血清蛋白可促进川崎病的鉴别，促进体外中性粒细胞浸润。

川崎病(Kawasaki disease，KD)通常影响5岁以下儿童，导致冠状动脉病变(CALS)，不能及时诊断和治疗。建立一种稳健、快速的川崎病预测方法，可促进KD的及时诊断，显著降低KD患者发生CALS的风险。炎症性血清蛋白的水平在许多免疫疾病的发病过程中变化很大，包括KD。然而，我们对它们在KD中的致病作用的理解落后于满意度。本研究的目的是用iTRAQ无凝胶蛋白质组学评价诊断性血清蛋白在KD诊断中的潜在机制。我们招募了受试者，并进行了iTRAQ无凝胶蛋白质组学研究，对血清蛋白进行全球筛选，然后用ELISA进行特异性验证。进一步应用体外白细胞反式内皮模型，探讨炎症血清蛋白的发病机制。我们鉴定了6个KD蛋白生物标志物，包括蛋白S100A8(S100A8)、蛋白S100A9(S100A9)、蛋白S100A12(S100A12)、过氧还原素-2(PRDX 2)、中性粒细胞防御素1(DEFA 1)和α-1-酸性糖蛋白1(ORM 1)。它们使我们能够开发一个高性能的KD预测模型，其auROC值为0.94，便于及时识别KD。进一步分析表明，重组S100A12蛋白处理能激活中性粒细胞表面粘附分子，参与内皮细胞的粘附。因此，S100A12能促进临床分离的中性粒细胞和中性粒细胞样细胞在体外通过内皮层浸润。最后，抗S100A12抗体可减轻S100A12诱导的细胞浸润。我们的结果表明，评估S100A8、S100A9、S100A12、PRDX 2、DEFA 1和ORM 1水平可能是诊断KD的良好工具。进一步的体外研究表明，S100A12可能是KD的潜在治疗靶点。

川崎病(Kawasaki disease，KD)是一种急性全身性血管炎，对亚洲人种有嗜好，主要发生在婴儿和5岁以下的儿童。1,2。KD易因冠状动脉病变(Cals)的发展而复杂，约15-25%的未治疗KD儿童和约5%的接受IVIG治疗的KD儿童发生这种病变。1,2。单次大剂量IVIG治疗能有效降低CALS的发生率。1,2。然而，8-38%的儿童在首次IVIG治疗后会有持续或复发的发烧，并有更多的风险发展为cals。3,4,5,6。据估计，台湾地区每年的KD发病率为67.3/10万，居世界第三位，仅次于日本和韩国。7。延迟诊断和治疗KD(特别是非典型KD)可能会导致CALS的高风险。2,6。近年来，新冠肺炎大流行已成为一个严重的公共卫生问题，严重威胁着全世界人民。8。小儿新冠肺炎感染可能与KD样多系统炎症综合征有关9，突出了研究KD与新冠肺炎关系的必要性。

KD的诊断取决于临床特点。这种多系统血管炎的特点是发热时间长、皮疹多形、非化脓性结膜注射、四肢改变、口腔粘膜改变和颈部淋巴结肿大。2。然而，这些临床表现并不客观，可能会延误KD的早期诊断和及时治疗。为了克服这一困难，许多研究致力于开发KD识别生物标志物，以便于早期识别KD的发病和/或并发症。2,10,11,12,13,14,15,16,17,18。然而，许多以前的研究都依赖于处理脆弱的RNA样本。由于其长期持久性的特点，血清蛋白也被用来鉴别KD的生物标志物.这些与血清有关的研究通常是通过筛选特定的血清蛋白来启动的，这将结果限制在少量候选蛋白上(见“讨论“详细情况)。因此，很少发现新的血清蛋白标志物。此外，由于缺乏一个良好的KD功能体外细胞模型，以往很少有研究进一步研究其所鉴定的KD生物标志物的发病机制。

