8种正常人皮肤细胞的染色质可及性景观
为了建立一个基本的正常染色质景观，我们首先从新鲜的人类皮肤中直接获取细胞，并分析了居住在皮肤中的8种细胞类型的19份样本的基因组范围内染色质可及性图，其中包括cd4。+和CD8+T细胞(CD4s，CD8s)，树突状细胞(DC)，Langerhans(LCS)，内皮细胞(ECs)，巨噬细胞(Macs)，成纤维细胞(Fibs)，角质形成细胞(KCs)。1A，补充图。1A，b，补充数据1-2，见方法)。每个atac-seq库都被测序，平均获得超过2500万对端读，总共包含5亿多个测量值(补充数据)。3)。我们使用了一个已发布的atac-seq管道。13分析原始测序数据，识别染色质可达性的焦点峰，这是活性调控元素的典型特征。经过过滤和分位数归一化后，我们在这8种皮肤常驻细胞类型中共鉴定出104,223种高质量的可访问元素。
图1：活体正常皮肤8种细胞DNA可达性景观。(a)研究设计的原理图，描述了8种细胞类型(CD4)的分离和ATAC-seq的工作流程。+、CD8+T细胞(CD4，CD8)，树突状细胞(DC)，Langerhans细胞(LC)，内皮细胞(EC)，巨噬细胞(Mac)，成纤维细胞(Fib)，角质形成细胞(KC)。(b)健康供体CD4、CD8、DC、LC、EC、Mac、Fib和KC位点ATAC-seq信号谱标准化，同时显示H2K27ac染色质免疫沉淀序列。N表示生物复制的数量。(c)所有样本之间Pearson相关性的无监督层次聚类。Atac-seq信号来自远端元件.每一行和每列都是一个示例，单元格类型可以区分颜色。源数据作为源数据文件提供。
所有正常样本的转录起始位点(TSS)富集和阅读长度分布分析显示了数据集的高质量(补充图)。1C−d所有样本的Pearson相关系数表明，大多数单个细胞类型的生物复制具有良好的重复性(附图)。1E)。对于每一种细胞类型，ATAC-seq成功地检测到谱系特异性标记基因周围的开放染色质信号(补充图)。1F)。Atac-seq剖面的快照显示这些数据的信噪比很高，捕获了组蛋白h3赖氨酸27乙酰化染色质免疫沉淀序列中已知的增强子和启动子元件，并在encode项目调查的大量细胞简编中进行了测序。(无花果。1B).
因为皮肤活检和体外扩张的细胞中的调节成分有很大的不同。14我们试图量化直接从新鲜皮肤获取的细胞与组织培养细胞的染色质景观的潜在差异。以成纤维细胞为例，我们发现12768个可访问元素(占所有检测到的可访问点的12%以上)有显著差异。2折叠变化>4，P数值<0.05)(补充图。2A-C)，表明在染色质水平上，皮肤细胞的自然环境确实与皮肤细胞的环境不同。在KCS中也得到了类似的结果，其中8%的皮肤活检检测到的KCs峰有显著差异(？log)。2折叠变化>4，P值<0.05)的培养细胞(补充图)。2D-e).
