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血浆中无细胞dna作为一种重要的免疫系统调节因子

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发表时间：2020-10-16 10:21作者：武汉新启迪Xinqidibio

摘要

无细胞DNA(Cfdna)一直存在于血浆中，是产前诊断、肿瘤学和移植学研究的重要生物标志物。但这种cfDNA有生理作用吗？在此，我们发现健康人血浆中cfDNA的存在和清除在免疫系统调节中起着不可或缺的作用。我们将THP 1细胞暴露于正常人血浆中(NP)和不含(TP)cfDNA。在NP处理的细胞中，我们发现其产物维持免疫系统稳态的基因表达增加。TP引起细胞天然免疫应答(IIR)，尤其是促炎性白细胞介素8的表达增高。质谱结果显示，TP培养的细胞中补体级联调节，导致IIR激活的蛋白质丰度较高。这些表达谱提供了证据，证明cfDNA的存在及其在健康人血浆中的清除调节炎症过程和组织稳态的基本机制。深入了解中性粒细胞胞外陷阱及其自然降解产物对免疫系统性能的影响，对未来的医学应用具有重要意义。

导言

Avery等人报道了细菌对细胞外DNA的利用。1944年1。1948年首次报道了人类血液中无细胞dna(Cfdna)的存在。2。最初，特别是俄罗斯科学家利用动物输血对cfDNA的生物学意义进行了研究，首次在植物中进行了移植实验，并由Stroun等人进行了记录。1963年3。所有这些实验都记录了遗传物质的水平传播，并主要从进化的角度进行了评估。4。自身免疫性疾病系统性红斑狼疮(SLE)患者血浆cfDNA浓度增高的研究5以及在血浆中诊断出的癌症患者代表了最初的临床研究。孕妇血浆中胎儿来源cfDNA的发现6引发了人们对cfdna研究的极大兴趣，从而导致了无创产前诊断的建立。通过对癌症患者血浆中cfDNA的研究，发现了肿瘤突变的存在，从而形成了肿瘤基因突变的概念。液体活检7。目前，临床医生对血浆cfdna进行了大量的产前检测研究。8，以及监测肿瘤学的治疗效果。9和移植学10.

人们普遍认为，血浆中的cfDNA来源于造血细胞，含有全基因组序列。Cfdna以短片段的形式呈现，与围绕在一个核小体或其倍数上的dna长度相对应。11。Cfdna分子与至少组蛋白和其他特征不明显的化合物一起在复合物中循环。12但这些配合物的详细结构还没有得到很好的研究。标准的常规DNA分离方法可能破坏或改变这些重要的cfDNA复合物，从而改变它们的生物学行为。

在此之前，我们通过监测dnaseⅠ静脉给药对小鼠SLE模型和SLE患者的治疗效果来研究血浆中cfDNA清除情况。13,14。这些研究表明cfDNA清除率与DNase I浓度有关。同时发现严重创伤后脓毒症患者血浆中DNaseⅠ浓度升高。15。中性粒细胞胞外陷阱(Nets)含有中性粒细胞的全部核DNA，结合杀菌成分被释放出来，以捕获和消灭感染微生物。这些网状结构随后被DNase I清除，它们的清除不足会导致毛细血管阻塞，导致微循环受损，酶损伤组织和炎症的进一步发展。15。大多数并发症报道网状网的形成加剧了新冠肺炎的临床进程。16。过度活化的中性粒细胞和单核巨噬细胞通常是细胞因子风暴的发起者，导致冠状病毒sars cov-2感染的最严重后果。17。细菌和原生动物能够利用自己的酶将网状结构转化为dna降解产物，如脱氧腺苷，对巨噬细胞有毒，并导致其凋亡。18,19.