相对绝对定量(ITRAq)无凝胶蛋白质组学已成为蛋白质组学研究中发现候选蛋白质生物标记物的有力工具。19,20。在本研究中，我们首先选择了健康对照者(HC，无发热健康者)，发热对照者(FC，发烧但没有KD诊断者)和KD患者。然后，我们应用iTRAQ对FC和KD患者的血清样本进行了全面筛选，以尽可能多地检测血清蛋白。随后的ELISA验证确定了KD的生物标志物，使我们能够建立一个高性能的KD预测模型。在以前的研究中使用了一种体外细胞模型21我们还研究了S100A12在KD中的致病作用。结论S100A12在体外可促进中性粒细胞通过内皮细胞浸润。这种促进作用可被S100A12抗体减弱。因此，抗S100A12抗体有可能作为一种替代疗法来加强传统的IVIG治疗。

学科招生与伦理问题

我们在台湾高雄退伍军人总医院(KVGH)儿科录取汉族受试者。这项研究由KVGH机构伦理委员会(IRB批准号VGHKS19-CT2-22)批准。所有受试者或其监护人均在知情同意书上签字。所有议定书都是按照有关准则和条例执行的。共有37名健康对照组(HC，无发热)，38名发热控制(FC，发热但未诊断为KD)和93名KD受试者参加了本研究。我们从普通病人科招收健康对照儿童。这些儿童进行了健康检查和抽血检查，如全血计数、血清生化等。其余血样经监护人批准应用于本研究。我们登记发热控制儿童(体温≥38°C)至少3天，并有明显的呼吸道感染被诊断为急性咽炎、急性支气管炎、急性扁桃体炎和急性支气管肺炎。此外，通过问卷调查和参考病历，排除了有KD、自身免疫性疾病、变态反应性疾病或心血管疾病病史的HC和FC受试者。

本研究未纳入非典型KD患者。所有KD患儿在诊断时和治疗后2，4，8，12周和6个月再次进行二维超声心动图检查，每年随访一次。在KD患者中，16例为CALS，14例为IVIG无效。为了避免药物引起的噪音，我们排除了服用类固醇治疗的病人。所有HC和FC受试者仅进行一次抽血。大部分KD患者均接受3次抽血，即给药前、给药后3天和给药后3周。

采血

在每次抽血时，所有受试者均捐献两管血(每管3毫升)，其中一根用于血清采集，另一根用于红细胞溶解收集白细胞(WBC)。采集的血清标本保存在−80°C，我们用MIVANA miRNA分离试剂盒(Ambion，CA，美国)从总白细胞中提取RNA。

ITRAq无凝胶蛋白质组学在全球范围内筛选血清蛋白

为了全面筛选血清蛋白，我们随机选择了12个年龄和性别匹配的FC和12 KD血清样本.选择的血清样品首先进行高丰度蛋白质消耗，皮尔斯前12大蛋白质消耗自旋柱(85165，Thermo)。然后，对6名受试者的血清样本进行均匀混合，得到2份FC和2份KD混合样本。然后用iTRAQ试剂多重试剂盒(4352135，Sciex)制备四份混合血清样品。经质量检验合格后，用LC/Q-ExactiveOrbitRAP MS(Thermo)对标记的血清样品进行24 h分析，用蛋白质组发现器V2.4(Thermo)参照吉祥物2.5数据库(MatrixScience)对生成的原始数据进行分析。因此，我们获得了检测到的蛋白质的相对丰度。

ELISA法测定血清蛋白浓度

在iTRAQ检测到的蛋白质中，我们选择了6份用于ELISA。S100A蛋白之所以被选中，是因为它们在我们之前的研究中参与了中性粒细胞的浸润。22。选择PRDX 2、ORM 1和DEFA 1是因为它们在两个FC和两个KD样品之间的变异是一致的。此外，这三种蛋白与氧化应激、炎症或感染有关。我们参照ELISA试剂盒制造商的说明，用ELISA法测定血清蛋白的绝对浓度。ELISA试剂盒如下：S100A8(CY-8061，MBL，日本)，S100A9(CY-8062，MBL，日本)，S100A12(CY-8058V2，MBL，日本)，DEFA1(ARG 82004，Arigo，台湾)，ORM 1(EG5001-1，AssayPro，美国)和PRDX 2(KA 4801，Abnova，台湾)。

