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蛋白质纯化胶体过滤法

发表时间:2019-07-18 16:14作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com

蛋白质纯化胶体过滤法


不同大小的蛋白质分子进入胶体过滤管柱,可依其分子量差异分离;是一种广泛应用的partition色析法 (Pharmacia操作手册, Gel Filtration)。


仪器设备:色析管柱 (Pharmacia C column, 1.6×100 cm)、铁架、铁夹及水平仪;部分收集器(fraction collector, 需准备干净试管约100 支);浓缩用离心机 (低速5,000 rpm);浓缩用离心管Centriprep-30 (Amicon 4322) 请注意其使用方法


药品试剂:胶体Sephacryl S-300 (Pharmacia):a. 预先以缓冲液buffer A-150 平衡好,并且使完全沈降后的胶体体积,占全部体积的七至八成;要先预估好胶体的使用量。b. 胶体温度要与操作场所的温度一致,否则温度变化会产生气泡。c. Sephacryl 系列胶体有相当大的吸附力,因此要在缓冲液加入0.15 M 以上的NaCl 以除去非专一性吸附。Buffer A-150:注意使用时的温度要与管柱胶体的温度一致标准分子量组合 (Bio-Rad 151-1901):溶于1 mL 后每组取0.4 mL.含有thyroglobulin (670 kD), bovine gamma globulin (158 kD), chicken ovalbumin (44 kD), equine myoglobin (17 kD), vitamin B12 (1,350)


方法步骤:


管柱装填:


1) 以纯水冲洗玻璃管柱 (以纯水上下冲洗即可,严禁使用试管刷);并请了解管柱的构造与拆装方法,垂直架好管柱,以软管连接部分收集器,并以bufferA-150 试看管路是否通畅;可以用止血钳或长尾文书夹夹住出口软管,则可控制溶离的进行。 注意系统的摆设要适当,不要装置于交通要冲。


2) 依预估量取出Sephacryl 胶体,注意胶体的温度与缓冲液是否已平衡;将瓶中的胶体上下震荡,使的完全悬浮,但勿产生太多气泡。


3) 在管柱内加入约10 cm 高缓冲液,然后将胶体慢慢沿着管壁倒入管柱,一直加到管柱顶端,开始流洗后胶体沈降很快。当胶体上方的液面逐渐降低时,可于顶端添加胶体,以达所要高度;胶体高度约90 cm.


4) 胶体完全沈降后,小心以buffer A-150 加满管柱,关闭出口,装上顶端端盖并连通缓冲液瓶,打开出口以重力流洗。 调整缓冲液瓶高度,使流速约每五~六秒一滴,并设定收集体积为2.5 mL/tube.


5) 胶柱流洗约100 mL 后,关闭出口,拆开顶端端盖,先以滴管吸出胶体上方的溶液到剩约1 cm 高,注意勿破坏胶体表面平整; 然后打开出口,使液面下降至胶体面,再关闭出口,准备注入样本。


样本色析进行:


6) 以微量移液器或滴管吸取样本 (样本体积不得超过胶体总体积的3%),沿着胶体上方管壁缓慢加入,注意切勿破坏胶体的平整表面!(样本确实体积 _______ mL)


7) 打开出口,同时开启部分收集器;当样本完全没入胶体时,关闭出口,缓缓加入与样本相等体积的buffer A-150,打开出口待其慢慢进入胶体中,如此重复二次。不得扰动胶体表面,造成凹陷。


8) 暂时关闭出口,将液面高度加满至管柱顶端,并把顶端端盖锁上;然后打开出口开始溶离,调整缓冲液瓶的高度,使流速为6 s 一滴。


9) 要留心观察前面几个分划,确定整个系统运转无碍,小心部分收集器最容易出问题。管柱预计将流洗过夜,收集约80 管。


10) 收集试管,进行蛋白质定量分析以及GUS 活性测定,并请作图。


11) 收集GUS 活性区,以Centriprep-30 浓缩至10 mL 后,加buffer A-0 稀释至20 mL,再次浓缩至 -mL (GF),保留100 μL.


12) 管柱请再以buffer A-150 流洗100 mL 后,小心放置一旁,准备以后进行分子量测定。


分子量测定:


13) 进行分子量测定前一天,请先以buffer A-150 流洗100 mL,并检查胶柱内有无气泡产生,若有严重的气泡或干裂,必须重新装填管柱。


14) 取标准分子量溶液0.4 mL,加上纯质目标酶0.5 mL (以亲和层析法所得的AF 部份),如上法注入管柱中,立刻开始进行胶体过滤,并收集各分划。请依循上述所有管柱及分划收集器的操作要点。


15) 收集所得,进行蛋白质定量分析,可定出数个蛋白质尖峰,以作为分子量依据;另以目测法,决定红色高峰的管数,则可定出vitamin B12的溶离管数。利用以上数据,可画出分子量与溶离管数间的直线关系,作为分子量判定的标准校正线。


16) 同样的一批分划,请进行酶活性分析 (GUS),则可定出酶的溶离体积,对照上述标准校正线,则可求出酶的分子量。


拆除管柱及保存胶体:


17) 若管柱长期不用,应当自管柱中取出胶体,以缓冲液清洗后,置冷藏室中保存,但绝对不要放在冷冻箱中。胶体若装填太紧,有时可能不易取出,要有耐心地以缓冲液慢慢冲出来。


18) 胶体可以加0.01% NaN3防止霉菌生长,但使用前记得要洗去;再度使用时,请检查胶体中有无灰黑色霉菌颗粒,若有结块而不易打散者,也不要使用。


文章分类: 蛋白技术资料
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