗中获益。17。然而，几乎一半的肿瘤pd-l1阳性患者没有反应，而部分pd-l1阴性的肿瘤细胞仍能对pd-l1阻滞反应，提示pd-1/pd-l1信号转导抑制免疫应答的工作模式可能要复杂得多。18。我们和其他人已经证明，至少在某些肿瘤模型中，pd-l1在免疫细胞上起着更重要的作用。19,20,21,22,23,24,25,26,27。在目前的研究中，我们寻求进一步探讨PD-1/PD-L1信号在宿主抗肿瘤免疫反应中的作用。我们发现肿瘤浸润的DC表达高水平的PD-L1，这在限制抗肿瘤免疫反应中起着至关重要的作用。在缺乏PD-L1对DC的小鼠模型中，PD-L1阻断的治疗作用完全消失。在抗原提呈过程中，DC上的PD-L1被上调，以保护DC免受活化T细胞的细胞毒性。然而，这种作用也抑制了抗肿瘤免疫反应。这些结果为免疫检查点阻断治疗的机制提供了新的见解。

结果

DC上的pd-l1对检查点阻断治疗是必不可少的。

Pd-L1在炎症反应过程中可在多种细胞中表达。我们先前的研究表明，阻断髓系细胞pd-l1对检查点阻断治疗的反应非常重要。19。为了进一步确定哪些细胞是必需的，我们用流式细胞术分析了肿瘤微环境中不同类型细胞中PD-L1的表达水平。PD-L1在DC上的表达高于其他细胞(图1)。1A)。为了明确pd-l1在dc中的作用，我们制备了pd-l1条件基因敲除小鼠。(无花果。1B和补充图。1A)。用CD11c-cre杂交，在DC上特异地敲除PD-L1。流式细胞仪检测显示dcs(Cd11c)中pd-l1的表达完全缺失。+MHC II+)，但在其他细胞上却没有(图中所示)。1C)。PD-L1缺乏并不影响DC的发育，因为在条件敲除小鼠的脾脏和淋巴结(LN)中发现了类似数量的细胞(补充图)。1B–f)。为检测PD-L1对DC的物理贡献，将野生型MC 38细胞接种于CD11c-cre细胞中；PDL 1fl/fl老鼠。与对照组相比，条件基因敲除小鼠的肿瘤生长较慢。1D)。具体来说，肿瘤的大小是600毫米3对照组小鼠接种后29天，大小约为300 mm。3Dc-条件PD-L1基因敲除小鼠。Pd-L1在肿瘤细胞中的表达无显着性差异(图二)。1E)。这些数据表明PD-L1对DC具有重要的抗肿瘤免疫应答作用。为检测小鼠对肿瘤的自发免疫反应，对MC 38荷瘤小鼠的组织进行了分离和分析。条件性敲除小鼠T细胞浸润略有增加(附图)。2A)。CD8的总数也有一定的增加。+DC上不存在PD-L1的T细胞活化(附图)。2B，c)。接下来，我们试图评估抗原特异性反应。为了检测内源性抗肿瘤免疫反应，我们用OVA表达的E.G7细胞对小鼠进行了攻击.用四聚体染色法计数OT-1特异性T细胞.更多的OT-1-特异性CD8+在DC-条件基因敲除小鼠中观察到T细胞。1F)。为了进一步研究DC的功能，我们以表达SIY的MC 38肿瘤作为模型抗原对小鼠进行了攻击。肿瘤建立后，从引流的LNS(DLN)中分离出DC，与天真的2 C T细胞共同孵育。在缺乏PD-L1的情况下，DC在启动T细胞方面更有效(如图所示)。1g)。提示DC上的PD-L1在T细胞活化过程中起重要作用。