启动子甲基化法和qPCR法

我们模拟了之前的研究，进行了启动子甲基化试验。23。PCR扩增了S100A12基因的启动子区，用限制性内切酶印地语Ⅲ进行酶切，克隆入pGL4.21荧光素酶表达载体(Promega，Madison，WI，USA)。然后利用M.SSSI甲基转移酶酶进行体外甲基化(Invitrogen，Grand Island，NY，USA)。M.SSSI识别序列模式CpG并催化体外胞嘧啶甲基化。转染后24h，用双Glo荧光素酶报告系统试剂盒(Promega，Madison，WI，USA)对293 T细胞进行荧光素酶检测。在qPCR分析中，PCR引物序列为：S100A12：正向引物(5‘-CTTACAAAGGAGTGCAAAC-3’)和反向引物(5‘-GGGTGTAATGGGCAG-3’)。18S：前引物(5‘-GTAACCCGGCATT-3’)和反向引物(5‘-CCATCCAATCGGTAGCG-3’)。

细胞培养、分离与治疗

本研究培养人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)1株(HL-60)，人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)原代培养细胞1例，新鲜分离中性粒细胞(中性粒细胞)1例。用1.3%DMSO(Sigma-Aldrich，MO，美国)诱导HL-60(60027号，BCRC，台湾)分化为中性粒细胞样细胞.Hl-60和hcac(CC-2585，Lonza，瑞士)按照先前的研究建议进行培养和维持。22。新鲜分离的中性粒细胞是从健康成人的血液中收集的，使用的是由制造商推荐的DynabeadsCD 15(11137 D，Invitrogen)。本研究用20%血清、IVIG(3740501374，TBSF)、重组S100A12蛋白(1052-ER-050，R&D)、抗S 100A12抗体(PA5-76712、Invitrogen)和/或IgG对照(UB 276978，eBioscience)处理中性粒细胞和HCAECs。根据先前的研究，IVIG在培养基中的剂量为10 mg/ml。24。S100A12、抗体和IgG对照的给药剂量均为152 ng/ml，约为川崎病患者血清S100A12平均浓度的20%(757.9 ng/ml，表)。3).

表面粘附分子强度的测定

取血清或S100A12处理24h的中性粒细胞，用PBS冲洗。流式细胞仪检测CD11a-FITC(ITGAL，565280，BD)，CD11b-FITC(ITGAM，563088，BD)，CD18-FITC(ITGB 2,743370，BD)，CD29-FITC(ITGB 1,746022，BD)，CD49d-FITC(ITGA 4,559,881，BD)或CD184-FITC(CXCR 4,555974，BD)。然后，用LSRII流式细胞仪(BD生物科学)对其进行量化和分析。我们用几何表示特定表面粘附分子的强度。

白细胞经内皮细胞迁移试验

我们参照以前的研究，用LTEM法评估中性粒细胞的浸润能力。22。为此，我们通过播种2×10制备了LTEM检测方法。5HCAECs进入明胶涂层挂片(又称上腔，默克，NJ，USA)24 h，用血清、IVIG、重组S 100A12蛋白、抗S 100A12抗体和/或IgG对照处理24 h，对刚分离的脆弱中性粒细胞只进行4小时处理。

迁移试验当天，用无血清培养基洗涤法收集处理后的中性粒细胞。然后，1×105将中性粒细胞置于插入物中，将插入物进一步转移到含有600μl培养基的24孔培养板(又称下腔)，其中含有200 nmfMLP(Sigma-Aldrich，MO，美国)作为趋化剂。迁移2小时后，收集穿内皮层的中性粒细胞，并迁移至下腔室。收集的细胞用PBS洗涤，用CD 15-FITC(340703，BD)染色，然后用LSRII流式细胞仪(BD生物科学)进行定量和分析。

