人病原免疫显性蛋白P1和P40/P90肺炎支原体

肺炎支原体是一种引起原发性非典型肺炎的人类细菌性病原体。肺炎支原体免疫显性蛋白P1和P40/P90是由免疫显性蛋白P1和P40/P90介导的一种跨膜粘附复合物。本文报道了用X射线晶体学和冷电子显微镜测定P1的结构和P40/P90的X射线结构。相反，唾液酸的结合位点出现在P40/P90中，而不是P1中。遗传和临床变异集中在P1和P40/P90的N端结构域表面。针对P1大部分保守C端结构域产生的多克隆抗体抑制肺炎支原体，对该C端结构域进行检测时，感染患者血清血清学检测呈阳性。P40/P90对人感染血清也有较强的反应性。P1和P40/P90的结构元素为疫苗的研制开辟了新的可能性。肺炎支原体感染。

肺炎支原体是人类引起上下呼吸道感染的病原体1。据估计，这种细菌可导致40%的社区获得性肺炎。2。除了是一种严重的呼吸道病原体，肺炎支原体可引起肺外部位的临床显着性表现和(或)多达25%的感染引起免疫效应。3。与其他重要的呼吸道病原体不同，如肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的疫苗肺炎支原体尽管付出了很大努力，但仍无法获得4.

肺炎支原体通过一种称为附着细胞器的极性结构与宿主目标细胞结合，并以1μm/s的速度向这一分化结构的方向滑动(图1)。1A)5。滑动运动肺炎支原体以及相关物种，如生殖支原体的唯一机制完全不同于支原体移动式，已作了进一步的详细研究。6,7,8。依附肺炎支原体呼吸道细胞是由粘附素和细胞粘附辅助蛋白组成的网络介导的。9,10。在这个网络中，170 kDa蛋白P1被认为是细胞粘附和滑动运动的主要决定因素，抗P1抗体可以防止粘附和运动。9,10,11,12。大约40年来，P1一直被认为与宿主细胞的唾液酸寡糖受体结合。13。由于所有这些相关性质，P1自20世纪70年代末以来一直受到人们的关注，尽管人们很快就认识到，辅助性蛋白也是其功能所必需的。14。P1与P40/P90多肽一起形成一个跨膜复合物，称为“NAP”。15,16。NAP复合体的结构生殖器M.，一种与人类泌尿生殖系统密切相关的病原体肺炎支原体，最近由单粒子冷冻电子显微镜(cryo-emm)和低温电子断层扫描(cryo-et)显示。∼15决议17。这个生殖器M.NAP结构由一个p140-p 110复合物的二聚体组成，从支原体膜向外突出，形成一个直径为∼15 nmP 140和p 110是生殖器M.P1和P40/P90的同源词。因此，在生殖器M.唾液酸寡糖的结合位点在p 110，而不是在p 140中。17,18。P1被认为是最具免疫优势的蛋白质之一。肺炎支原体细胞，在感染患者的免疫反应中起主要作用，因此在诊断和流行病学研究中起着重要作用。3,19,20。这个肺炎支原体基因组包含重复区域，命名为Repmp。大多数Repmp(75%)与MPN 141(P1)和MPN 142(P40/P90)有同源性(图1)。1B)。Repmp与MPN 141或MPN 142的同源重组分别在P1和P40/P90的抗原区产生变异，为逃避免疫宿主系统提供了必要的策略。21,22,23。P40/P90是由MPN 142编码的130 kDa翻译产物中的两个多肽组成的。24(无花果)1B)。从历史上看，人们很少关注P40/P90，对P40/P90对细胞粘附的贡献的研究也比P1少得多。即使是P40多肽在NAP中的存在也受到质疑，MPN 142断裂的原因和机制仍不清楚。25.

a相差免疫荧光显微镜图像肺炎支原体细胞(左)用抗P1单克隆抗体和Alexa Fluor 546二次抗体(红色)观察NAP(附着细胞器表面)的位置。BAR=2m.三维打印模型肺炎支原体细胞(右)。指出了附着细胞器的位置和NAP结构。细胞表面部分模拟为透明的冠层，以显示细胞器的内部核心结构。箭头指示滑动方向。b计划P1操纵子包含三个基因：MPN 140，MPN 141(P1)，以及MPN 142(Orf 6)。重复元件(Repmp)在MPN 141和MPN 142中的位置用颜色显示。MPN 142中也显示了对应于P40和P90的区域。c天然P1和P40/P90蛋白方案及用于结晶和冷电镜分析的重组体。之前报道的P1的主要细胞粘附表位被证明(1383-1395)。在本研究中发现的P40和P90N蛋白(445 R/A)之间的界限用箭头(补充图)来表示。5)。用于纯化重组子的6×His标签的位置用红盒表示.

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在目前的工作中，我们报告了肺炎支原体蛋白P1和P40/P90，以及P40/P90与唾液解低聚糖结合的复合物。这一结果阐明了这些免疫显性蛋白的抗原组织结构，为基因和临床变异性的定位提供了可能。此外，P1不同片段的血清学检测显示IgG抗体对保守区域的识别偏好，提示了免疫系统选择这些区域进行长期免疫的策略。这些信息被认为是澄清人口流动、传染性和流行病的关键。肺炎支原体.

P1的结构确定

晶体肺炎支原体NAP蛋白P1胞外区(残基Thr 29-Asp1521)。这个P1结构，经过多次结晶实验后，排除了根据结构性质预测程序psipred预测的信号分泌肽的N端(根据结构特性预测程序psipred)，该结构不包括预测的残基met1到leu 5926)。在此结构中，还排除了P1的C端(Tyr 1522至Ala1627的残基)的跨膜和胞内区域(如图所示)。1C)。这些P1晶体在测定晶体结构的同时进行了求解。生殖器M.同源蛋白P 140，在两种蛋白质的晶体之间进行平均(41%的序列同源性)，尽管既没有分子模型，也没有实验阶段(见“方法”)(补充图)。1)。P1的最终精化模型，在1.9的分辨率下，得到了一致的结果。R和R免费因子分别为18.7和22.9。2A，b和补充表1).