虽然大多数临床试验侧重于pd-L1在肿瘤细胞上的表达，但由于缺乏证实性结果，Pd-L1抑制细胞毒性T淋巴细胞的细胞机制尚未明确。为了评价pd-L1对DC的免疫治疗作用，我们用IgG或抗PD-L1抗体治疗了荷瘤条件性基因敲除小鼠。引人注目的是，DC条件PD-L1基因敲除小鼠的MC 38肿瘤对PD-L1阻断治疗完全没有反应。2A)。另一种肿瘤模型，E.G7，对抗PD-L1也没有反应(补充图)。3A)。DC在T细胞活化中的中心作用是它们呈现肿瘤抗原和介导T细胞交叉启动的能力。3。传统的DC由两种功能不同的群体组成，即cDC 1和cDC 2。据报道，Batf 3缺乏的小鼠不能产生cDC1s，而cDC1s对抗原交叉表达非常重要。因此，我们挑战Batf 3−/−肿瘤小鼠，抗PD-L1治疗。虽然pd-l1阻断治疗对WT小鼠的肿瘤生长有有效的控制作用，但同样的方法不能有效地控制肿瘤的生长。Batf 3−/−老鼠(图1.2B)。与其在CD8中的深刻作用相一致+T细胞启动，CD8的数量有限。+肿瘤微环境内T细胞Batf 3−/−小鼠(附图)3B)。总的来说，这些数据表明PD-L1在DC(可能是cDC1s)对PD-L1阻断治疗的反应中起着关键作用。此外，DC介导的抗原交叉表达是通过检查点阻断治疗来优化肿瘤控制的关键.

IFN-γ和T细胞对DC的pd-L1表达上调

由于我们的数据表明DC对检查点阻断治疗的反应至关重要，我们用流式细胞术测定了cDC 1和cDC 2上的PD-L1(补充图)。3C)。在天真的小鼠中，cDC 1在脾脏和LN中都表达低水平的pd-L1(如图所示)。3A，b)。在MC 38荷瘤小鼠中，cDC 1显著上调DLN中PD-L1的表达(图1)。3B和补充图。三维空间)。此外，肿瘤微环境中cDC 1的表达变化最大。相反，大多数cDC 2表达较高水平的PD-L1，在肿瘤攻击后进一步上调。3B)。在E.G7模型中也观察到了类似的结果(附图)。3E)。众所周知，ft3-L诱导骨髓培养可以在体内产生cdc。28(补充图。4)。FLT 3-L诱导骨髓来源DC(BMDC)低水平表达PD-L1(图1).3C)。这些数据表明，cDC 1上的pd-L1处于动态调节状态。Pd-L1的表达可被炎性细胞因子，特别是干扰素(IFN)所上调。29。因此，我们研究了Ⅰ型或Ⅱ型IFN信号是否参与了DC上PD-L1的上调。在体外系统中，I型和II型IFNs都能显著提高BMDC中Pd-L1的表达(图1)。三维空间)。在分离的原发性CDCs中也观察到了类似的效应(图1)。3E)。为了评估IFN在体内的作用，I型或II型IFN信号被中和抗体阻断。在没有IFN-γ的情况下，PD-L1的上调明显降低，而阻断Ⅰ型IFN信号的作用有限(图1)。3F)。自CD8以来+T细胞是抗肿瘤免疫的关键细胞之一，是干扰素-γ的主要来源之一，我们不知道干扰素-γ是否是由CD8产生的。+T细胞如预期的那样，CD8的耗尽+T细胞将PD-L1的表达降低到与阻断IFN-γ相似的水平。3F)。为了在体外重述这些作用，在抗干扰素-γ的中和抗体存在的情况下，DC与活化的T细胞共培养。在没有IFN-γ的情况下，PD-L1的上调明显降低(图1)。第三代)。总之，我们发现cdcs上的pd-l1被Ⅱ型IFN和CD8上调。+T细胞对肿瘤的攻击。

