为了研究大体积DNA加合物的HR，用BPDE处理U2OS细胞20 min，然后释放到新鲜培养基中。治疗后，由于修复缓慢，BPDE病变持续时间超过24小时。26。我们检查了一系列的浓度，从低非细胞毒性(50 NM)到高剂量和细胞毒性剂量(500 NM和1.65M)(补充图)。1A)。BPDE诱导的磷-S 139组蛋白H2AX(γH2AX)病灶与5-氯脱氧尿苷(CldU)共同定位于正在进行的复制叉，支持治疗导致复制应激(图1)。1B).
然后我们开始量化BPDE对病灶的诱导作用。在所有的实验中，焦点在显微镜下被直接量化，在图中显示的图像是为了说明。γH2AX病灶在所有浓度的BPDE中都有相似的诱导，并持续了至少24小时，与无效的修复一致(如图所示)。1C)。RAD 51病灶分析显示，BPDE释放后数天可诱导HR。与以前的研究一致7,850 NM BPDE释放后RAD 51病灶阳性细胞百分比较高BPDE强(图1)。1D、e)。这些观察并不仅仅是由于细胞周期的改变，因为50 NM BPDE对细胞周期分布的影响很小，500 NM BPDE诱导S期而不是G1期阻滞(补充图1)。1B、C)。此外，50 NM BPDE(补充图)后，每个阳性细胞的RAD 51病灶数也明显增加。1D).
接下来，我们确定了BPDE治疗对复制叉减速和停滞的影响.这首先需要为DNA纤维分析开发优化的CldU和Idu双脉冲标记协议.我们最初使用第二个标签(Idu)添加了BPDE，以测量BPDE对复制叉进程的即时影响。只有非常高的BPDE浓度(1.65M)强烈减慢了复制速度(附图)。1E)。在BPDE孵育前后30 min，用CldU标记U2OS细胞，检测BPDE孵育过程中或治疗后停滞的分叉。然后用Idu清洗和标记细胞，以检测任何正在进行的叉子持续20分钟(如图所示)。1F)。停滞的叉子被定义为CldU轨道，而不是Idu轨道。根据我们以前的测量26,27，我们计算出，用50 nmBPDE处理20分钟，可诱导150个加合物/10。8碱基对。如果平均复制叉复制6×104碱基对28，约10%的叉子可能会遇到病变。然而，较高的BPDE浓度增加了叉状停滞，50 NM BPDE并没有导致失速叉的显著增加(图1)。1F)。类似的结果也得到了使用叉不对称作为叉子延迟的读数(补充图)。1F)。这表明，在这种情况下，复制叉可以在损坏的模板上继续进行。
我们以前曾报道过，RAD 51招募到停滞的叉子并不会导致RAD 51焦点的形成，相反，它需要叉式折叠成dsb。3。这就提出了用50 NMBPDE处理可引起DSB形成的问题。对DSB标记物53BP1病灶的分析和脉冲场凝胶电泳(PFGE)对DSBs的物理检测表明，50 NM BPDE诱发的DSB较少，而500 nm和1.65 mBPDE可诱导DSB的形成。1g，补充图。1g，H)。有趣的是，1.65MBPDE的高细胞毒性处理可能抑制γH2AX下游的DSB反应，因为PFGE检测到的DSB与RAD 51或53BP 1在这些条件下的诱导不一致。1E，g，补充图。氢)。综上所述，这些数据没有提供证据表明50 NM BPDE诱发的RAD 51病灶与DSB的形成有关。相比之下，500 nm BPDE诱发的RAD 51病灶与DSB的形成有良好的相关性(图1)。1E，g)。这就提出了低剂量BPDE治疗后RAD 51灶形成的机制和作用问题。
RAD 51是为了响应HU处理而促进分叉重新启动。3。相反，RAD 51的siRNA耗竭并没有增加释放后从低(50 NM)或高(1.65M)BPDE浓度释放后的叉状停滞水平(见图)。1H，I，补充图。2A)。RAD 51还能促进紫外线或甲基甲磺酸甲酯(Mms)引起的病变的分叉减速或停滞。29,30。然而，我们没有发现任何证据表明RAD 51在BPDE损坏的模板上促进叉子减速(补充图)。2B)。此外，RAD 51是修理倒塌的叉子和防止DSB积累响应胡。3。RAD 51耗竭对50 NM或500 NM BPDE诱发的53BP 1病灶水平无明显影响(图1)。1J，补充图。2C)。这些实验没有提供任何证据证明RAD 51是需要防止叉塌陷，或修复倒塌的叉子，以响应BPDE损伤。