a带状表现，三个90°相隔的观点，完整的细胞外区域P1。大的N端域是围绕着一个七叶β螺旋桨(淡橙色)组织的，冠(绿色)从那里冒出来。C末端结构域(Cyan)紧接着是一个预测的跨膜螺旋，这要求该结构域与细胞膜接近。bP1图密度来自冷冻-EM(左面板)和X射线结晶学(右面板)。Inset显示来自N端域(顶部)和C端域(底部)的有代表性的区域.冷冻-EM密度的质量提供了在N端区域(估计分辨率为2.9奥尔)的残基的清晰鉴定。相反，C端域在cryo-EM映射中定义得很差，表明相对于N端域具有很高的灵活性。X射线贴图清楚地定义了N端区的核心，尤其是C端区，而N端区的最顶端则呈现出高温因子，难以追踪。cP1中β-螺旋桨的拓扑结构。形成皇冠的环是绿色的。混乱的循环是用黑点表示的，丝线的延伸(AGT重复)是用一个红十字会表示的。股和环不成比例。

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用单粒子分析方法研究了P1外显子的结构。1C和2B和补充图。2)。虽然在冷电镜显微照片中可以清楚地观察到P1粒子，但由于严重的取向偏置，MAP的质量太差，无法改进原子模型。为了缓解这个问题，我们使用覆盖有氧化石墨烯薄膜(GO)的网格来收集数据，这大大提高了数据质量。27(补充图。2A)。共有68,014个选定粒子产生三维电磁图，总体分辨率为∼0.143标准(见“方法”)(补充表)2).

P1的结构由一个大的N端结构域和一个较小的C端结构域组成，其中Asn 60是X射线和cryo-EM图谱中第一个可见的残基，另一个是较小的C端结构域(Gly 1395-Asp1521)。2)。P1的N端区域有一个β片螺旋桨的拓扑结构，连续的七个叶片或β片，每一个都有四个反平行的链，除了只包含两个链的β-Sheet VII。有趣的是，这两条链完全对应于一种具有重要免疫特性的肽，它被定义为细胞粘附表位。28(无花果)2C)。螺旋桨的β片之间连接的长度非常不同，从第VI页和第VII页之间的7个残基到第IV和第5页之间的315个残基。螺旋桨的β-张中相邻的β-链之间的连接长度也有很大差异，从11到219个残基不等。最长的β内部和内部的连接聚集在一起，在β螺旋桨的一侧形成一个类似冠状的结构，相对于C端区域所在的位置。王冠上有13个无序循环，跨越117个残基，无法建造(图1)。2C)。这些无序区域，在X射线和冷电镜结构中基本上是一样的，分布在N端区域表面(补充图)。1和3A)。因此，P1的N端域可以描述为被模糊曲面包围的结构核。C端区域只包含一个无序循环(残基Thr 1483-Asn 1495)，并且具有相同的唯一拓扑的拉长褶皱(根据Dali的说法)。29)作为粘附素p 110的C端结构域生殖器M..

P1的cryo-EM和X射线图谱对于大多数N端区域都有很好的定义，在这两种映射中都可以清晰地识别这些残基(图1)。2B)。然而，从残差Pro1388到C端，这一区域包括了域与整个C端区域之间的铰链，所以cryo-EM映射中的密度变得很弱，表明在域之间存在着类似铰链的运动。在晶体结构上，C端区由晶体触点锚定，密度清晰而脆，而在冠冠顶部，晶体接触较少，温度因子较高(附图)。3B)和链追踪是困难的。这些cryo-EM和X射线映射一起提供了关于整个P1外域的精确结构信息，证明了域之间的移动性，并证实了大量无序环的特征存在。

P40/P90N的晶体结构

用Psipred预测的P40/P90完全细胞外区结构无法获得衍射晶体。26从Ala25到Pro1113(MET 1到Leu 24对应于信号N肽)(如图所示)。1C)。经过多次尝试，从一个结构中生长出高分辨率衍射晶体，此后称为p40/p90N，跨越残基Ser23-Val1003，通过序列排列，它对应于生殖器M.同源蛋白p 110(附图)4)。以p110(PDB条目6R3T)为搜索模型，对含有两个亚基的P40/P90N晶体进行了分子置换，其胞外区序列同源性为44%。经改进的P40/P90N结构，在2.65的分辨率下，已达成一致R和R免费系数分别为21.4和23.4(补充表)1).

P40/P90N的结构显示出一个大的球状结构域，与p 110的N端结构密切相关，742个等价残基的RMSD为1.2。18(无花果)3A和补充图。4)。P40/P90N序列在p 110上分别有60多个残基(Gly 297-Thr 368和Leu 395-Thr 462，分别称为S1和S2)(如图2所示)。3B和补充图。4)。这两个插入，在确定的晶体结构完全无序，发现之间的β-螺旋桨叶片II和III。P40/P90，像P1一样，有一个七叶片β螺旋桨拓扑，与许多连接之间的β-链聚集在一起，形成皇冠(图一)。3B).

a带状表示，与三个90°相距的观点，晶体结构从P40/P90N端域是组织，类似于P1，围绕着一个七叶片β螺旋桨(淡橙色)，从那里出现的皇冠(粉红色)。明确指出了P40/P90中的唾液酸结合位点。预测的p40/p90的C端结构域(Cyan)也是由同源粘附素p 110的C端结构域模拟的。生殖器M.. b来自P40/P90的β螺旋桨的拓扑结构。形成皇冠的环是粉红色的。第一片叶片β片只包含P40/P90中的三股，将N端放置在螺旋桨面与P1中的螺旋桨面相对的位置。无序环和唾液酸结合位点的定位分别用黑点(黑色)和恒星(蓝色)表示。切割位点的位置，导致相应的P40和P90分离多肽，被描绘成一个五角体(淡蓝色)。股和环不成比例。c3SL与P40/P90 N端结构域的结合。低聚糖3SL配合物中P40/P90N结构的带状表征嵌入显示了形成绑定袋的残余物的详细信息。还显示了与3SL对应的电子密度省略图(0.9西格玛)。