Pd-L1在1型DC的抗原摄取中被上调。

DCS在T细胞启动中起着核心作用。具体来说，cdc 1是将肿瘤抗原从肿瘤组织转移到LNS以进行T细胞交叉启动的主要抗原。30。为了观察体内抗原摄取情况，我们将表达EGFP的MC 38-EGFP细胞作为报告性肿瘤抗原接种小鼠。部分cDC1s在肿瘤组织和引流LN中EGFP阳性(见图)。4A)。与之相反，cDC2s在肿瘤组织中占据抗原，而在DLN中则发现NO/少量EGFP阳性的cDC2s。为了了解pd-L1的表达与抗原提呈之间的关系，我们测定了抗原摄取后DC亚群中Pd-L1的水平。有趣的是，EGFP阳性的cDC1s显示Pd-L1在引流性LN中的表达水平最高(如图所示)。4B)。在肿瘤组织中，与EGFP阴性的cDC1s相比，EGFP阳性的cDC1s表现出更高的pd-L1表达。4C)。CDC2s无显着性差异，提示调节PD-L1在这些细胞中表达的机制可能不同。体外产生的BMDC能够摄取抗原(如图所示)。4D)。然而，pd-L1在抗原摄取后的表达差异较小(如图所示)。4E)。这些结果表明，PD-L1在DC中的上调是由体内其他细胞/细胞因子的刺激介导的。为了确定关键因素，我们用抗体中和了Ⅰ型或Ⅱ型干扰素。有趣的是，即使抗体阻断不影响抗原摄取，在没有II型干扰素的情况下，EGFP阳性的cDC1s上的pd-L1明显减少。4F，g)。CD8耗竭+T细胞表现出类似的作用(图)。4G)。而EGFP阴性cDC1s对PD-L1水平的降低较轻。这些数据表明，IFN-γ和T细胞摄取抗原后，pd-L1在cDC1s上的表达上调。

PD-L1阻断剂激活肿瘤浸润性T细胞

PD-L1阻断可通过增强引流LN的幼稚T细胞启动，或通过激活肿瘤组织中功能失调的T细胞发挥作用。为了探讨更重要的机制，我们利用FTY 720阻断T细胞向肿瘤组织的浸润。FTY 720是1-磷酸鞘氨醇(S1P)的小分子类似物.FTY 720处理诱导S1P受体内化和降解，从而防止淋巴细胞从LNS中流出。31。如果T细胞在早期被阻断，如肿瘤接种后的第8天，PD-L1阻断治疗无效(见图)。5A)。有趣的是，如果在肿瘤建立较晚的时间点应用FTY 720，阻断T细胞浸润对抗PD-L1的治疗效果没有显著影响(图1)。5B)。为了验证FTY 720治疗的效果，我们测定了外周血和肿瘤组织中的T细胞水平。大多数T细胞在FTY 720治疗后立即从外周血中消失(附图)。5A)。肿瘤浸润T细胞的数量也减少了(补充图)。5B)。Pd-l1阻断治疗显著增加活化(IFN-γ)的数量。+)CD8+肿瘤内T细胞。5C)。当T细胞浸润在早期被抑制时，干扰素-γ的数量减少。+T细胞明显下降。相比之下，干扰素-γ水平没有差异。+T细胞，如果FTY 720是在一个较晚的时间点应用(如图所示)。5C)。综上所述，这些数据提示肿瘤的抗肿瘤作用主要依赖于早期肿瘤LN中新激活的T细胞。然而，随着肿瘤的进展，足够的T细胞停留在肿瘤组织中，但它们会变得更加功能失调。抗肿瘤作用更多地取决于肿瘤内T细胞的活化。