初级波尔再引发促进大体积加合物的间隙形成
RAD 51加载启动HR需要形成长段ssDNA，最初被RPA包覆，然后被替换为RAD 51。RPA聚焦分析表明，在50 NM BPDE释放后，在没有叉状停滞或DSB形成的情况下，ssDNA迅速形成(附图)。)。BPDE释放后24~48h，RPA病灶消失(图1)。2A)。γH2AX病灶在BPDE释放后24~48h内也可得到解决，提示其主要标记为ssDNA(补充图)。2F)。RAD 51的缺失损害了BPDE诱导的RPA病灶的分辨力，提示RAD 51参与了BPDE诱导的ssDNA的修复。2A).
a非T-或RAD 51-siRNA处理的U2OS细胞在BPDE释放后有>10个RPA病灶的百分比。溶剂释放3h。n=3。bS1内切酶修饰DNA纤维分析原理图及DNA纤维标记策略。cS_1修饰DNA纤维在溶剂或50 nm BPDE处理的细胞中的CldU/Idu比值b)。S1：S1内切酶。线条代表着刻薄。3个重复的数据。dRAD 51介导的单链DNA缺口修复的原理图在复制阻断性病变重新启动后。ePrimPol和SMC 1蛋白水平(负载控制)在50 NM BPDE和溶剂(-)释放后6小时后，在U2OS细胞中的蛋白水平在PrimPol或非siRNA耗尽后48h。千吨级。代表.n=3。f在NONT或PrimPol siRNA存在下，50 NM BPDE释放后停顿叉的定量。n=3。g50 nm BPDE处理细胞S1修饰DNA纤维后的CldU/Idu比值b)NOT或PrimPol siRNA作用48h后。线条代表着刻薄。3个重复的数据。h顶部：野生型(WT)和Primase-Death(CH)PrimPol变异体的蛋白质结构域。底部：内源性PrimPol缺失和V5标记的PrimPol变异体的异位表达。iU2OS细胞经上述处理后，异位V5标记WT或CH PrimPol、内源性PrimPol(长时间暴露，通道1和4)和SMC 1(负载控制)的蛋白水平。代表.n=3(-Dox：WT和-Dox：CH)n=2)。j用或不含PrimPol shRNA的50 NM BPDE释放后停顿叉的定量和编码GFP(-)或WT或CH PrimPol的表达结构。纤维标记与(f) n=3.源数据作为源数据文件提供。给出了至少三个独立实验的手段和扫描电镜(BAR)。星号p-与溶剂相比的数值，除非另有说明(单面学生的)t-A，F，单边Mann-Whitney对C，G的检验；J，*的单向方差分析p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).
为了特别测试是否在持续的叉后bpde病变处形成ssdna间隙，我们使用s1内切酶(S1)修饰的纤维测定法。31。依赖于S1的dna断裂的ssdna间隙或缺口允许在新复制的dna中特异性地检测这些病变(如图所示)。2B)。DNA纤维标记后，在DNA纤维扩散和染色前，用重组S1核酸酶对细胞核进行渗透和处理。Idu脉冲被延长到50分钟，以便捕捉更多的事件，尽管这会导致CldU/Idu比值与基于标记时间的预期值相比较偏高(图1)。2C，补充图。3A，B)。然而，如果新生dna中存在ssdna间隙，S1诱导的dbs会进一步缩短idu标记的纤维，从而提高cldu/idu比模拟处理样品。50 NM BPDE的释放，但不是从溶剂中释放，导致S1处理比模拟处理样品中的CldU/Idu比值增加，支持在复制含有BPDE损伤的DNA时在叉后产生ssDNA间隙(见图)。2C)。综上所述，这些数据表明RAD 51参与了复制后修复，RAD 51焦点成核位点可能位于ssDNA远离正在进行的叉子的区域。我们假设这个ssDNA可能在复制后的间隙形成，通过重新启动大面积病变下游的DNA合成(如图所示)。二维空间).