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P40和P90常常被认为是MPN 142基因产物翻译后加工过程中产生的两个相互独立的蛋白质。25,30。在我们手中，纯化的P40/P90样品呈现出一种特殊的SDS-PAGE凝胶模式，表明在一些特定的位置上分裂的进展缓慢(补充图)。5A)。主要分裂发生在Arg 445和Ala446之间，位于插入S2的C端(图2)。3B和附图。4和5A)。这种初级切割产生的两个多肽，从N端到Arg 445的跨度越短，从Ala 446到C端的长度越长，就可以与支原体细胞中的p40和p90亚基相对应。30。当最初的分裂位点发生突变以避免分裂时，P40/P90变异蛋白(Ser445-Ser446)出乎意料地出现了类似的蛋白水解模式，在Arg 455和Ala456之间发生切割，仍在S2插入(补充图)。5A)。对支原体细胞的研究报告了Arg 445-Ala446之间的两个切割位点。30和(可能)Leu 454-Arg 45525,31，与目前在体外发现的两个切割Arg-Ala位点(RA基序)有很好的一致性。无论蛋白质水解的范围如何，所有P40/P90N样品都表现为SEC-MALS的单峰和尖峰(附图)。5B表明只有在折叠完成时才发生解理，并且保持了P40/P90N独特的三维结构。裂解蛋白的结构稳定性可能依赖于P40和P90多肽之间的大界面，有75个氢键，6个盐桥，埋有10,480个小时的表面积。2，根据pISA中的络合显着性评分算法，给出了−55 kcal的自由能，并给出了100%的生成概率。32(补充图。6A)。在P40/P90样品中加入EDTA后，蛋白质水解完全停止，表明二价金属具有重要的作用。在P40/P90晶体结构中未发现金属，但晶化条件需要EDTA。大量锌的存在2+用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)对纯化的P40/P90样品中的离子进行了检测，尽管蛋白质的浓度高于离子的浓度(见“方法”)。在P40/P90样本中可能存在一种未被检测到的蛋白酶，这可能来自于大肠杆菌，被SEC-MALS分析。不同的P40/P90N结构，无论是否有C端结构域，在结构的相对分子质量上总是产生一个尖峰，而没有任何其他物种的指示。这些结果表明，P40/P90的断裂是一个自蛋白水解过程。然而，我们还没有找到可能导致这种酶活性的残基。除插入S1和S2外，P40/P90的结构只呈现三个短的无序环(残基Ser118-Gly127、Ser168-Gly175和Ala774-Arg777)，而P40/P90的N端结构域可以看作是一个定义良好的球状结构，有两个长的软盘吊坠(附图)。3A)。将P40/P90的N端结构域与P40/P90的Pro1004-Pro1113区的结构相结合，得到P40/P90的完全胞外区，其序列同源性较高(68%)，RMSD较低(∼0.6奥尔33(无花果)3A和补充图。4)。在溶液中，P1和P40/P90形成杂二聚体，在凝胶过滤剖面中呈现单峰(补充图)。5C).

P40/P90N与硅烷化低聚糖的配合物

P40/P90与低聚糖3SL(神经氨酸形成α2-3与乳糖单糖的连接)和6SL(α2-6连锁)配合物的晶体结构证实了P40/P90中存在唾液酸结合位点。1)。这一结果与唾液低聚糖作为细胞受体的事实是一致的。M.肺炎E和生殖器M.34,35,36，而粘附素p 110则来自生殖器M.，P40/P90的同源物含有神经氨酸的结合位点。18。P40/P90的唾液酸结合位点在结构上与p 110中的位置相当，位于冠的上部(如图所示)。3A，c和补充图。7)。只有神经氨酸与含有X-Tyr/phe-Ser/Thr基序(Leu 630-Phe631-Thr 632)特征的p40/p90β-发夹直接相互作用。18,34。P40作为唾液酸结合部位口袋的外部边缘，如果没有P40就会暴露出来(补充图)。6B)。表面等离子体共振(SPR)表明，硅烷化低聚糖以解离常数与P40/P90结合。Kd)在微摩尔范围内的3SL(∼8.0)和6SL(∼，与p 110报告的数值相似。18(补充图。8)虽然，根据体内研究，6SL与3SL的亲和力比3SL低得多37,38。对于P1，SPR与解聚低聚糖没有结合，这与观察到的结果一致。生殖器M.17.

P1和P40/P90的结构关系

结果表明，P1(1627个残基)和P40/P90(1218个残基)在细胞外区域具有相似的整体结构和拓扑结构。跨膜螺旋与P1和P40/P90序列同源性较高的细胞质区(43%)保持了相似性。尽管大小不同，但这两种蛋白的密切关系表明P1和P40/P90具有共同的系统发育祖先。将P1和P40/P90的N端结构域进行叠加，其序列同源性仅为12%，对应的RMSD为3.5Au，对应的残基为361个，主要对应于螺旋桨β片上的残基。然而，β-Sheet I在P40/P90中只有三条，但在P1中有四条，而P1的第一条β中的“额外”第一条链将N端放置在螺旋桨面，与P40/P90中的N端相反(图1)。4)。P1的“额外”第一束β-片I开始于一个大的β-凸起(残留物69-77)，与P40/P90相反，该中心是空的。由于β-Sheet VII中没有最后两条链，P1的N-端和C-端结构域之间的联系相对于P40/P90发生了变化。因此，螺旋桨内部结构相连的β-Sheet I和VII是P1和P40/P90之间最大的差异。非同源蛋白P1和p 110的C端结构域之间的紧密结构关系进一步支持了最近共同起源的假说，其序列同源性为19%，RMSD为2.0，对应的73个残基(补充图)。9A)，该假设还通过在第四叶片的第二和第三β-链之间，P1和p 110(补充图)的螺旋桨的同一回路中的特征“AGT重复”基序的存在而得到加强。9B).

β-螺旋桨结构及其与P1(左面板)和P40/P90(右面板)相应C端结构域的比较。C端区域与P1中的螺旋桨环成切线，在p40/p90中呈径向突出，其中C端结构域是从来自于p40/p90的同源粘附素p 110中模拟出来的。生殖器M.。N端位于P1和P40/P90螺旋桨的相对面。螺旋桨中心位于P1内，而在P40/P90中为空。