在正常情况下，pd-L1的表达通过阻止细胞毒性T淋巴细胞的非特异性活化或杀伤，保护宿主免受自身免疫性疾病的侵袭。32。因此，我们想知道PD-L1对DC的物理作用是什么。用活/死染料染色测定DC存活情况。有趣的是，在没有PD-L1的情况下，DC的存活率更差。5D)。干扰素-γ的作用之一是诱导细胞毒性.Pd-l1信号通路可以保护肿瘤细胞免受这种细胞病变的影响。33。我们观察到干扰素-γ能够降低肿瘤和树突状细胞的活力。5E)。然而，这些效应不能通过阻断PD-L1来挽救。由于DC在抗原提呈过程中与T细胞密切接触，我们怀疑Pd-L1的表达能否保护其免受活化T细胞的杀伤作用。为了在体外重述这种杀伤作用，我们从条件性敲除小鼠中分离出含有OT--1肽的DC，并与活化的OT-1 T细胞共同孵育。PD-L1缺失的cDC1s和cDC2s更易被OT-1 T细胞杀伤(图1)。5F)。细胞毒性是接触依赖的，因为它在跨井试验中被消除了(补充图)。6)。这些数据表明，DC上调了PD-L1的表达，以保护自己免受细胞毒性T淋巴细胞的杀伤，而T淋巴细胞对肿瘤的免疫反应也受到抑制。阻断DC上的PD-L1信号是最佳抗肿瘤免疫反应的关键。

讨论

PD-L1在正常情况下的表达受到限制。然而，在许多细胞的炎症过程中，它可能被上调。34。由于缺乏合适的动物模型，pd-l1对肿瘤以外的细胞的作用尚不清楚。35。早期研究表明pd-l1可在患者来源的髓系DC上检测到。36。但其在体内的功能尚未确定。在目前的研究中，我们试图通过使用cdc 1缺陷小鼠和产生DC条件PD-L1基因敲除小鼠来探讨这些问题。我们观察到PD-L1阻断治疗对DC条件基因敲除小鼠的治疗作用完全消失，尽管其他细胞仍表达高水平的pd-L1。具体来说，cdc 1对于CD8的启动和激活特别重要。+T细胞，上调pd-L1在抗原摄取上的表达。与最近的一项研究相一致，我们发现dc上的pd-l1可以保护他们免受细胞毒性T淋巴细胞的杀伤，但却抑制了抗肿瘤免疫反应。37。此外，活化T细胞产生的IFN-γ介导pd-L1对cDC1s的上调。这种信号形成负反馈来控制T细胞(再)的激活。一贯地，缺乏cdc 1大大减少了肿瘤浸润淋巴细胞的数量。因此，cDC1s上的pd-L1有可能阻止肿瘤浸润淋巴细胞的过度扩张，保护主要的APC免受活化或再激活的T细胞的杀伤。

除PD-1外，Pd-L1还能与另一受体CD 80结合.一个有趣的事实是，包括dc在内的apc可能同时表达pd-1、pd-l1和cd 80。38。此外，pd-l1能够与cis中的pd-1和cd 80相互作用，这使得工作模型更加复杂。38,39,40,41,42。在体外系统中，pd-l1上大量表达的CD 80能中和pd-l1，从而阻止pd-1参与抑制T细胞活化。40。然而，对患者标本的分析表明，pd-l1在dc上的表达量远高于cd80。43。因此，在大多数情况下，DC上的PD-L1有可能抑制T细胞的活化。事实上，阻断人DC上的pd-l1可以增强他们的T细胞启动能力。36,43。然而，哪些类型的发展中国家对这些影响尚不清楚。有趣的是，通过利用单细胞测序分析非小细胞肺癌样本，Maier等人。鉴定出一组在免疫调节分子中富集的DC44。与我们的数据一致，他们发现DC上的PD-L1在摄取肿瘤抗原后被上调。然而，dc子集与规范cdcs不同。44。这些差异可能是不同的细胞/肿瘤模型和实验设置的结果。在本研究中，我们采用DC-条件PD-L1基因敲除小鼠模型和肿瘤模型对PD-L1阻断治疗作出反应。我们鉴定了PD-L1对DC在T细胞活化和免疫检查点阻断治疗中的重要和动态作用。这些功能和机制的研究将为检查点阻断治疗的机制提供新的见解。