道德声明

这项研究由KVGH的机构伦理委员会批准，IRB批准号为VGHKS19-CT2-22。所有受试者或其监护人均在知情同意书上签字。

学科信息

在本研究中，我们选择了健康对照组(HC)、发热对照组(FC，发烧但未诊断为KD)和KD患者。表1结果表明，三组受试者的年龄和性别差异均无显着性。所有KD受试者均符合2004年美国医学会的要求。25或JCS 2008诊断标准。

ITRAq无凝胶蛋白质组学全球筛选血清蛋白

我们最初用iTRAQ无凝胶蛋白质组学分析了两份混合FC和两份KD血清样本.结果，我们检测到372种蛋白质(补充表)。1)在这些样品中，根据两个具体参数(蛋白质组发现器V2.4的参数)：FDR用于蛋白质和肽的鉴定<0.01，蛋白质的数目与唯一的肽相匹配。≧1.然后将蛋白质丰度表输入Partek软件(版本：7.0，Https://www.partek.com/，进行变异分析(KD对FC)。如图所示。1A.我们鉴定出101个变异大于1.25倍的蛋白质.图形1其中近一半蛋白质在FC样品中丰度较高，其余一半蛋白质在KD样品中含量较高。

血清蛋白谱。(a)我们用iTRAQ无凝胶蛋白质组学测定血清蛋白质的相对强度。在这个热图中，只有101个平均变异大于1.25倍的蛋白质。(bFC和KD患者在明确诊断和治疗前抽血。在这些不同的蛋白质中，S100A8、A9和A12由于其炎症作用而被选为进一步的ELISA验证。56。DEFA 1、PRDX 2和ORM 1也包括在内，因为它们与GO函数相连(表)2)两种混合FC和两种混合KD血清样品的丰度趋势是可重复的。*、**、*和*分别表示p-值<0.001、0.01、0.001和0.0001。

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为了评价蛋白质组学结果的可靠性和推测这些不同蛋白质的可能功能，我们还进行了GO分析。表2证明10个最重要的GO项目中有7个是炎症、免疫或应激相关功能，这与KD是一种急性炎症疾病的事实是一致的。此外，KD还具有氧化应激的特点。26,27。因此，iTRAQ无凝胶蛋白质组学提供了一个值得进一步研究的可靠数据集.

ELISA特异性鉴定KD生物标志物

在蛋白质组学检测的蛋白质中，我们选择了S100A8、S100A9、S100A12、PRDX 2、ORM 1和DEFA 1对HC、FC和KD血清样品进行了ELISA检测。FC和KD患者在明确诊断和治疗前(KD急性期)抽血。蛋白质浓度的统计值列于表中。3。图形1结果表明，HC和FC之间以及FC与KD之间的蛋白质浓度差异显著。此外，6种蛋白质中有5种表现出明显的浓度梯度，从HC到FC，从FC到KD逐渐增加。然而，PRDX 2的丰度趋势与其他5种蛋白质的丰度趋势相反，从HC到FC和从FC到KD逐渐减少。总之，这六种有效的蛋白质可以作为KD的生物标记物。

基于蛋白质的KD预测模型的推导

我们进一步利用六种蛋白质生物标记物的浓度，利用一种机器学习算法，支持向量机(SVM，lib-svm Version 3.22)，推导出KD预测模型。21,28。总之，我们首先进行了十倍交叉验证，得出了最佳参数：γ=0.03125和成本=4。然后，通过指定这两个参数，我们使用所有数据点(所有样本中6个蛋白质的浓度)来训练预测模型。如图所示。2当KD集与HC、HC+FC和FC集比较时，AuROC值分别达到1.0000、0.9818和0.9368。以KD与FC模型为例，其敏感性为0.93，特异性为0.86。当使用一个独立的队列(15 KD和10 FC样本，随机从初始样本集中分离出来)进行验证时，该预测模型报告了类似的性能，灵敏度为0.93，特异性为0.90。这种模式可能有助于及时识别KD，并使儿科医生和研究人员能够提前做好准备工作。

推导出的KD预测模型的性能。我们使用一种机器学习算法--支持向量机(SVM)来推导预测模型。KD受试者被用来区分(a)HC，(b)HC+FC和(c)FC学科，导致不同的auROC值。