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P1和P40/P90表位和遗传变异性的定位

6种具有抑制细胞粘附活性的抗P1单克隆抗体的表位报告肺炎支原体(AN、P1.62、P1.26、M51、M58和6E7)28,39(补充图。10)都暴露在P1的表面上，就像抗体所期望的那样(如图所示)。5A)。MAb An、P1.62、P1.26和6E7的表位位于N端结构域，而mAb M51和M58的表位位于C端结构域。MAb 6E7的表位与β-螺旋桨最后一片靠近C端结构域的链相对应.据报道，mAb、P1.62和P1.26与双重表位结合(附图)。10)，分离于P1的结构上(图1)。5A)。虽然P1.26的双重表位都暴露在P1的结构中，但其中一个位于Asn 980-Lys 987的表位可能隐藏在NAP复合物中。

a所有已知表位P1结构的映射(附图)。10)。大多数表位位于蛋白质表面，尽管抗体对其中一些人来说似乎很难获得。bP1面三幅图，相距90°，有遗传变异区(棕)、RepMP 4(淡粉色)、RepMP 2/3(浅蓝色)和C端区(青色)。c相应的P40/P90表面的三个视图，具有遗传可变区(棕色)、RepMP 5(绿色)和C末端区域(青色)。从p 110的结构出发，将C端结构描述为薄带.在相应面板的下部，P1和P40/P90的遗传和临床变异位点也具有代表性。临床变异性是指临床分离株迄今所表现出的变异。反过来，“遗传可变性”表示的区域可能是通过RepMP元素之间的dna重组而发生变化的。肺炎支原体基因组。目前，遗传变异区域比临床变异范围更广。

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另外两个报告的表位(Trp 810-Tyr 817和Phe 1124-Arg 1131)被许多人的血清所识别。肺炎支原体感染病人20，位于N端域(如图所示)。5A)。其中第一种存在于P1分子内，而第二种存在于P1表面，尽管其可达性在NAP复合物中也可能受到限制。这两个表位可能是抗体产生的免疫优势，然而，针对这些表位的抗体可能不具有细胞粘附抑制活性。

P1和P40/90的序列随肺炎支原体应变。两个主要变异类型，即1和2，分别存在于m129和fh菌株中。22,31,40。P1的主要变异源是RepMP 4和RepMP 2/3，而P40/P90的主要变异源是RepMP 541。据报道，单抗P1.62只与2型P1蛋白结合42，这与该mAb的表位位于一个可变位点的事实相一致。P1和P40/P90的结构可作为确定已知可变区域位置的地形图。来自P1和P40/P90的Repmp完全位于这些蛋白质的N端结构域，C端结构域仍保持遗传保守性(如图所示)。c.).

抗C端结构域多克隆抗体

与N端可变区抗体相比，识别P1恒定C端结构域的粘附抑制抗体在激发免疫保护方面更为有效。以前的研究表明，滑动和结合肺炎支原体由于加入了一种单克隆抗体，该单克隆抗体是针对含有C端结构域的P1(残基Ala1160-Gln 1518)的一个大型重组片段而产生的。12。为了巩固这些结果，并在免疫反应中更好地描述抗体的结合位点，我们制备了针对P1残基Lys 1376-Asp1521和Ala140-Asp1521两个结构的多克隆抗体(见“方法”)。最短的构造精确地对应于C端区域，而最长的构造还包括域与叶片VII中的两条链之间的铰链(图7)。6A)。用定量聚合酶链反应(QPCR)法测定大鼠的基因组DNA(GDNA)含量。肺炎支原体细胞在溶液中，分数没有附着在玻璃上(见“方法”)。这个肺炎支原体细胞以前曾与不同比例的大鼠血清共同孵育，这些血清受到P1结构的攻击。分析确定肺炎支原体细胞受到多克隆抗体的影响。不接触血清，81%的肺炎支原体细胞附着在塑料表面上时，这些(擦伤的)细胞在24孔板中孵育2小时。然后，为了评价血清其他成分(如增强抗体和吞噬细胞清除微生物能力的补体)的可能毒性，检测了不同百分比(1%、3%、6%和10%)来自免疫前出血(PPI)的攻击动物血清。与未用血清处理的标本相比，PPI的最高浓度(6%和10%)仅使培养后的支原体总数减少(附图6和10%)。11A)。因此，选择低浓度(1%和3%)来测试对粘着能力的抑制作用。肺炎支原体细胞(图1.6B)。毒性效应，至少在一定程度上，可以通过与PPI血清相应值的正常化而减少，并且报告了10%浓度的措施(补充图)。11B)。作为最后的检查，还评估了抗体对C末端结构的特异性.在定量粘附试验前，与相应结构物孵育的大鼠血清与PPI比较，差异无显着性(P>0.05)。

a作为抗原产生多克隆抗体的P1结构所对应的残基在P1结构中呈青色。短结构(左，残基Ala1400-Asp1521)仅包括C端结构域.长结构(右，残基Lys 1376-Asp1521)还包括连接N端结构域和C端结构域的铰链，以及最后一个螺旋桨β表位上的两条链，也称为细胞粘附表位。b抗上述两种结构物的血清可抑制肺炎支原体细胞即使在低浓度时，3%的抑制率也明显高于1%。误差条代表平均±标准差。*p < 0.05 and ***p < 0.001. Source data are provided as a Source Data file.

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用最长的C端结构域构建的大鼠血清孵育后，产生了大量的C端结构域。肺炎支原体当血清浓度分别为1%和3%时，PPI分别为0.31和0.56时，细胞贴壁率显著降低(P<0.01)。p9×10−6和1×10−6通过应用t-检验单尾分布；两个样本相等方差)。短期结构的还原率分别为0.22和0.33，添加1%和3%的血清浓度(P<0.01)。p值0.016和3×10−4)。这些结果表明肺炎支原体抗P1端C端结构域的多克隆抗体可显著降低细胞粘附能力，其中抑制作用最强的是包括细胞粘附肽在内的最长结构物。

人血清对P1和P40/P90的识别作用肺炎支原体病人

P1和P40/P90外显子结构域的测定鼓励我们用19例确诊为阳性的患者血清来评估这些蛋白的不同结构物的免疫原性。肺炎支原体根据血清学检验(表)1)。临床相关信息，包括IgG和IgM值，可用于所有血清。此外，五名病人的血清检测结果为阴性肺炎支原体也包括在研究的控制目的。首先证实了粘附素的免疫优势性，发现19份血清中有17份(90%)P1呈阳性。P40/P90阳性14例(74%)，P40/P90阳性14例(74%)。其中8例(42%)血清P 140阳性。这一结果并不出人意料，因为P1和P 140具有广泛的抗体交叉反应性。43。另外，一些p 140阳性的病人可能感染了生殖器M.除了……之外肺炎支原体。然后，用前面描述的P1(Lys1376-Asp1521和Ala1400-Asp1521)两个C端结构域结构体检测血清应答，以产生多克隆抗体。19份阳性血清中有5份(26%)相对于P1全长显著减少，但重要的是这些阳性血清均与IgG水平最高的血清相对应。