与启动子和转录谱相比，远端增强子(峰距最近的tss>1kb)提供了更好的细胞类型分类。15然后，对正常样品进行非监督聚类和主成分分析，根据远侧增强子的染色质可获性，发现所有样本都被精确地划分为每种单个细胞类型(图1)。1C，补充图。1g)，确认数据集的高质量。此外，我们的结果还提示了真皮巨噬细胞染色质开放状态与CD 31的相似之处。+内皮细胞。SSC患者不同细胞类型间的相关性分析也显示，MACS与ECs之间有很强的相关性(附图)。3A)。由于真皮mac和dc都是从单核细胞分化而来的，我们标准化的atac-seq图谱显示，染色质围绕着髓系细胞的几个标记基因，例如ITGAX(CD11c)CD 80, CD 68, 拉德拉, TLR 4在Macs和DC中确实比其他细胞类型更容易获得(附图)。3B)，表明我们的巨噬细胞ATAC-seq数据的可靠性。因此，我们获得了第一个可靠的染色质可达性剖面的多种稀有皮肤细胞类型直接从人体皮肤，这是至关重要的生理相关下游分析，突出了我们的研究价值。
正常皮肤细胞型特异性染色质的可及性
接下来，我们从健康人的皮肤中探索不同细胞类型的调节体。将每种细胞类型的峰与其余样品进行比较，共鉴定出14243个显著的细胞型特异性峰。P值<0.005，@log2折叠变化>2，图2。2A)。然后将这些峰聚成5个主要基团，代表T细胞、DC和LCS、Fibs、ECs和Macs以及KCs的特定染色质可达位点。每种细胞类型的功能标记基因都有峰值。非重复顶级富集基因(补充数据)4)和生物功能(补充数据)5)对于每个集群，使用基因组区域丰富注释工具进行注释(很好)16(无花果)2B)。我们注意到，每个峰簇的这些顶级富集GO术语也与每个细胞群的身份一致。例如，T细胞特异性的峰丰富了生物功能，如调节免疫系统的过程(P值<10−81)和白细胞活化(P值<10−78)，而Kc-特异性峰在角质形成细胞分化过程中富集(P值<10−13).
图2：健康供体皮肤活检中细胞类型特异性染色质的可及性。(a)健康供体细胞类型特异性峰标准化ATAC-seq强度的热图。每一行都是一个峰值，每一列都是一个样本，带有颜色编码的单元格类型(顶部面板)。侧栏中显示的簇表示CD4(CD4)的细胞类型特异性峰。+T细胞)和CD8(CD8)+T细胞)(C1)、DC(树突状细胞)和LC(Langerhans细胞)(C2)、Fib(成纤维细胞)(C3)、EC(内皮细胞)和Mac(巨噬细胞)(C4)和KC(角质形成细胞)(C5)。每个簇的功能标记基因显示在右侧。源数据作为源数据文件提供。(b)每个聚类中峰值的顶级富集GO(GeneOntology)术语。P价值(Binom Raw)P值)用二项分布统计检验计算。源数据作为源数据文件提供。(c)所有正常样本细胞类型特异的可接近元件中已知转录因子(TF)基序的富集。每一行都是TF母题，每一列都是样本。颜色栏代表从Genomica估算的富集意义，红色表示富集，蓝色表示贫化。源数据作为源数据文件提供。
由于真皮巨噬细胞和CD 31的染色质可访问模式+内皮细胞相似，巨噬细胞和内皮细胞的特征峰均丰富了血管生成和伤口愈合的生物学功能。2B，补充图。4A，b)。巨噬细胞是非常具有可塑性的细胞，其异质性的一个方面是驻留的巨噬细胞的组织特化。17。据报道，真皮巨噬细胞通过表达血管生长因子参与血管生成。18。我们的结果进一步表明，位于真皮层的巨噬细胞的表观遗传规则与其他髓样细胞有很大不同，但与内皮细胞相似。
由于转录因子(Tfs)与它们的同源dna序列(称为motifs)结合，通过将已知的tf基序与atac-seq的dna可访问性数据结合，我们可以预测每一种细胞类型的规则组。6。我们首先从茉莉数据库中获得了242个脊椎动物TF基序。19，利用荷马鉴定了它们的全基因组分布。20，并用图中所示的差异ATAC-seq峰覆盖这些位点。2A。然后我们用Genomica21确定每个样本中显著富集或耗尽的基序，从而构建每种细胞类型的TF调节体(图1)。2C，补充数据6)。我们发现，根据我们的数据，大多数特定于细胞类型的TFs都与其相应的细胞类型一致富集。例如，RUNX和GATA 1，两个已知的T细胞调节器22，在CD4中明显富集。+和CD8+T细胞IRF和NFκB，DC功能和发展的关键因子23，强烈富集于直流峰。另一个例子是tp 63、klf 4和grhl 2等具有调节kc分化特性的tf，在kc特异性峰中被发现富集。24。在多种细胞类型中，如TEAD 2和ETS家族中发现的富TFs很少。这些结果为体内大多数皮肤常驻细胞提供了一个完整的调节体图像。