尽管有这些发现和大量基于cfDNA的诊断技术的发展，但很少有研究聚焦于cfdna在健康个体中的基本生物学功能。一项研究要么用透析病人的血浆治疗人单核细胞，要么用含有cfDNA的健康人的血浆进行治疗。只有透析患者血浆才能刺激靶细胞产生促炎性白细胞介素-6(IL-6)。20。我们还发现，从单个肿瘤细胞株或动物血液循环中注射的复杂肿瘤中分离出的cfdna可引起肿瘤的转化，即所谓的基因转移。21。探讨了非甲基化胎儿cfDNA的生物学特性和功能，发现胎儿cfdna在妊娠期母体循环中所占比例增加。22,23这个胎儿cfDNA刺激了母体对胎盘的免疫反应，从而产生了正确的分娩时机。22.

从不同保存时间的血液中分离出cfDNA，观察cfDNA对人巨噬细胞的影响，以模拟输血后即刻的情况。细胞在含有自身cfDNA的小牛血清中培养。研究发现，巨噬细胞中参与天然免疫反应(IIR)的基因(包括趋化因子及其受体)的表达增加，并得出结论认为，储存的血液产品中所含cfdna可能会干扰输血接受者的免疫系统。24。作者报道了CXCL 8和DDIT 3在实验中的高表达，但实验结果可能受小牛血清的存在影响。

这引起了以下问题：Cfdna在健康生物体中的基本作用是什么？？我们假设，我们可以通过将相同的细胞系暴露在含有或不含cfDNA的血浆中，并通过分离程序排除任何其他因素，如小牛血清或cfDNA复合物的潜在损伤。

结果

我们用THP 1细胞作为原代人单核细胞的代表进行了所有的刺激实验。25目的：展示cfDNA在健康生物体中的基本作用。本实验用含cfDNA(NP)的血浆和用DNase(TP)去除cfDNA的参比血浆进行重复实验，以了解血浆cfDNA对单核细胞转录组和蛋白质组的影响。为了避免动物cfDNA和DNases在实验中的存在，我们使用了从健康志愿者中提取的不含动物血清的人血浆样品。

在发现阶段，我们使用6个血浆样本，利用基因芯片人基因2.1ST阵列条带(ThermoFisher Science)寻找NP和TP治疗相关转录序列的差异。我们检测到有显着性差异(图)。1补充表1)，用单靶定量PCR(QPCR)和另外10份血浆样品(图1)进一步验证。1(b-d)

表1使用Reactome数据库进行分析的结果。(A)NP处理的THP 1细胞和TP处理的THP 1细胞中表达过高的基因通路；(C)TP处理的THP 1细胞中上调的蛋白质的过度表达途径(FDR假发现率与本雅明-霍奇贝格调节)。

全尺寸表

为了区分单用缓冲液的效果和DNase Turbo处理的效果，我们进行了一系列实验(附图)。1)。在乙二胺四乙酸(EDTA)处理的血浆中加入含有二价阳离子的活化缓冲液是提高DNase Turbo活性的必要条件。单独加入该缓冲液后，由于血浆内源性DNase I的激活，使血浆样品中cfDNA的含量下降到原来水平的57.42%。用该缓冲液和DNase Turbo缓冲液孵育后，用qPCR法测定血浆中cfDNA的原始含量时，cfDNA的检出率为7.07%。

在这组刺激实验中，我们测试了完全程序允许血浆中DNase Turbo活性及其后续去除的效果，但不添加DNase Turbo本身，并与NP和TP样品进行了比较。所有这些实验都是用从同一供体获得的血浆样本进行的。我们检测了所有已证实基因的表达，并得出结论：内源DNaseⅠ的激活大部分足以产生基本的差异，在某些情况下，DNase Turbo处理可进一步加强这种差异(附图)。1)。在所有处理过的等离子体样品的处理过程中，都采用了去除二价阳离子的程序，以避免由于DNase Turbo活化缓冲液的加入而使样品中的这些离子浓度升高。我们只研究了一个差异处理的血浆样品的刺激能力，得到的结果与11个被检测基因中的8个基因的验证实验结果一致。的表达方式DIDT 3和SESN 2在验证实验中，np处理的细胞显著升高，而在此供体的np处理的细胞中下降。.这个CCL 24在验证性研究中，TP刺激的细胞中表达显著增加，NP处理后表达明显升高。的表达式中发现的不一致之处。DDIT 3，SESN 2和CCL 24因此可以反映出个体的可变性值得进一步研究。