对于P40/P90，对缺乏插入1(S1)或插入1和2(S1S2)的重组蛋白的血清反应性进行了评估，以评估插入的贡献和蛋白水解位点的丢失。19份血清中有14份(74%)检测到S1结构，与整个P40/P90的检出率相同。相反，在P40/P90S1S2结构评估时，仅7份阳性血清显著减少(37%)。此外，即使对这七种阳性血清中的大多数，应答也大大减少。结果表明，P40/P90是一种较强的免疫原性蛋白，插入2(S2)为免疫显性区，而IgG水平较低的血清则认为P40/P90具有较强的免疫原性。

依附肺炎支原体呼吸道细胞表面的唾液酸受体在几年前就已被阐明。34,35,37,44。自确认P1的关键作用以来肺炎支原体细胞粘附，已被认为这种蛋白质负责与唾液酸寡糖结合。11,12,13,14,45。除P1外，其他细胞粘附辅助蛋白也被报道为与唾液酸结合所必需的。14,46。本研究表明，体外与唾液酸受体的结合实际上依赖于P40/P90。3C和补充图。7)然而，亲缘关系和特性可以通过其他蛋白质来调节，或者是由于低聚糖在表面的密度和分布。37,38。这一重要结果与最近发现的与唾液酸低聚糖的结合是由p 110蛋白介导的。生殖器M.18。P40/P90多肽链的断裂发生在N-末端结构域中央的两个暴露的Arg-Ala动机(Arg 445-Ala446和Arg 455-Ala456)上，产生两条与体内发现的P40和P90亚基相对应的多肽链(附图)。4和5A)。裂解似乎是一种二价金属离子依赖的自蛋白水解，只有在折叠完成后才发生。然而，P40/P90在结构上仍表现为与p 110相似的单个球状蛋白。这与P40和P90多肽之间的广泛界面是一致的，这表明它们形成了一个非常稳定的整体(根据PISA)。32)(附图。6)。然而，P40位于NAP的外表面，由于缺乏共价键，在严格或变性的条件下，可能会与P90和NAP复合物分离。只有在某些条件下，P40的丢失才能解释过去P40是否是粘附复合体的一部分的差异。唾液酸寡糖结合位点位于P90多肽的一个环中，P40只贡献于口袋的入口(图1)。3C和补充图。6).

P1和p40/p90之间存在着明显的结构关系，这表明它们是共同的蛋白质祖先，这一假设因P1与非同源蛋白p 110之间的结构相似而得到加强。生殖器M.(无花果)4和补充图。9)。这个共同的祖先可能编码在一个移动元件中，从而促进了在不同种类的肺炎集群中的传播。多个粘附素基因的拷贝存在于几个支原体的基因组中，这支持了这一假设。在每一种植物中，粘附素基因可能已经进化到对不同宿主和组织的粘附中。在进化过程中，在两个类似物的界面上失去一个催化位点的分子系统，可能与F型ATP酶/合成酶的情况有关，该酶广泛分布于大多数生物中。47，为国家适应计划提出了类似的进化过程的可能性。有趣的是，P40/P90与P1的序列同源性在N-端结构域低(12%)，C-端结构域增加(17%)，跨膜区和细胞质区的序列同源性较高(43%)。NAP最暴露区域N端结构域序列变异的增加，既能反映特定的依附和运动需求，又能反映与抗原变异性增强相关的支原体生存策略。

到目前为止，临床分离的P1和P40/P90分别有13个抗原变异体和5个抗原变异体。48(无花果)c.)。P1区和P40/P90区在N端结构域上部呈遗传和临床可变性簇，抗体可轻易阻断与受体结合位点的通路。事实上，绘制已知的遗传变异图肺炎支原体在Nap结构中，根据可获得的信息对其进行建模。生殖器M.结合P1和P40/P90的结构，揭示了唾液酸结合位点口袋完全被这些可变区域所包围。7)。P1和P40/P90存在许多序列插入，相对于它们的同系物P 140和p 110，在每个蛋白质中有200多个额外的残基。生殖器M.(补充图。1和4)。有趣的是，大多数插入对应于结构中无序的区域。肺炎支原体蛋白质。P1中有14个无序循环，而在P40/P90中有4个，但其中2个超过60个残基长(插入S1和S2)。来自P1的C末端结构域只包含一个无序的环，没有遗传变异，这表明了该结构域的免疫原性研究的兴趣。

a全体代表肺炎支原体NAP外显子域是P1-P40/P90异二聚体的二聚体，该二聚体是根据最近获得的信息建立的。生殖器M.。与宿主细胞的受体结合，即人肺泡上皮细胞。唾液酸结合位点位于NAP顶部的一个口袋中，该口袋离NAP的双轴对称轴不远。从P1(绿色)和P40/P90(粉红色)冠被β-螺旋桨(棕色)从C端结构域(氰基)分离，将NAP锚定在支原体膜上。b三视图，相距90°，描述了唾液酸化合物3SL(球体)结合到NAP的两个P40/P90亚基的结合位点。遗传变异为P1和P40/P90(棕色)的区域覆盖了NAP上部的大部分表面。P40P90的RepMP 5是绿色的，RepMP 4和P1的RepMP 2/3分别用粉红色和蓝色表示。P1和P40/P90的C端结构域均以青色表示。该嵌体显示唾液酸结合位点口袋，与一个3SL分子结合，周围的基因可变区域。

全尺寸图像

来自P1 C端结构域的两种多克隆抗体(Lys 1376-Asp1521和Ala1400-Asp1521)抑制细胞粘附。肺炎支原体细胞(图1.6B)。另外，大部分的血清肺炎支原体呈现高IgG含量的感染患者也能识别这些C端结构域(表)1)。相反，这些C端结构域结构物在感染早期，即IgM含量较高的情况下，其识别率较低。P1全长胞外区与IgG或IgM比值无关，均能被所有血清强烈识别，证实P1的免疫优势。19。这些结果表明，C末端区域可能是一个相对较弱或难以接近的抗原区，这与结构信息一致，但能有效地产生更多能够抑制支原体细胞粘附的特异性Iggs抗体。大的P1结构，如整个细胞外区域49或长时间的商业肽(残基1160-1521，联络)肺炎支原体IGM和IgG，Biotrin国际有限公司(BiotrinInternationalLtd)，可能比小的C端结构域更适合诊断，然而，这可能提供一个重要的保护性反应。P40/P90，尽管开创性的研究表明P90是一种重要的免疫原，但在免疫学研究中却常常被忽视。50，74%的感染患者血清均能识别。有趣的是，当第二次插入(S2残基Leu 395-Thr 462)消除时，P40/P90结构物的血清学反应急剧下降。大多数识别S2的血清具有较高的IgM含量，在免疫应答的初始阶段占主导地位。S2的基因组(64%)最高，临床(∼80%的可变性，在P40/P90表面高度暴露和活动。S2的暴露很可能是由于其C端的裂解而增加的，C端产生了两种多肽P40和P90。总之，这些结果表明位于p40内的s2可能作为诱饵来转移免疫应答(表)1)。对P40/P90的高免疫反应具有独特的结构特性，因此需要重新考虑其治疗的可能性。