因此，我们研究了在ssdna间隙形成中重新启动的潜在作用。最近有报道称，rna/dna primase primPol在紫外线损伤后能重新发挥作用。11,12,13,14因此，是促进ssDNA间隙形成的一个很好的候选者(见图)。二维空间)。我们用siRNA12在U2OS细胞中耗尽原核(图1.2E，补充图。)。我们首先测试了PrimPol再启动是否是导致叉子持续进展的原因，以及50 NM BPDE治疗后缺乏叉子延迟的原因。事实上，我们观察到，当PrimPol耗尽时，50 NM BPDE会引起叉状停滞(图1)。2F)。此外，PrimPol的缺失阻止了叉后的ssDNA缺口诱导，如S1核酸酶纤维法所测(图1)。2G，补充图。3D-F)。有一点要注意的是，在抑制NAR和碱基切除修复的条件下，我们也没有进行S1核酸酶纤维检测，这两种方法都能诱导ssDNA间隙，并有助于BPDE处理后S1纤维的缩短。然而，切除修复引起的间隙将独立于PrimPol发生，因此不会影响PrimPol耗竭的整体影响。
PrimPol同时具有DNA/RNA引物酶和DNA聚合酶活性10。为了测试在bpde存在的情况下，是否需要PrimPol引物酶活性来继续复制叉子的进展，我们进行了野生型(Wt)和primase死突变体(Ch)突变体primpool的体外表达的拯救实验。11,32(无花果)2H)。这些实验都是使用不针对异位结构的可诱导shRNA的u2OS细胞系进行的。7(无花果)2I)，以及siRNA缺失，再加上siRNA抗性WT或CH突变体PrimPol的重新表达(附图)。第三代)。只有WT PrimPol，而不是CH PrimPol，才能拯救BPDE诱导的叉子失速，支持重新启动防止BPDE诱导的分叉延迟(图1)。2J，补充图。3H，I).
PRIMPOL重新启动和端部处理促进RAD 51加载
接下来我们研究RAD 51病灶的形成是否依赖于PrimPol介导的再启动和ssDNA间隙的形成。U2OS细胞中的PrimPol缺失可特异性地抑制BPDE诱导的RAD 51灶的形成，但不抑制自发RAD 51灶的形成(图1)。3A，b)。BrdU掺入证实，这不是由于细胞周期的变化或抑制DNA复制后的PrimPol耗尽(图一)。3C，补充图。4A)。进行中普里波尔用qRT-PCR(补充图)证实了mRNA在时间过程中的缺失.4B)。此外，在肺上皮性癌A 549和正常肺成纤维细胞mrc 5细胞中，还观察到RAD 51病灶的形成。普里波尔敲除MRC 5细胞(补充图)。4C-E).
图3：PrimPol介导的再启动促进RAD 51负载，以响应庞大的DNA加合物。an=3.标尺：10μm。b50 NM BPDE释放后U2OS细胞在NONT或PrimPol siRNA存在时出现>5个RAD 51病灶的百分比。n=3。c代表细胞周期分布的释放后，从溶剂(1小时)或50 NM BPDE存在NONT或PrimPol siRNA。流式细胞术前用BrdU孵育30 min标记复制细胞。百分比是三个独立实验的平均值，如图所示。S4A. d50 NM BPDE释放后RAD 51>5个病灶的细胞百分比，有或不伴PrimPol shRNA缺失和表达结构编码GFP或WT或CH PrimPol。溶剂释放1h。n=3.源数据作为源数据文件提供。给出了至少三个独立实验的手段和扫描电镜(BAR)。星号p-数值(B的单边学生t检验或D的单向方差分析，*)p < 0.05, **p < 0.01).