我们使用验证阶段的结果来直接比较细胞中被np或tp处理后激活的信号通路(表)。1A，b)使用数据库Reactome。这一分析表明，完整的cfDNA的存在/缺失对于细胞的表达和调节途径的激活至关重要。这一事实也被用于np或tp处理的THP 1细胞蛋白质组检测的质谱结果的反应组分析所证实(表)。1c)。

本工作证明，cfDNA及其在血浆中的清除是在生理条件下免疫系统性能不可缺少的。我们证明，在完整的cfdna存在(Np)中的单核细胞上调了免疫系统内稳态的中枢通路，特别是Notch信号。26和未折叠蛋白质反应(表)1a)27而血浆中cfDNA的降解则导致cfDNA的升高。CXCL 8表达式(表)1b)。该mRNA应转化为白细胞介素8(IL8)，这是一种参与直接激活IIR的关键蛋白。28也被认为是细胞衰老的标志29，但在三个小时的培养试验后，蛋白质组学分析没有发现它的升高。然而，我们检测到对补体激活有促进作用的蛋白质的上调(表)。1；补充表2)，证实了这些细胞的炎症状态。利用智能路径分析(IPA)软件对所有获得的数据进行了分析(补充表)。3)。IPA结果(图1)。2A，b)证实了反应体分析的结果(在图中总结)。2B镶嵌)。在经TP培养的THP 1细胞中，在明显改变的典型通路中检测到多个参与免疫应答的通路(见图)。2(A)和过多地代表疾病的特定途径(图1)。2b)。IPA还预测了粒细胞、白细胞、髓样细胞、吞噬细胞和补体活化的积累，这些事件表明细胞主要面对降解的cfDNA(如图1所示)。3).

讨论

我们开发和测试了一个实验工作流程，使我们可以比较cfDNA池在自然血浆和cfDNA在血浆中降解的内源性DNase I和附加DNase Turbo对THP 1细胞的影响。用EDTA固定天然血浆样品，作为DNase I抑制剂。在edta处理的血浆样品中，内源性dnaseⅠ的活性完全停止。30。在EDTA处理的血浆样品中加入含有二价阳离子的活化缓冲液，可以激活内源DNase I和DNase Turbo的活性。为了使这些二价阳离子失活，采用DNase Turbo灭活程序，按照制造商为分离RNA水溶液提供的协议进行灭活。当然，我们的结果受到这样一个事实的限制，那就是我们正在处理像人类血浆这样复杂的样本。设计实验完全排除二价阳离子浓度变化的影响是不可能的。31,32在整个实验过程中，cfdna的存在隐藏在血浆外体中。33,34或在超分子复合物和细胞表面35。然而，当我们量化从NP中分离到的cfDNA，从整个cfDNA去除过程中分离到的cfDNA，而不添加DNase Turbo和TP样品时，我们发现cfDNA水平向最后一个样本逐渐下降。CfDNA水平下降到原来浓度的69.10%后，由于内源性DNaseⅠ活性的影响，可以检测到已鉴定基因表达谱的变化(补充图)。1)。因此，我们也可以推测cfDNA降解产物在诱导这些表达变化中的作用。NP和TP处理细胞表达谱差异的意义在验证实验中得到统计学证明。我们检测到了免疫系统调节途径的差异，在接下来的段落中讨论过。

哺乳动物细胞的炎症反应是通过四种不同的缺口受体(Notch 1-4)介导的信号通路来调节的。26Notch 1参与髓系分化，导致单核细胞分化。36。在非激活免疫细胞中描述了Notch信号通路的本构张力活动。26。我们发现np处理的单核细胞表达HES 1≈表达量为4.63×TP处理组(见图)。1d)。这种高表达记录了缺口通路在这些细胞中的活性。由Toll样受体(TLRs)引导的通路可能会向缺口配体提供额外的信号。26。在原代巨噬细胞中，已经证明了缺口靶基因，如HES 1，也可以完全由TLR刺激诱发37。在这种模型中，cfDNA本身的存在可以通过TLR 9作为DNA传感的一种受体来保证本构性紧张陷窝信号。