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蛋白质浓度随IVIG剂量的变化而变化。

迄今为止，对KD患者而言，这些KD生物标志物的浓度仅在急性时相，即IVIG给药前(IVIG前阶段)测定。我们进一步研究了IVIG治疗后3天(IVIG后)和3周(恢复期)的变化。如图所示。3IVIG给药后5种蛋白水平逐渐降低，提示IVIG对全身炎症有较好的治疗作用。虽然总体模式反映了显著下降(例如，S100A12和ORM 1)，但在许多样本中，静脉注射IVIG(IVIG后)后，几种蛋白质的浓度都增加了。我们用卡方比较下降是否与CAL形成或IVIG无反应相关。结果表明，两者之间没有显著差异。

IVIG治疗前后6种血清蛋白的变化。大部分KD患者在注射IVIG前的急性期(IVIG前阶段)、IVIG注射后3天(IVIG后阶段)和IVIG用药后3周(恢复期)进行三次酶联免疫吸附试验(ELISA)。每一行在三个阶段给出了一个受试者的三个ELISA值。样本大小为78。*和*根据配对t检验分别表示p值<0.001和0.0001。

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对于PRDX 2，IVIG给药前后的浓度变化不明显。三组蛋白质浓度的统计值亦载於表内。3。按表3S100A8、S100A9和DEFA 1的变异似乎反应过度。在恢复期(注射IVIG后3周)，S100A8、S100A9和DEAF 1的浓度下降到比HC组更低的水平，低于健康对照组(附图)。1)。由于IVIG的使用，这种下降值得进一步注意。

DNA低甲基化激活S100A12的表达

在六种被检测的血清蛋白中，我们对S100A12很感兴趣。

在炎症急性期，S100A12基因通常在中性粒细胞中高表达。29。血清s100a12蛋白在许多炎症相关疾病中也有升高的趋势。30,31。尽管S100A12在KD患者中也有升高的报道32,33它在KD发病机制中的作用尚不清楚。在我们之前的研究中22S100A12 mRNA水平在KD组高于HC组和FC组。此外，体内证据表明，在KD样品中S100A12的启动子区是低甲基化的。在本研究中，我们还检测了S100A12的mRNA水平。如图所示。4(A)KD组S100A12 mRNA水平显著高于FC组和HD组。然后，我们进一步进行了启动子甲基化检测。如图所示。4B，克隆的S100A12上游DNA片段具有启动子活性。此外，M.Sssi+处理(M.Sssi+)与非M.SssI处理(M.SssI-)相比，导致总DNA甲基化，导致荧光素酶活性下降(图1)。4c)。黄等人本研究分别为S100A12的表达受DNA甲基化调控提供了体内和体外证据。

S100A12基因表达变异及启动子甲基化分析。(a)我们用qPCR技术检测了S100A12在WBC中的相对mRNA水平。22。WBC中S100A12基因的变化趋势与血清中S100A12蛋白的变化趋势一致。数据显示为2-ΔΔCT以18S基因为内对照。(b)与空载体pGL3-S100A12相比，pGL3-S100A12具有启动子活性。(c携带S100A12启动子和荧光素酶的构建用M.SssI(完全甲基化)或未处理(非甲基化)处理，然后转染和荧光素酶检测。数据以平均±SD表示。**和*按t检验分别表示p-值<0.0 1和0.001.

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S100A12激活中性粒细胞粘附分子

在我们之前的研究中22经S100A12重组蛋白处理的中性粒细胞可促进中性粒细胞通过HCAEC层的浸润。因为白细胞和内皮细胞之间的粘附是白细胞浸润的关键步骤。34，我们检查了s100a12是否激活了锚定在白细胞表面的六个粘附分子。35。如图所示。5经S100A12处理后，CD11b(ITGAM)和CD 29(ITGB 1)的强度(用流式细胞仪测定)明显增强。CD11b和CD 29的增强差异虽有显着性，但差异很小，均小于10%。因此，我们以血清治疗代替S100A12治疗(20%KD或HC血清样本)，重复检测。图形5B显示KD血清与HC血清相比，其结果与S100A12相似。此外，川芎嗪治疗可使CD11b和CD 29增强最多17%。因此，在图中观察到的值。5A是合理的。