最近的一项研究表明，疾病相关的单核苷酸多态性(Snp)在非编码dna调控元素中高度富集，其特征是可访问染色质。15。通过测量GWAS中与相关功能变异重叠区域的调节元件的活性，现在可以更准确地预测受与多种人类疾病相关的基因变异影响的特定细胞类型。15。然后，我们应用这一方法，根据与免疫学和皮肤相关疾病相关的SNPs预测SSC的可能致病细胞类型(补充数据)。7)。不出所料，与溃疡性结肠炎、腹腔疾病和克罗恩病相关的SNPs在T细胞特异性染色质可及位点中富集(补充图1)。5A，补充数据8)，与以前研究的结果一致11,25。有趣的是，SSC相关的SNPs主要富集于发展中国家，特别是在具有最高统计意义的强关联中(P值<10−5，补充图。5A，b)，表明树突状细胞可能通过未知的机制参与了这种疾病的发生。
为了进一步评估不同细胞类型对SSC的致病作用，我们在霉酚酸酯(MMF)治疗的3~4个时间点下载了SSC感染皮肤的芯片基因表达数据(共采集30例患者的105例手臂标本)。26并对细胞类型特异性基因的平均表达进行相关分析(补充数据)。4)与SSC患者皮肤纤维化程度的比较，用改良的Rodnan皮肤评分(MRSS)进行测量。27。为了消除MMF治疗对相关分析的影响，基因对MMF治疗的反应(补充图)。6A，补充数据9)在进行相关分析之前从输入基因列表中删除(见方法)。我们发现DC信号基因的平均表达与MRSS呈极显著正相关(P值=1.5×10−5, R=0.41，图1。3A，补充数据10)在所检测的六种细胞类型中，DC是与疾病病理最相关的细胞类型。T细胞基因信号也与MRSS高度相关(P值=0.0013，R而其他细胞类型，如Fib、LC、EC和KC，则无显着性差异(P>0.05)。P值>0.05)。我们进一步对同一患者MRSS处于最低(低)和最高(高)时获得的细胞标志基因表达进行了配对比较，发现在较高mrss水平的皮肤活检中dc信号基因的表达显著增高(学生配对双尾t检验)。P值=0.011，图1。3B)。然而，其他细胞类型则没有显着性差异。这些结果提示DC可能是SSC的关键贡献者之一。
图3：不同细胞类型对SSC的致病作用。(a)散点图，显示T细胞(CD4)细胞型标志基因(用荷马语定义)的平均表达情况。+和CD8+T细胞(T细胞)、DC(树突状细胞)、LC(Langerhans细胞)、EC(内皮细胞)、Fib(成纤维细胞)、KC(角质形成细胞)与同一患者在同一时间点的相应MRSS(改良Rodnan皮肤评分)比较。通过微阵列获得患者皮肤细胞的基因表达谱，剔除对霉酚酸酯(MMF)作用的基因。在每个面板中，分别给出了线性回归曲线和95%置信区间(灰色区域)，并进行了双尾t统计。P右下角显示Pearson相关值和相关系数(R)。源数据作为源数据文件提供。(b细胞型标记基因在时间点的平均表达与同一患者的最低MRSS和最高MRSS在所有六种细胞类型中的表达水平成对比较。在治疗过程中，我们确定MRSS评分最低(时间点低)和最高(时间点高)的时间点，然后根据时间点低和时间点高的微阵列剖面分别计算出每个细胞类型的相应特征评分。不同患者的低、高时间点可能不同。MRSS最高者13例，最低MRSS>5者13例，P数值采用配对和双尾t检验。源数据作为源数据文件提供。
正常皮肤、未受影响皮肤和受累皮肤细胞类型特异性规则组差异
为了进一步说明皮肤与正常人和SSC患者的规则性差异，我们遵循Whitfield等人首次采用的实验设计。28，并从SSC患者的下背部获得临床受累的前臂远端皮肤和临床未受影响的皮肤的活检(见方法)。每个皮肤样本接受流式细胞术分离不同的细胞类型，然后是ATAC-seq(补充图)。1B，补充数据1–3)。所有样本的主成分分析清楚地分离出主要的细胞类型，各临床状态在DC(附图)中得到进一步的区分。7A).