在有效的抗肿瘤免疫应答过程中，APC摄取肿瘤抗原并将抗原呈递到T细胞，导致T细胞活化以破坏肿瘤。45。在已建立的肿瘤微环境中，大多数浸润的T细胞功能失调46。Pd-1/pd-L1阻断疗法是通过招募新激活的T细胞还是通过重新激活肿瘤常驻T细胞而起作用，目前仍在讨论中。35,47。临床研究的结论仍有争议。48。结果表明，大多数肿瘤特异性T细胞克隆经抗pd-1治疗后，与已有的肿瘤浸润性T细胞在基底细胞或鳞状细胞癌中存在差异。49。另一项研究发现，功能失调的肿瘤浸润性T细胞对抗pd-1治疗黑色素瘤患者的反应是有效的。50。在动物模型中，T细胞启动对检查点阻断治疗是必不可少的，因为肿瘤接种后早期手术切除LN消除了治疗效果。51,52。一致地，我们发现阻止新激活的T细胞进入肿瘤是大多数早期肿瘤的抗肿瘤作用。然而，培养的癌细胞在开始的几天内会引起大量的凋亡和抗原释放。这一过程可能会导致LN中T细胞的人工启动。53。因此，我们在晚期肿瘤中也做了同样的治疗，在那里大部分的启动事件都消失了。我们发现大多数的抗肿瘤作用依赖于肿瘤浸润的T细胞。我们的研究为临床上有争议的观察提供了一个潜在的解释。在肿瘤细胞大量死亡或免疫原性强的患者中，PD-1/PD-L1阻断治疗可能依赖于新激活和再激活的T细胞。相反，对于抗原释放较少或功能T细胞较少的患者，治疗效果更多地依赖于原有T细胞的重新激活。然而，我们的研究强调了PD-L1在DC上抑制T细胞活化的重要作用，这需要利用它来更好地增强抗肿瘤免疫反应。

方法

小鼠

野生型C57BL/6小鼠购自生命河(北京，中国)。Batf 3−/−CD11c-cre小鼠从杰克逊实验室购买。PDL 1fl/fl小鼠在动物的核心产生。所有小鼠在特定的无病原体条件下维持在22~26°C，12：12小时黑暗/光循环和40-70%的湿度。野生型雌性小鼠6~8周龄.对于基因修饰小鼠，每个实验采用年龄和性别相匹配的小鼠。雌鼠和雄鼠均在6-12周龄时使用.

细胞系和试剂

MC 38、E.G7、B16F10和293 T细胞来源于美国型培养。细胞在5%CO中培养2在DMEM(MC 38、B16F10和293 T)或RPMI-1640(E.G7)培养基中添加10%胎牛血清(FBS)、非必需氨基酸、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。将重组小鼠IFN-α作为Fc融合蛋白在293 T细胞中表达，并用蛋白A柱进行纯化。

MC 38-EGFP、MC 38-OVA和MC38-SIY细胞系的产生

共转染293 T细胞3种质粒(pSIN-EGFP-puro、psPAX 2和pMD2.G)，产生编码EGFP的慢病毒。48小时后，用0.45μm滤膜过滤慢病毒.用慢病毒转染野生型MC 38细胞。转染2d后，用5g/ml普罗霉素处理细胞，直至出现耐药克隆。用有限稀释法筛选出表达MC 38细胞的单个克隆(MC38-EGFP).流式细胞仪检测EGFP的表达。MC38-OVA和MC38-SIY细胞的产生也是相似的.