在白细胞表面锚定的表面粘附分子的变化。我们用流式细胞术测定白细胞表面粘附分子的强度。(a中性粒细胞用S100A12或不加S100A12处理24h后用流式细胞仪检测。(b中性粒细胞用川芎嗪血清(平均混合血清)或HC血清(均合血清样品)处理24h，然后用流式细胞仪检测。数据以平均±SD表示。*、**和*分别表示p-值<0.001、0.0 1和0.001。

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抗体抑制S100A12促进体外中性粒细胞浸润

我们先前研究的结论22是通过操纵中性粒细胞样细胞系(HL-60)制成的。我们还对一名健康成年男性志愿者捐献的新分离的中性粒细胞进行了白细胞跨内皮迁移(LTEM)检测。如图所示。6A、b、2,051和2,857个新分离的中性粒细胞分别经S100A12处理后进入内皮细胞层。通过三项独立的试验，S100A12处理显著促进新分离的中性粒细胞通过内皮层迁移1.5倍(图1.5)。6由健康男性捐献的新鲜中性粒细胞)。

对中性粒细胞进行LTEM检测。(a,b)临床新鲜分离的中性粒细胞未经S100A12处理或治疗，再经LTEM检测。与对照组相比，S100A12能使更多的中性粒细胞穿透内皮层(2,857对2,051)。(cS100A12处理能显著促进新鲜分离的中性粒细胞(由健康男性捐献)浸润并通过内皮层迁移。(dKD血清能促进中性粒细胞(细胞系)浸润约1.7倍，使我们可以通过血清治疗模拟KD病(n=3)。(e同时用对照IgG、S100A12抗体或IVIG对KD血清处理的中性粒细胞(细胞系)进行LTEM检测(n=3)。数据以平均±SD表示。*、**、*和*分别表示p-值<0.001、0.01、0.001和0.0001。

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接下来，我们研究了S100A12抗体是否能减轻S100A12促进的浸润。我们首先采用KD血清治疗来模拟KD。与S100A12类似，与HC血清相比，KD血清能显著促进中性粒细胞浸润，增加约1.7倍(图1)。6d)。当添加抗体中和KD血清中内源性S100A12蛋白时，这种促进作用减弱。6e)。此外，IVIG治疗效果与S100A12抗体相似(S100A12与IVIG无明显差异)。总之，抗S100A12抗体可抑制体外中性粒细胞浸润，与IVIG相似。

本研究采用体外LTEM模型评价中性粒细胞浸润。大多数研究集中在S100A12对中性粒细胞的影响上，认为重组S100A12蛋白和抗体分别促进和减弱了中性粒细胞的浸润。这种促进作用可能是通过激活中性粒细胞表面粘附分子，增强中性粒细胞与内皮细胞之间的粘附作用来实现的。先前的研究试图明确地界定KD的临床和流行病学特征，以便于准确地识别疾病。36,37。此外，其他研究也确定了kd的分子生物标志物，包括那些参与基因表达谱的分子生物标记物。28,38DNA甲基化39。然而，以前的RNA相关研究利用了来自白细胞的脆弱RNA样本，这需要麻烦和冗长的处理。DNA甲基化相关的研究需要长时间等待亚硫酸亚铁转化和DNA重新测序。因此，节省时间的ELISA方法更适合于鉴别KD.此外，与来自白细胞的DNA和RNA相比，血清样本易于储存和运输，增强了整个过程的适用性。

虽然以前曾提出过以蛋白质为基础的KD发病和/或并发症的生物标志物，但这些研究仍需进一步研究。他们没有利用已识别的生物标志物建立诊断或预后模型，无法预测KD的发病或并发症。40,41,42。在某些情况下，虽然建立了预测模型，但模型的性能仍然落后于满意程度。43,44,45。此外，这些研究是由监测某些特定的细胞因子或传统蛋白质组学开始的。40,41,42,43,44,45将潜在的生物标志物限制在数量有限的候选人身上。因此，我们无法确定新的生物标记物，这也是我们利用iTRAQ无凝胶蛋白质组学在全球范围内筛选所有血清蛋白的原因。