不同类型的细胞应激导致内质网腔内未折叠的蛋白质积累。这种积累激活了被称为未折叠蛋白反应的信号转导级联(表)。1a)。已经证明，这种级联在调节免疫系统对先天和适应性反应的功能方面起着核心作用。27.

在我们的实验中，SESN 2(Sestrin 2)在NP处理的细胞中被上调(图2)。1b)。SESN 2众所周知，它是一种应激诱导蛋白，通过诱导有丝分裂而抑制炎症。SESN 2在这种独特的有丝分裂激活调节机制中起着至关重要的作用，它在维持免疫稳态和防止脓毒症中起着关键的作用。38.

我们发现ARRDC 4和IRF 1NP处理细胞中的基因。1(B)与Reactome检测到的通路相关的基因(表)1)。Arrestin结构域4(Arrdc 4)在IIR中的作用已被确认，但仅被部分理解。39。该基因在健康人单核细胞中转录，病毒感染后，其水平升高，并与血清中的白细胞介素浓度相关。干扰素调节因子-1(IRF 1)是一种在免疫系统细胞中低水平表达的转录因子，由不同的细胞因子诱导。它在不同类型的免疫细胞中控制靶基因的转录。40.

用TP培养THP 1细胞可引起表达方式的改变。除了增加CXCL 8表达式，我们在MTTS 1, GPR 1，和CCL 24(无花果)1c)。转移抑制因子-1(MTSS 1)最初被认为是肿瘤细胞的转移抑制因子。目前已知，这种多功能细胞骨架支架蛋白调节细胞骨架动力学，抑制细胞迁移。41。G蛋白偶联受体183(Gpr183)是导致Notch信号抑制的信号通路的成员之一。42. CCL 24Eotaxin 2的编码，由活化的单核细胞产生，并将淋巴细胞、嗜碱细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞吸引到炎症部位。Eotaxin 2诱导THP 1细胞凋亡的研究43.

补体级联蛋白在TP处理细胞的蛋白质组水平明显高于NP处理的细胞(表)1c)。血浆中检测到的可溶性补体蛋白主要是在肝脏中合成的，但其在包括单核细胞在内的循环免疫细胞中的局部产生则被描述得很好44.

我们证实了单核细胞不接触生理cfDNA浓度的血浆激活紧急机制，并开始启动IIR。这些细胞的正常功能被下调(Notch信号)，潜在的迁移受到抑制，免疫细胞吸引子的基因被抑制。CXCL 8和CCL 24)被过度表达。2B嵌体和图。3).

在此之前，我们发现细胞因子网络的另一个关键成员--肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)在TP处理的细胞中45,46. 肿瘤坏死因子-α作为炎症的主要调节因子，并确保组织内平衡。47。我们报告了在两种不同的情况下，qpcr实验验证的统计学上的显着性差异？？在我们的研究中，健康志愿者的血浆样本被用于刺激thp1细胞。45并在报告中研究了腹腔疾病患者血浆样本的刺激能力。46。在我们为基因芯片实验的评估设定的严格条件下，肿瘤坏死因子-α未见有差异表达的报道，但根据我们以前的结果，在TP处理的细胞中，它的表达较高。

到目前为止，维持血浆cfDNA浓度在生理水平的调控机制尚不清楚。自然监管机制正在平衡蚊帐的生产和清除。这些机制可能涉及负反馈回路系统，该系统在生物学上广泛传播，也被药理学家用于药物传递系统。48。反馈回路机制的失效可能导致DNaseⅠ的产生加剧，导致IIR。