流式细胞术分析

细胞在室温下被抗CD 16/32(克隆2.4G2)阻断20 min。用抗体孵育细胞30 min。洗涤后，用CytExpert软件(贝克曼库尔特)在CytoFLEX S(贝克曼库尔特)流式细胞仪上采集样品。数据用Flowjo软件(TreeStar)进行分析。

肿瘤生长与治疗

小鼠右侧皮下注射MC 38或E.G7细胞。当肿瘤达到一定的大小时，将小鼠随机分为两组，并在腹腔内进行治疗(I.P.)用IgG或抗Pd-L1在指示日。每周测量两次肿瘤体积，计算为(长×宽×高/2)。为抑制淋巴细胞的迁移，小鼠经腹腔注射。肿瘤接种后第8、14天加入50μg FTY 720。第一次注射后，给予10微克FTY 720。每天保持抑制。抗体阻断实验用2 0 0μg IgG、10 0μg抗IFNAR 1、2 0 0μg抗IFN-γ或2 0 0μg抗CD8 I.第0天、第3天、第7天和第11天。

组织细胞分离

将组织切成小块，在RPMI-1640培养基中加入1mg/ml IV型胶原酶和100μg/ml DNase I消化后，经70μm细胞过滤器制成单细胞悬液。

T细胞体外刺激

脾CD8+用EasySep小鼠CD8分离T细胞+T细胞分离试剂盒，按标准方案用5μg/ml抗CD3和2μg/ml抗CD 28(可溶性)刺激。刺激后48小时，取T细胞进行功能测定.用FACS或EasySep小鼠CD11c阳性选择试剂盒Ⅱ按厂家指示纯化DCS。用10μg/ml抗IFN-γ与活化T细胞共培养24h。流式细胞术检测DC上PD-L1水平。

体外T细胞杀伤试验

纯化的OT-1 T细胞经抗CD3和抗CD 28激活48h，用5μg/ml OT-1肽在37℃下负载30 min，洗涤后与活化的OT-1 T细胞共孵育4h，E：t比为3，流式细胞仪检测细胞死亡情况。

酶联免疫吸附斑点法(ELISPOT)

从MC 38荷瘤小鼠中分离出脾或引流LN。制备单细胞悬液。细胞(4×10)5在T细胞启动试验中，纯化DC(1×10)。4来源于MC38-SIY荷瘤小鼠的LN，与单纯T细胞(1×10)共培养。5)从含或不含5μg/ml SIY肽的2 C小鼠中纯化48 h，ELISPOT试验按厂家的指示用IFN-γELISPOT试剂盒(BD生物科学)进行。斑点用免疫斑点分析仪(CTL)计数。

BMDC或原代DC的体外培养

取WT小鼠骨髓细胞。细胞在含10%FBS和55μmol/L巯基乙醇的RPMI-1640培养基中进行10 cm培养皿培养。每3天加入FLT 3-L(150 ng/ml)。于第9天取BMDC，以3：1的比例与照射后的MC 38-EGFP细胞共培养24h，流式细胞仪检测EGFP信号。在干扰素刺激试验中，用5 0 0ng/ml IFN-α或5 0 0ng/ml IFN-γ处理BMDC或纯化DC 24 h，选择IFN-L1浓度，诱导MC 38细胞Pd-L1表达。流式细胞仪检测PD-L1水平。

MTT法

细胞接种于96孔板中，用10 ng/ml小鼠IFN-γ(和10μg/ml抗pd-l1)处理96h。33。MTT法按制造商的指示进行。在37°C条件下，细胞在0.5mg/ml的MTT溶液中孵育5h，用150μl二甲基亚甲基偶氮唑盐溶液溶解MTT晶体，并在平板阅读器上测定吸光度。将细胞活力归一化为模拟处理细胞。

统计分析

数据显示为平均值±扫描电镜。用未配对学生的双尾法比较两组间的差异t测试一下。肿瘤生长曲线采用双向方差分析和土耳其的多重比较检验。一个p值<0.05被认为具有统计学意义。用GraphPad棱镜软件(GraphPad)进行统计分析。用Excel(Microsoft)记录和计算肿瘤大小。DNA凝胶图像由图像实验室(Bio-Rad)获取.