为了研究染色质可及性的差异，并找出支持SSC的表观遗传特征，我们在T细胞、DC和成纤维细胞上对临床受影响的皮肤活检和正常皮肤活检进行了ATAC-seq图谱的配对比较，并对其进行了充分的生物复制序列测定。使用类似的置信度(P值<0.012折叠变化>2)，我们发现DC(15869)的差异峰明显多于CD4。+T细胞(3786)，CD8+T细胞(3048)和成纤维细胞(2179)，提示DC在健康状态和疾病状态之间可能具有最大的染色质差异(图1)。4A-d)。根据其在正常细胞、未受影响细胞和受影响细胞中的富集程度，将差异峰分为6个簇，并对每种细胞类型的差异峰的比例进行了评估(图1)。4e-h，补充图。7b，补充数据11)。对于巨噬细胞和EC，在正常对照或未受影响和受影响的皮肤中只获得一个样本，因此我们无法筛选出具有统计能力的细胞类型特异性特征峰。这两种单元格类型的差异峰随后由_\log定义。2折叠变化>2，但受影响的巨噬细胞和EC中上调的峰值未富集到任何与自身免疫性纤维化相关的GO条件(补充图1)。7C，d).
图4：细胞类型-正常皮肤、未受影响皮肤和受影响皮肤的特异性规则组差异。(a–d)正常、未受影响和受影响的CD4(CD4)峰的归一化ATAC-seq强度(z-分数)的热图。+T细胞)(a)，CD8(CD8)+T细胞)(b)，DC(树突状细胞)(c)和Fib(成纤维细胞)(d)。簇1-6分别代表正常细胞、正常细胞和未受影响细胞、受影响细胞、受影响细胞和受影响细胞中富集的峰群。每一行都是一个峰值，每一列都是一个示例。源数据作为源数据文件提供。(e–h)每个簇中的峰比率与CD4中显著差异峰的总数目相比较(e)，CD8(f)，DC(g)和Fib(h). (i)已知转录因子(TF)基序在健康供体DC、SSC患者未受影响皮肤和感染皮肤中的富集。源数据作为源数据文件提供。(j)比较正常、未受影响或受影响的DC中NFκB和STAT 1的聚集足迹。
为了进一步研究这些差异峰的疾病相关性和生物学功能，我们对每种细胞类型的每个聚类中的所有峰进行了疾病和基因本体论分析。我们发现：(1)第5组中的峰，与正常和未受影响的细胞相比，在受影响的细胞中高度富集，表现出SSC的疾病特征。一些自身免疫性疾病，包括SSC，在DC(P值~10−14)与T细胞和成纤维细胞(P数值~1，补充图。8，补充数据12)，samλ作为免疫相关生物学功能(附图)。9)，表明DC中隐藏的表观遗传差异，这可能是导致SSC的一个被低估的因素。(2)与健康献血者相比，SSC组第4组的峰值更易到达，代表患者的特征。与疾病相关的生物学功能如“细胞对转化生长因子β刺激的反应”、“αβT细胞活化”、“炎症反应”在T细胞的第4组峰中明显富集。P值~10−5，补充图。9a，b)，提示SSC患者真皮T细胞的染色质状态保留固有的异常，无论其是否在病变中。
然后，我们试图用Genomica的模块映射算法和TF基序分析来说明调节每种细胞类型中每个簇的丰富的Tf。6。令我们惊讶的是，我们只在DC的差异峰上观察到一种疾病特异性TF调节模式，而在其他类型的细胞中却没有。NFκB和STAT家族TFs在自身免疫性疾病中起着重要作用。29,30，与正常和未受影响的DC相比，受影响的DC高度富集(图1)。4I)。对atac-seq谱的“tf足迹”分析显示，直接来自临床ssc的dc与正常细胞相比，tfs、nf、κ、b和stat的脚印有明显的差异。(无花果。4J)表明感染SSC皮肤的DC中NF-κB和STAT 1的占位比正常人更为明显。这些结果提示DC是三种状态下分化程度最高的细胞类型，可能通过NF、κ、B和STAT 1信号通路驱动SSC。为了进一步研究哪些dc亚型可能导致这种疾病，我们将疾病特异性染色质可访问位点映射到最近公布的人免疫细胞的综合单细胞atac-seq地图上。31。我们发现疾病特征峰在常规树突状细胞(CDC)中高度富集，而在浆细胞样树突状细胞或其他髓样细胞中则较少(补充图)。10A-c表明CDC是树突状细胞的主要致病亚型。