有些细菌不仅配备了DNase，而且还配备了自己的3‘-核苷酸酶。这些酶的活性破坏网状结构，并将其降解产物转化为脱氧腺苷，即对巨噬细胞有毒性，并诱导其凋亡。49。不同的细胞表面有不同的外核酶。50,51，不能排除他们参与网状网的降解和有毒产物的形成。我们的研究结果表明，细胞对cfdna降解产物浓度的相对升高，可引起和促进与组织损伤相关的高cfdna浓度清除所致的炎症状态。52或受影响的网虫产品的清除53。除透析患者外，常见的共病患者均报告了解除管制的加剧。54但在大多数共同疾病中，它也是典型的，其特征是易引起sars cov-2感染严重并发症的危险因素。16.

在这里我们提供了证据认为CfDNA在人类血浆中，它的间隙代表了基本天然调节先天免疫反应的工具。我们用THP 1细胞作为人类单核细胞的模型，证明cfDNA在免疫系统的稳态中起着不可或缺的作用。用健康志愿者的天然血浆处理的细胞表达的基因，其产物维持免疫系统的动态平衡。然而，在转录水平上，经cfDNA降解的相同血浆处理的细胞直接激活IIR，增加白细胞介素8 mRNA的表达。它们还在蛋白质组水平上上调了补体化合物的含量。

完整和降解的cfDNA及其被细胞感知的作用似乎是免疫系统性能的重要方面之一，因此，对这一课题的进一步研究是非常热门的。了解cfDNA释放的机制、稳态维持的清除和机制以及不同类型的cfDNA序列及其化学修饰在cfDNA介导的调控事件中的作用，以及对细胞感受到的cfDNA存在的各个方面的认识，是至关重要的。对循环cfDNA水平参与免疫系统调节机制的详细了解，可能导致新的临床应用，尤其是对脓毒症、新冠肺炎和治疗性DNase治疗的全面了解。监测cfdna水平可以作为早期对癌症、脓毒症和新冠肺炎等疾病的早期诊断和分娩时机的实际工具。

本研究首次揭示了cfDNA及其在健康人血浆中的清除对天然免疫应答的调节作用，值得进一步研究。

方法

学科

从符合以下标准的健康志愿者中选择了血浆捐献者：

1.
他们没有吃药
2.
他们没有慢性病
3.
在过去的两周里，他们还没有从传染病中恢复过来。
4.
他们的身体和心理状况都很好。

我们在前面的研究中描述的样本子集。45用于表达阵列实验。选择年龄(35.8±13.8)岁的5名女性和5名男性，年龄(35.8±13.8)岁(与10份样本的平均±标准差)进行定量PCR(QPCR)验证。

捷克布拉格查尔斯大学第一医学院和总院医院伦理委员会批准了我们的研究。我们获得了所有研究参与者的知情同意。所有方法均按照有关准则和规定执行。

血浆样品的制备

将全血收集到含K3EDTA(Greiner Bio-one)的真空管中.采用离心速度、时间和温度分别为1800 rpm、10 min和4°C的方法分离血浆，然后将血浆转移到2mL低结合收集管中，离心5 min至14,500 rpm，去除残余细胞。最后，我们将血浆转移到干净的2mL DNA LoBind管(Eppendorf)中。样品在−80°C的温度下保存。

在细胞实验之前，等离子体样品解冻并分裂成两个相同的相似点。第一种是在其天然状态(NP)使用，第二种是按照制造商的推荐(TP)用TurboDNA无DNA DNase(ThermoFisher Science)处理。每100μ1用1μ1 TurboDNase、7μl水和12μ110×TurboDNase缓冲液处理。混合液在37℃下孵育20 min，加入12μl DNase灭活剂，加入12 mol/L DNase灭活剂，在室温下混合孵育5 min。DNase灭活剂在10,000 g加速度下离心1.5 min，上清液转入新管。