本研究是通过对受试者的登记和血液样本的分析开始的。因此，总体分析结果可能受到种族因素的影响。实际上，参与这项研究的所有受试者都是汉族人，这反映了本研究的主要局限性。随着对6个KD生物标志物进行酶联免疫吸附试验(ELISA)，我们可以得到一个更加公正和可靠的KD预测模型。本研究的另一个不足是缺乏活体动物模型的支持。S100A12基因在小鼠体内没有同源基因。在小鼠体内操纵S100A12蛋白或基因是不合理的，这一弱点似乎是不可避免的。

由于S100A12促进体外中性粒细胞浸润，这是体内CAL形成的原因，我们还观察了血清S100A12的丰度是否随CAL的形成而变化。在参与这项研究的所有KD患者中，16名患者有CALS。我们进一步比较了16例KD组与16例无CALS组与其余KD组血清S100A12水平。结果表明，两组间无显着性差异(p=0.109)，但体外细胞试验表明S100A12在CAL形成中起着重要作用。这种不一致值得今后进一步调查。

脂多糖(LPS)常用于动物模型，诱导全身炎症反应。46,47也可用于白细胞或其他细胞，以引起炎症反应或细胞损伤。48,49。然而，LPS在中性粒细胞中的应用很少。我们还用脂多糖处理中性粒细胞152 ng/ml(低剂量，作为S100A12重组蛋白)和1μg/ml(如其他研究建议的高剂量)，然后进行相同的测试，如图所示。6C.与对照组(不处理LPS)相比，无论低剂量或高剂量LPS处理，其相对LTEM能力均无明显变化。因此，LPS不适合建立体外白细胞浸润模型。

在本研究中，我们观察到S100A12抗体和IVIG在抑制体外中性粒细胞浸润方面具有相似的作用。S100A12抗体通过特异性抑制血清S100A12蛋白分子发挥作用。IVIG是kd的标准治疗方法，其最佳给药时间是在kd发病后10天内，每次2g/kg输注超过10-12小时。2。IVIG在体内和体外减少中性粒细胞浸润的机制尚不清楚。可能的机制包括Fc受体阻断、感染性物质或毒素的中和、T细胞和B细胞的调节功能、诱导抑制活性以及调节细胞因子和细胞因子拮抗剂的产生。50。在本研究中，S100A12抗体的使用剂量与IVIG(方法段)的使用剂量不同，很难判断哪个分子更有效。

IVIG也被认为是细胞因子风暴的一个原因，极大地影响了个体的变化和平衡。虽然IVIG是治疗许多自身免疫性疾病和KD的一种流行而有效的疗法，但据报道它有许多副作用。51,52,53,54,55。本研究采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测KD蛋白生物标志物的变化。如图所示。3经IVIG治疗后，大部分KD标志物水平恢复正常。然而，S100A8、S100A9和DEFA 1在恢复期(IVIG注射后三周)下降，明显低于HC患者(补充图)。1)。这种下降到低于HC对象的水平是否有害的问题值得进一步研究。

在本研究中，我们首次对川崎病(KD)患者的血清蛋白进行了全面筛选和特异性验证。因此，我们确定了6个KD蛋白生物标志物，使我们能够建立一个高性能的KD预测模型。其次，我们发现在IVIG治疗后，6个KD生物标志物的水平逐渐恢复。在6个KD生物标记物中，我们进一步研究了S100A12基因的表达，认为S100A12基因的表达确实受到DNA甲基化的调控。最后，我们发现S100A12通过影响中性粒细胞通过内皮层促进中性粒细胞浸润。而且，抗S100A12抗体可以减弱这种促进作用。因此，抗S100A12抗体有可能作为一种替代疗法来加强传统的IVIG治疗。