接下来我们进行了拯救实验，以测试在BPDE存在下RAD 51病灶的形成是否需要PrimPol引物酶活性。PrimPOL缺失细胞中RAD 51病灶的形成可以被PrimPol WT的异位表达所挽救，但不能通过Primase死亡的PrimPol Ch突变体来挽救，这再次表明RAD 51病灶的形成需要重新启动的活性(图1)。三维空间)。用siRNA耗竭结合siRNA抗性PrimPol变体的表达获得了类似的结果(补充图)。4F).
离体实验表明，PrimPol在dna损伤下游的14个核苷酸附近重新启动。33。这样短的ssDNA缺口需要进一步切除核酸酶，如Mre 11和外切酶1(EXO 1)，以便RAD 51病灶的形成(图1)。4A)。为了研究这些间隙的切除，我们使用了单分子分析的切除路径(SMART)。34。用BrdU处理细胞48h，用BrdU标记所有DNA。4B)。DNA纤维铺展，BrdU免疫染色，不进行酸变性，然后用显示延伸的ssDNA(图一)。4C)。BPDE治疗明显诱导ssDNA轨迹，这需要PrimPol和EXO 1(如图所示)。4C，d)。相反，依托泊苷诱导的DSBs的ssDNA轨道明显长于BPDE诱导的轨道，并且需要EXO 1，而不需要PrimPol(补充图)。5A)。这支持BPDE诱导的ssDNA轨迹不是由切除的DSB所致。为了进一步研究切除活性对BPDE诱导的ssDNA径迹形成的贡献，我们使用了Mre 11酶活性的化学抑制剂PFM 01(图11)。4E)。PFM 01治疗也减少了ssDNA轨迹的长度(如图所示)。4E，f)，提示通过Mre 11和EXO 1切除进一步扩大初始短间隙。Mre 11和EXO 1的活性可能是促进ssDNA间隙切除的添加剂，但我们还没有进行测试。
图4：在PrimPol依赖的单链DNA间隙加载RAD 51需要dna末端切除。aMre 11和EXO 1核酸酶活性及Mre11抑制剂PFM 01和MILIN靶向性的原理图。b顶层：单链DNA定量智能分析策略。底部：EXO 1和α-微管蛋白(加载控制)在U2OS细胞中的蛋白水平。图片来自n=1。cSMART分析50 NM BPDE或溶剂(-)在NOT(-)、PrimPol或EXO 1 siRNA存在下释放20 min后的单链DNA。图像代表n=3.标尺：10μm。dBPDE后SMART分析的量化c)。线条代表着刻薄。3个重复的数据。e使用Mre 11抑制剂(MRE11I)PFM 01和具有代表性的天然BrdU区域图像进行智能分析的策略。标尺：5μm。fMre 11抑制剂PFM 01存在或不存在时，50 NM BPDE 20 min释放4h后单链DNA的SMART分析。线条代表着刻薄。3个重复的数据。g在Mre 11抑制剂MILIN或PFM 01存在或不存在时，50 NM BPDE释放后有>5个RAD 51病灶的细胞百分比(e). n=3。h50 NM BPDE释放后，在NOT或EXO 1 siRNA存在下48h后，RAD 51>5病灶的细胞百分比。n=3源数据作为源数据文件提供。给出了至少三个独立实验的手段和扫描电镜(BAR)。星号表示p-值(D，G的单向方差分析，F的单面Mann-Whitney，H，*的单面t检验)。p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).