接下来我们测试DC在受影响的皮肤中的浸润程度是否高于正常皮肤。为此，我们检测了ZBTB 46在健康供体正常皮肤和SSC患者瘦皮肤中的表达。ZbTB 46是一种著名的TF，在经典的dc及其祖细胞中有选择性表达，但不被浆细胞样dc、单核细胞、巨噬细胞或其他淋巴系或髓样系所表达。32(补充图。11)。重要的是，与正常皮肤相比，受感染的SSC皮肤中有更多的DC被ZBTB 46染色。5A，b, P数值=0.0001，单边Mann-WhitneyU检验)。多项已发表研究的基因表达谱26,33,34也证明了ZBTB 46在SSC皮肤中表达明显高于正常皮肤(如图所示)。5C, P数值=0.0002，0.003，0.00001，单边Mann-Whitney U检验).这些结果进一步支持了我们的假说，即DC在纤维化炎症免疫环境的形成中起着重要作用。
图5：与正常皮肤相比，常规树突状细胞在受累皮肤中浸润更多。(a)SSC患者正常皮肤和受累皮肤中ZBTB 46表达的免疫组织化学分析。实验包括12份正常皮肤样本和8份受影响的皮肤样本。(b)ZBTB 46蛋白在正常人中的平均表达n =12)和受影响(n (8)SSC患者皮肤。P值用单边Mann-Whitney U检验估计.上线、中线和下线分别表示75%分位数+1.5*分位数范围(IQR)、50%分位数和25%分位数−1.5*IQR。源数据作为源数据文件提供。(c)DC(常规树突状细胞)标记基因的表达ZBTB 46正常(n =33、34、36)和南南合作(n =58、99、61)三个已发表数据集的皮肤。P值用单边Mann-Whitney U检验估计.框的上线、中线和下线分别表示75%、50%和25%分位数。盒形图的上下晶须表示75%分位数+1.5*分位数范围(IQR)和25%分位数−1.5*IQR。源数据作为源数据文件提供。
DCS在SSC皮肤常驻细胞间的通讯中起着核心作用。
不同皮肤细胞群体之间的相互交流在皮肤发育、稳态和修复中起着关键作用。然而，细胞间的交叉交谈中断，可能导致皮肤纤维化导致sscc。35,36。因此，我们试图通过ATAC-seq数据来说明皮肤细胞之间的相互作用，并阐明SSC中连接被改变的信号通路(见方法)。我们首先调查了作为阳性对照的几种经过仔细研究的信号通路的染色质可获性，例如Notch和tvtβ，它们连接了皮肤中的四种主要细胞类型，并且与组织纤维化也有关联。37,38(无花果)6A)。我们注意到SSC中多个Notch和TGFβ受体/配体基因位点的染色质更容易进入，表明这些途径在皮肤细胞间处于疾病状态。然后，我们用Circos图显示SSC患者正常皮肤和受影响皮肤中所选择的受体/配体周围的ATAC-seq信号，其中最外面的环面显示每种细胞类型的受体和配体的名称，在SSC患者和健康对照组中和内环面分别显示这些基因位点上的ATAC-seq信号(Fig)。6B)。更确切地说，ATAC-seq峰在附近。NOTCH 1受体在受影响的DC和NOTCH 1[医]配体Dll4在受影响的CD4中更容易接触到+T细胞，提示DC和CD4之间的联系+T细胞可能通过NOTCH 1/Dll 4途径在SSC中过度活动。同样，这种过度刺激了DC和CD4之间的通讯。+T细胞也可以通过共刺激信号(CD 86/CD 28)和纤维化相关信号通路(TGFβBR 2/TGFβ1)获得。39.