为了评价不同的协议步骤对表达谱改变的影响，我们进行了以下实验：血浆样品按DNase Turbo处理方案处理，DNase Turbo添加水，以识别该酶的作用。在37℃时加入灭活缓冲液或在孵育后加入灭活缓冲液，以了解样品在37℃和活化缓冲液中的作用。用DNase Turbo加成法进行了相同的实验。所有这些血浆样品被用于THP 1细胞的刺激实验，所有验证的基因的表达被确定如下所述。

测定治疗前后血浆中cfDNA的含量免费利用QIAamp循环核酸试剂盒分离的cfDNA样品，在QuantStudio 12 K Flex实时PCR系统(应用生物系统)上进行了定量PCR。PowerupSYBR绿色聚合酶链反应(LifeTechnologies，美国)占20μ1反应的一半，用引物检测cfdna总量。36B445标准曲线稀释范围为每反应5ng~0.312 ng。

细胞培养与刺激

我们用THP 1细胞进行刺激实验。在细胞从深冻状态恢复后，我们使用了先前发布的协议。45,46。细胞在含10%血浆样品的RPMI 1640培养基(Sigma Aldrich)中刺激3h。培养3h后收集细胞，离心后取上清，将细胞保存在裂解液(Sigma-Aldrich)中，保存在−80°C。

RNA提取与逆转录

用于微阵列实验的RNA提取与RT

用GenElute哺乳动物总RNA微量预试剂盒(Sigma-Aldrich)，对储存在Lysis溶液中的THP 1细胞，经NP和TP配对刺激实验后，根据制造商提供的程序，在−20°C保存，在解冻样品上进行反转录，并按厂家提供的程序进行反转录。

微阵列实验-转录组分析

用Agilent 2100生物分析仪(Agilent 2100)评价总RNA含量的质量和完整性。只有超过RNA完整性的最低质量阈值(也称为RIN)>7.5的样本才用于随后的转录评估。根据基因芯片人类基因2.1ST阵列条(ThermoFisher Science)在基因地图集系统(ThermoFisher Science)上按照制造商的指示进行了微阵列实验。芯片的质量控制是使用Affymetrix表达式控制台(Thermo Fisher Science)进行的；后续数据分析使用的是Transcriptome Analysis Console 4.0(Life Technologies)。

当前数据可在ArrayExpress数据库中获得：否。E-MTAB-8574
实验题目：THP 1细胞暴露于含有或缺乏cfDNA的血浆中

QPCR实验

用12种TaqMan基因表达试验对以下基因芯片实验的结果进行了验证：TXNIP(Hs 01006900_G1)、ARRDC 4(Hs 00411771_M1)、DDIT 3(Hs 00358796_G1)、SESN 2(Hs 00230241_M1)、IRF 1(Hs0097176m1)、HERPUD 1(Hs01124269_M1)、HES1(Hs00172878_M1)、MTSS 1(Hs00207341_M1)、GPR 183(Hs00270639_1)、CCL 24(Hs00171082_M1)、CCL8(Hs174103)(Hs174103)、Hs99K999m1(应用Bis1)。在QantStudio 12 K Flex实时PCR系统(应用生物系统)和TaqMan基因表达主混合(应用生物系统)中进行反应。结果乘以103提高分辨率，并以任意单位(AU)表示。用GraphPad棱镜5.00.288软件(图-Pad软件)进行统计分析。首先，我们进行了D‘Agostino-Pearson正态性检验。参数数据分布采用t检验，非参数数据分布采用Wilcoxon匹配对符号秩检验。所有比较均将统计学意义设为≤0.0 5水平。

质谱样品制备

将含≈500,000细胞的冻存的THP-1细胞颗粒再悬浮于10 0μL-p-磷酸盐缓冲液中，用1%十二烷基硫酸钠(Sigma-Aldrich)组成的缓冲液在50 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液中溶解，加入1×完全蛋白酶抑制剂Cocktail-乙二胺四乙酸(Roche)，pH 8.5(卡尔-Roth)。混合物在95℃下加热5 min，然后在冰上放置样品冷却。在每管中加入25个单元的苯并酶核酸酶(Sigma-Aldrich)，37℃下孵育30 min，降解染色质。分离得到的蛋白质混合物离心去除细胞碎片，用纳米滴紫外可见分光光度计(Thermo Fisher Science)测定上清液。