从肺炎团簇中滑行的支原体，包括肺炎支原体和生殖器M.，被认为是由一种机制引起的，在这种机制中，由ATP能量产生的力51，被传送到在支原体细胞表面起腿/脚作用的Nap。7,8,12,52,53,54,55,56。滑翔肺炎支原体细胞总是在附着细胞器的方向，这意味着滑翔机械，包括细胞表面的小睡，应该提供一个明确的方向性。为了实现定向滑行，释放解离受体和结合一样重要，因为支原体细胞如果继续锚定在最初附着的表面受体上，就无法向前移动。在NAP中，滑动过程中足/腿活动所需的构象变化必须与与细胞受体的结合/释放同步，这些受体被认为是随机分布在宿主表面的。P40/P90中的结合位点可以通过与P1的相互作用而调节，如生殖器M.17。这可能是P1被期望包含绑定位点的原因。在P1的低温-EM图谱中，C端结构域的弱密度表明N端区域的灵活性，证明P1可以经历显著的构象变化，这与与C末端区结合的抗体可能干扰支原体细胞的附着和滑动相一致。因此，虽然P40/P90含有与唾液酸细胞受体的结合位点，但P1仍是NAP在滑行和与宿主细胞粘附中发挥作用的主要分子。此外，nap组分以外的蛋白质，包括p30、p65、hmw 1、hmw 2或prpc/prkC，对于结合和滑动都是必不可少的。57,58,59,60。这些蛋白质可能支持NAPS的功能和构象，以发挥其作用。

将先前的知识与本工作中获得的结构数据相结合，为更好地理解肺炎支原体虽然对粘着和滑动运动机制仍有许多疑问。本工作获得的结构框架还允许对P1和P40/P90的表位以及遗传和临床变异性进行定位，从而解释这些免疫显性蛋白的许多免疫原性。肺炎支原体。这些结果有助于疫苗和治疗药物的发展，以抑制这种呼吸道病原体的传染性。

P1和P40/P90结构物的克隆、表达及纯化

与MPN 141和MPN 142基因相对应的区域肺炎支原体从合成克隆中扩增出来(补充表)3和4)，分别使用引物P1F和P1R，P40/P90F和P40/P90R(补充表)5)。将PCR片段克隆到表达载体pOPINE中。61(来自美国水镇Addgene，RayOwens质粒#26043)，用于生成带有C末端His-标记的结构，其中P1和23-1003以及23-1114的残基分别为29-1521和23-1114，用于P40/P90的短结构和长结构。B834(DE3)细胞(Merck)在22°C下表达后，以0.8mM IPTG(0.6OD)诱导获得重组蛋白。600。细胞在1xPBS、40 mm咪唑中提取并经超声溶解，然后在49,000×离心。g4°C时，将培养上清液装入HisTrap 5ml柱(GE Healthcare)，以40 mm咪唑为结合缓冲液，1xPBS为结合缓冲液，1 xPBS与400 mm咪唑作洗脱缓冲液进行预平衡。在Tris 20 mm、pH7.4、NaCl 150 mm的缓冲液中，将可溶性异喹啉加入Superdex 200 GL 10/300柱(GE Healthcare)。为P40/P90纯化制备的缓冲液加入1mM EDTA，以防止蛋白质水解。P40/P90突变体的产生与野生型相同，但使用补充表中所示的相应引物。5。用N端Edman测序法确定了P40/P90的切割位点，并对纯化的P40/P90结构样品的SDS-PAGE谱带进行了序列分析(附图)。5A)。将P1与短的或长的P40/P90结构的混合物按1：1的比例制备了配合物。稳定的P1-P40/P90杂二聚体的存在，经凝胶过滤证实，是在混合物中检测到的唯一的复合物(附图)。5C).

对于cryo-EM数据收集，p1肺炎支原体M 129菌株(MPN 141)的表达和纯化已如前所述。62。这个P1对P1粘附素的氨基酸残基60-1518进行了密码子优化、合成和插入。nde我和XBAPColdI载体中的I位点(Takara Bio，Shiga，日本)。产生的质粒，PP1-1，其中P1融合到一个N端6×His标记和一个因子Xa位点。携带PP1-1的BL 21或BL 21(DE3)pLysS细胞在37℃下培养，直至培养密度达到OD值。600数值为0.3。细胞在15℃冷休克30 min后，加入终浓度为1.0mm的IPTG，于15°C培养一夜，经离心(4000×10×)获得细胞。g，10 min，4°C)，用含20 mm Tris-HCl和500 mm NaCl的TN缓冲液冲洗两次。悬浮液在−80°C下冷冻，细胞颗粒解冻，悬浮于含1mM PMSF的结合缓冲液(20 mm Tris-HCl pH8.0,500 mm NaCl，20 mm咪唑)中。细胞随后被超声破坏(日本东京NIHONSEIKI)。未破裂细胞经离心(60,000~140,000×)除去。g，60 min，4°C)。将上清液装入HisTrap HP柱(GE Healthcare，Milwaukee，WI)，与结合缓冲液进行平衡。结合蛋白在TN缓冲液中以10-200 mm咪唑为线性梯度洗脱。以TNG缓冲液(20 mm Tris-HCl(pH8.0)，150 mm NaCl)为透析液，负载HiLoad 16/60 Superdex 200预柱(GE Healthcare)，以1mL/min的流速与TNG缓冲液进行平衡。将收集到的P1粘附蛋白组分组合在20 mm Tris-HCl(pH 8.0)上进行透析，并应用于阴离子交换剂Q Sepharose FastFlow(Q Sepharose FastFlow Flow)与缓冲液进行平衡，并以0~0.4 M的线性梯度洗脱纯化后的蛋白，如有必要，用Am图标Ultra 30k自旋滤池(Millibus，Darmstadt，德国)进行浓缩。