图6：SSC中皮肤常驻细胞与正常皮肤细胞之间的通讯。(a)树突状细胞(CD4)之间通讯的示例图。+、CD8+T细胞、成纤维细胞通过已知和预测的SSC致病性受体/配体在受感染皮肤中被上调，与正常对照比较有显着性差异。(b)受体/配体周围ATAC-seq信号的Circos图a)正常和受影响的SSC患者的皮肤。最外面的环面显示每种细胞类型的受体和配体的名称。在SSC患者(中)和健康对照者(内)中、内环面分别在这些基因位点上显示ATAC-seq信号。在SSC细胞中较易接触的基因位点以阴影突出。中心连接连接配体及其受体之间的细胞类型。连接物的宽度代表相应基因的长度。(c)与正常对照组相比，每对受体/配体在受影响状态下的相互作用强度(SIA)升高(红色)或下调(蓝色)。SSC中新的受体/配体相互作用被强调。底部行显示细胞类型间上调和下调受体/配体相互作用的总数。源数据作为源数据文件提供。(d–e)正常和受影响的CD4(CD4)正常的ATAC-seq曲线+T细胞)，CD8(CD8)+T细胞)、树突状细胞(DC)和成纤维细胞(Fib)EFNA 5和EphA 4 (d)和IL 10和IL10RA (e)基因位点。
这样，我们就可以从有限数量的患者样本中提名SSC中T细胞、DC和Fibs之间的潜在通信。我们首先从配体受体伙伴(Dlrp)数据库中获得所有已知的受体/配体对。40和CellPhoneDB41，然后询问他们的编码基因位点周围的染色质在疾病状态下是否更容易/很难接近。我们定义了每个受体/配体对的相互作用强度改变(SIA)评分，其中较高的SIA值表示SSC中细胞与细胞的更强连接(见方法)。我们发现这些细胞之间有80对明显改变的交叉对话(图1)。6C，补充数据13, |西亚7)。我们的结果表明，在SSC(补充图)中，皮肤常驻细胞之间的广泛细胞间通讯通过多种不同途径发生了改变。12)。例如，在疾病状态下几乎所有的细胞通讯中都有受体/配体的显著改变，例如下调的EFNA 5/EphA 4(图1)。6d)和上调IL 10/IL10RA白细胞介素信号通路(图1)。6E)，其失调可能会增加患上许多自身免疫性疾病的风险。42,43然而，这些途径驱动自身免疫和组织纤维化的表观遗传机制尚未完全揭示。本研究还阐明了IGF1R/IGF 1和PGF/Nrp 1表达下调、HBEGF/CD 44、XCL 2/XCR 1和CCL 21/CCR 7通路上调等新的生长因子和趋化因子途径，但这些信号通路在自身免疫性疾病中的作用有待进一步研究。
总之，在纤维性皮肤中，DC促进了最上调的受体/配体相互作用(如图所示)。6C，补充图。12A，97-up/33-down)与其他类型的细胞，而CD8+T细胞与最下调的相互作用有关(图一)。6C，补充图。12C、43-向上/87-向下)。这一分析强调了SSC中DC与其他皮肤细胞之间细胞-细胞通讯的紊乱，并为治疗这种疾病提供了丰富的潜在药物靶点资源。