将二硫苏糖醇溶液(Sigma-Aldrich)添加到终浓度为10 mm的蛋白质中，在45°C下孵育30 min，在终浓度为40 mm的碘乙酰胺中加入40 mm的碘乙酰胺进行烷基化反应，在无环境光的条件下，在25℃下孵育30 min，使裂解液中的蛋白质(25μg)降解。每管加入1μL的1 M二硫苏糖醇可使反应失活。蛋白溶液用1%甲酸酸化，pH值在2~3之间。在同一管中，将50μg顺磁性羧酸修饰微粒Sera-Mag SpeedBeads 1μm(Ge Healthcare)重新悬浮在蛋白质样品溶液中。立即加入乙腈制得50%的溶液，样品悬浮液在25℃下混合孵育20 min，置于磁台内，用1 mL 70%乙醇洗涤2次含有捕获蛋白的顺磁性微粒30 s，最后用200μL乙腈干燥15 s，再悬浮于≈50μL的≈50 mm三乙基碳酸氢铵缓冲液8.0中。在酶底物比为1：35的条件下，加入胰蛋白酶/Lys-C蛋白酶混合物(Promega)，在37℃下过夜孵育，经珠上消化洗脱蛋白质。55。第二天，用25μL的25 mm三乙基碳酸氢铵pH 8.0再次洗涤两次，得到的肽洗脱液从微粒中排出。用4μL的10%三氟乙酸酸化混合肽混合物，然后按用户手册用OMIX C18移液管(Agilent)脱盐。清洁肽样品在真空浓缩器(Eppendorf)上蒸发，存放在−80°C蛋白管中。

纳米LC-MS分析

采用纳米反相柱(简易喷雾柱，50 cm×75mID，PepMap C18，2m颗粒，10 nm孔径)进行液相色谱/质谱分析。流动相缓冲液A为0.1%甲酸，乙腈为乙腈。样品被装载在C18 PepMap 100型捕集柱上，粒径为5μm，尺寸为300μm×5mm(热学)，在17.5μ1 min下加载4 min。−1。负载缓冲液由水、2%乙腈和0.1%三氟乙酸组成。用流动相B梯度(4%~35%B)在120 min内洗脱多肽。通过电喷雾电离将洗脱肽阳离子转化为气相离子，并在热轨道饶舌融合模型Q-OT-QIT(Thermo Fisher Science)上进行了分析。350~1400 mz肽前体的扫描−1采用120 K分辨率，200 m/z，5×105离子计数目标。串联MS(MS)2)在1.5Th与四极分离，HCD碎裂，正规化碰撞能量为30，快速扫描MS。2离子阱中的分析。MS2离子计数目标设置为104最大注射时间为35 ms。仅对电荷态为2~6的前体进行了质谱采样。2。动态排斥时间设定为45s，在所选前体及其同位素周围具有10 ppm的耐受性。启动了单同位素前驱物的选择。该仪器采用高速运行模式，运行周期为2s。56.

女士2数据分析

所有数据都用MaxQuant软件进行分析和量化(1.6.1.0版)57。蛋白质和多肽的假发现率(FDR)均为1%，并规定了7个氨基酸的最小肽长。仙女座的搜索引擎被用于微软。2从当前UniProt人类数据库下载的人的光谱搜索。酶特异性被设定为Arg和Lys的C末端，也允许脯氨酸键的切割和最多两个缺失的切割。选择半胱氨酸二硫甲基化作为固定修饰，N端蛋白乙酰化和蛋氨酸氧化作为可变修饰。这个两轮比赛利用MaxQuant的特征将识别信息传递给其它LC-MS。2根据它们的质量和保留时间运行，最大偏差为0.7分钟；这也被用于量化实验。使用MaxQuant 41中的无标签算法进行量化。58。数据分析用Perseus 1.6.2.2进行。软件59.