P1和P40/P90N的结晶和X射线数据采集

分别对P1和P40/P90蛋白分别在笛卡尔(笛卡尔(TM)分配系统)和菲尼克斯(ArtRobbins仪器)机器人上进行了96孔板结晶筛选，将储集条件下的150 nL和蛋白质溶液浓度分别为6mg/mL和150 nL混合在一起。将1L的P1在6mg/mL的浓度下与1L 20%PEGMME 2000和PCB(丙酸钠、氰化钠和BIS-Tris丙烷pH=4)以2：1的比例混合，得到了最佳的P1晶体。P40/P90N在6mg/mL条件下与1L 20%PEG 3350、0.3%metoh按1：1的比例混合得到P40/P90N的最佳晶体。为了获得P40/P90N与3SL或6SL的复合物，蛋白质样品在20°C下与10 mm的低聚糖孵育1h，所有的P40/P90结晶实验均未成功。数据采集用晶体以15%甘油为保护剂，在液氮中进行闪蒸冷冻。

X射线数据采集在XALOC光束线(西班牙Alba同步加速器)进行.数据用晓2处理63使用XDS64无目的无意义65来自CCP4系列节目66.

P1晶体结构的测定

来自P1的晶体属于C2空间群，根据堆积考虑，在不对称单元中只包含一个亚基。我们试图用重原子和Semet衍生物来解决P1晶体的问题，但最终通过采用溶剂压扁和用晶体进行平均的密度修正技术，获得了较高的分辨率。生殖器M.同源蛋白P 140，其结构当时也不为人所知17。该方法同时解决了P1和P 140的结构(它们之间的序列同源性为41%)。所使用的含P 140晶体与P 140与P 110(P140-P110N)配合物的晶体相对应，与P 140单独的晶体相对应。确定P1和P 140结构的步骤如下：

1. (1)

   采用p 110结构的N-结构域搜索模型，得到了P140-P110N晶体的部分分子置换解。17。P140-P110N晶体的部分溶液在不对称单元中含有4个P110N亚基。这4个P110N亚基被组织成两对，每对亚基中的两个亚基通过精确的局部(非结晶)双轴关联。在这个部分溶液中，看不到与P 140相对应的密度。

   
   

2. (2)

   从这部分溶液的P140-P110N晶体，产生了一个差异(Fo-FC)地图，在约3的分辨率。该差分图中的正密度，预计主要对应于P 140，通过使用局部双对称之一的平均(不使用任何掩模)进行了初步的增强。这种无遮掩的平均化也削弱了晶体中其他亚基的密度，这与局域双对称无关。在这个平均密度中，可以区分强密度和弱密度的连续区域，但还不可能从P 140中识别出任何由分子组成的特征。

   
   

3. (3)

   冷冻电子层析成像(CET)整体图生殖器M.小睡17然后用于定义P 140的初始可能掩码。CET地图∼17决议，对应于P 140-p 110配合物的二聚体，其中p 110结构的拟合是明确的。通过叠加相应的P 110结构，将CET图放置在(Fo-FC)平均图上。然后，在与P 140相对应的CET信封内生成一个假定的“P 140初始图”作为(Fo-FC)平均密度。经过一些抛光(避免与相邻亚基重叠或保持连续密度的区域)，使用假设的“P 140初始映射”进行分子替换搜索(使用程序相位)，得到一个具有4个P110N结构和4个“P 140初始映射”的合理的可能解。试图直接使用CET地图上的密度进行分阶段，而不仅仅是作为一个掩码，在我们的手中没有成功。

   
   

4. (4)

   然后用P140-P110N晶体进行密度平均(和溶剂压扁)迭代循环，并与人工调整P 140掩模进行交替。程序会聚给出更清晰和更连续的密度，虽然没有可以与P 140相对应的二级结构可见。很可能，两个非晶双轴的平行取向削弱了这种平均的相位功率。尽管有这些限制，新的密度(在更新的掩膜内)允许获得P1晶体的分子替换溶液。令人惊讶的是，新的密度并没有为单独的P 140晶体提供解决方案。

   
   

5. (5)

   在P140-P110N晶体内进行平均密度修正，现在对P1晶体进行平均化处理(使用DMMULTI程序)67)很快地改进了地图。DMMULTI的迭代周期与P1晶体的相位扩展周期交替(使用phenix中的“自动构建”协议，分辨率为1.94)和人工调整平均掩模(更新约40次)。同时对P1和P 140进行了模型建立。通过对约50%的结构进行追踪，可以得到一种单独的P 140晶体的分子替换溶液，该溶液中含有6个亚基，从而促进了P1和P 140结构的完成。

   
   

然后对P1进行了改进，给出了协议因素R和R免费分别为18.7%和22.9%(补充表)1)。传统上利用这两个因素之间的差异来评估可用的分子模型对相应的实验衍射数据的解释程度。这两种因素之间的差异与模型在精化过程中引入的偏差有关。尽管最终地图的质量(图)。2BP1结构在N-端(缺失残基29-59)和14个循环(102-105、228-230、259-268、278-282、298-300、337-348、831-847、870-888、923-928、941-944、1226-1232、1308-1324、1341-1349和1482-1495)出现了大量无序残基。最后改进的结构已经用代码6RC 9存放在PDB中。

P40/P90结构的测定

P40/P90晶体属P2空间群12121并在非对称单元中包含两个子单元。用程序Phaser代替分子进行了结构求解。68同源蛋白p 110的结构作为搜索模型生殖器M.(PDB代码6R3T)。对P40/P90的结构在2.65的分辨率下进行了细化，给出了一致因子R和R免费分别为21.4%和23.4%(补充表)1)。P40/P90与3SL和6SL的配合物晶体属C2空间，虽然具有拟正交晶胞尺寸，但在不对称单元中含有一个亚基。3SL晶体具有良好的寡糖结构，在3.2oA处具有较高的占用率。解析度为2.8的6SL晶体具有一定的无序性和整体弱密度，被解释为部分占位。

所有结构的跟踪和精化都是与coot程序交替进行交互和自动循环的。69巴斯特70分别。最终的精细结构已在PDB中沉积，编码为：6RJ1用于P40/P90，6TLZ用于3SL配合物，6TM0用于6SL配合物。

单粒子冷冻-EM

将纯化的P1蛋白应用于定量箔孔碳网(R1.2/1.3，Cu，200目)上，覆盖一层Go薄片(Sigma-Aldrich)，在4°C、100%湿度条件下涂抹4.5s，用VitoFisher科学机器人MarkIV(Meo Fisher Science)冷冻在液态乙烷中。在300 kV加速电压下工作的Titan Krios(MEMO Fisher科学)获得了冷电磁成像，并配备了CS校正器(CEO，GmbH)和猎鹰III型直流电探测器(MEMO Fisher Science)。在电子计数模式下，共获得5279部电影，物理像素尺寸为0.69ao/像素，总剂量为60e/ha。2暴露时间为36.33秒。数据由EPU软件自动采集，离焦范围为−0.75~−2.75m，分为78帧。

单粒子冷电镜图像处理

电影帧随后对齐，以纠正光束引起的运动和漂移使用MotionCor2。71，利用gctf估计对比传递函数。72。共有4,574,424个粒子图像是自动使用GAutomatch(Http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/)并使用Relion-2.1进行了几轮2D分类和3D分类。73。从优秀的2D类中选取295,195幅粒子图像，用cryoSPARC建立P1的初始模型。74。第一次和第二次三维分类分别以7.5度和3.7度的角度采样间隔计算。最后，对来自最佳3D类的68,014个粒子进行了三维细化，得到了分辨率为2.88av和B-因子为89个的重构。2与金标准的fsc标准(fsc≥0.143)。使用Relion-2.1估计了当地的分辨率。处理策略在附图中描述。2A-d补充表中的模型求精统计2.

SEC-MALS分析

采用Superose 6 10/300 GL(GE保健)柱，在黎明HeleosⅡ多角光散射检测器(MALS)和光学T-REX折射率检测器(Wyatt Technology)的基础上，测定了P40/P90短结构的分子量。使用ATRA 7软件(Wyatt Technology)进行数据处理和结果分析。计算时假定DN/DC值为0.185 ml/g(典型蛋白质)。

抗体产生与验证

由Eurogentec制备了抗粘附素P1的多克隆抗体。短期内，大鼠注射多肽Lys 1376-Asp1521或Ala140-Asp1521，第28天采血。免疫前出血也作为阴性对照。采用免疫印迹法检测多克隆抗体对支原体细胞重组肽和蛋白提取液的特异性。每种抗体的稀释度为1：500。

多克隆抗体的生产符合动物试验和研究的伦理规定。它符合下列协会的要求：欧洲实验室动物科学协会联合会和英国内政部动物科学程序法。

Eurogentec遵循的条例是：2010/63/EU和01/2005/EU。

定量粘附试验

肺炎支原体(Atcc 29343)在hyflick培养基中的T75瓶中培养24小时，通过刮取收获，再悬浮在hayflick培养基中，直到最后浓度为10。7细胞/ml：在室温下，在旋转轮上孵育1 ml细胞悬液(1、3、6和10%浓度)，其中含有抗Lys 1376-Asp1521或Ala140-Asp1521多肽的多克隆抗体，是否含有相应肽的2g。免疫前血清为阴性对照。细胞培养后，将细胞悬液接种于24孔板中，37℃下孵育，使细胞粘附在塑料上。2h后，用MasterPure DNA纯化试剂盒(Epientre#MCD 85201)收集上清液(含不粘附于塑料的细胞的分数)和附加细胞进行gDNA提取。样品一式三份，用SYBR绿色PCR主试剂(Thermo#4367659)qPCR测定细胞的相对数量，采用LightCycler 480型实时PCR仪(Roche)进行定量，条件为：95°C变性10 s，95°C扩增15 s，60°C扩增1 min，95°C扩增15s，60°C扩增15s，95°C扩增1 min，熔融曲线为95°C，15 s，95°C，95°C，15 s，95°C，95°连续。采用以下寡核苷酸：qPCR myco FW 5‘-ACGATGATCAGGCGGTTC-3’和qPCR myco RV 5‘-GTTGTCCTCTTTTGAT-3’。

免疫分析

诊断肺炎支原体是利用联络进行的肺炎支原体IgG，IgM试剂盒(DiaSorin)使用1/100稀释病人血清。采用间接ELISA法对96孔板、Immulon 4、HBX 96井板(热Fisher)进行间接ELISA检测，每种抗原在4°C下孵育1 g。每例患者血清加入1/100稀释液，用HRP结合抗人IgG抗体检测。用100μl的底物(热裂变材料)孵育30 min后，用Triturus ELISA仪(Grifols)在450 nm处加入100μl的硫酸，停止反应，在450 nm处读出吸光度。参比滤光片为620 nm。

伦理认可

这项研究得到了来自Parc Taulí(参考文献2019/664)和Vall d‘Hebron大学医院(PR(AG)24/2020)的药物研究伦理委员会的批准。

电感耦合等离子体质谱

样品用1ml的HNO消化。3加0.5毫升H2O2在90°C封闭聚四氟乙烯反应器中，用ICP-MS在Agilent 7500 Ce仪上对ZN标准溶液(InorganicVentures)稀释法制备的校准线实现了锌的测定。

表面等离子体共振

用Biacore 3000生物传感器平台(GE生物系统)用SPR测定结合动力学，该平台配有研究级链霉亲和素涂层生物传感器芯片SA。用3次1 min注射1M NaCl和50 mm NaOH对芯片进行预处理.随后，在20 mm Tris pH7.4、150 mM NaCl和0.05%Tween 20稀释10 g/ml的条件下，分别加载芯片的第二和第三流细胞，分别加入低聚糖6SL-PAA-生物素和3 SL-PAA-生物素(碳合成酶)。值得一提的是，所使用的配体含有一条长的聚丙烯酰胺链，将生物素化的化学连接标记与低聚糖连接起来，这将避免生物素与所使用的P1和P40/P90样品之间的大部分空间冲突。所获得的固定水平在∼200个响应单元和第一个单元格留空作为参考。在25°C(P40/P90的0.9、1.9、3.7和7.5M，P40/P90的1.0、2.0、4.0、16.0和32.0μm的P40/P90和P1的1.0、2.0、4.0、16.0和32.0μm)的25°C下，以30μl/min的流速注入一系列稀释浓度。在P1、120和240 s，P40/P90分别允许蛋白质结合和解离60和120 s。解离后为30s再生，30℃/min时为0.05%SDS。采用Langmuir 1：1结合模型对数据进行拟合，利用Bia估测3.1软件确定平衡离解常数KD.