然后，我们利用Mre 11(分别为MILIN和PFM 01)的外显子和内切酶活性的化学抑制剂以及EXO 1的siRNA耗尽，研究了切除对RAD 51病灶形成的影响。Mre 11活性和EXO 1均为BPDE诱导的RAD 51灶形成所必需，支持PrimPol介导的HR起始包括切除(图1)。4G，h).
PrimPol还在UV和4-NQO加合物上促进RAD 51的加载。
为了探讨PrimPol再引发对其他大面积病变HR起始的相关性，我们用UV-C辐射诱导CPD和6-4光产物，并测定了PrimPol存在和不存在时对ssDNA间隙形成的影响(图1)。5A)。紫外-C辐射诱导了大量的s1内切酶敏感位点，在约150个加合物/10下，损伤密度将高于50 nmbpde。6碱基对35。当PrimPol耗尽引起模拟和UV-C辐照样品中的一些S1敏感位点时，在PrimPol耗尽后，S1敏感位点的UV特异性诱导减少(图1)。5B，补充图。6A，B)。此外，还需要PrimPol才能有效地形成RAD 51病灶，以响应UV-C诱导的大体积损伤，以及化学致癌物4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO)诱导的大量DNA加合物(图1-NQO)诱导嘌呤的大量加合物(图1)。5C，d)。UV-C后RAD 51形成的原始波尔要求总体小于BPDE和4-NQO。部分原因可能是由紫外线损伤的nner活性引起的重组。36。综上所述，这些数据表明，PrimPol介导的再启动会为RAD 51在大量DNA加合物上加载而产生ssDNA间隙。
图5：PrimPol促进RAD 51聚焦点的形成，特别是对大量加合物的反应。a紫外线(UV-C)照射S1修饰DNA纤维的检测策略。b5J/m处理细胞S1修饰DNA纤维后的CldU/Idu比值2UV-C或模拟处理为(a)，在NOT或PrimPol siRNA存在下。线条代表着刻薄。4个重复的数据。c5J/m释放后>5个RAD 51病灶的细胞百分比2UV，在NOT或PrimPol siRNA存在下。模拟照射释放时间为3h。n=3。d5 0 NM4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO)处理后，在NOT或PrimPol siRNA存在下，RAD 51>5病灶的细胞百分比。DMSO释放1h。n=3。e在NONT或PrimPol siRNA存在下，2mm羟基脲(HU)作用24h后，RAD 51>5病灶的细胞百分比。n=3。f在非T或PrimPol siRNA存在下，2Gy电离辐射(IR)释放后EDU阳性细胞的百分率>10 RAD 51。模拟照射释放2h。n=3.源数据作为源数据文件提供。给出了至少三个独立实验的手段和扫描电镜(BAR)。星号表示p值(B的单向方差；单面学生的方差)。t-测试C-F，*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).
然后，我们调查了在DSB启动HR的条件下，RAD 51聚焦是否需要PrimPol。我们使用2mm Hu处理24小时，或2Gy的电离辐射(IR)，这两种处理都是通过叉式塌陷或直接诱导DSBs的。3。对于RAD 51负载不需要PrimPol作为对DSB诱导治疗的反应(如图所示)。5E，f)。同样，用500 NM BPDE治疗在叉状停滞后主要诱发DSB相关的HR(如图所示)。1E-g对500 NM BPDE(补充图)来说，RAD 51的负载不需要PrimPol。6C)。在500 NM的BPDE(补充图)中，PrimPol重新启动仍在发生.6d，E)，表明PrimPol介导的ssDNA间隙可以被引导到其他的间隙填充途径，如TLS。这一观察结果与有报道称高BPDE损伤负荷有利于TLS而不是HR的报道是一致的。7,8。缺乏PrimPol在DSB诱导重组中的作用符合RAD 51加载到切除的DSB末端的标准模型，这不需要任何重新启动。
PrimPol促进HR和姐妹染色单体交换
最后，我们研究了PrimPol介导的再启动是否需要支持整个HR通路的激活，从而导致基因重组。基因转换(Gc)和姐妹染色单体交换(Sces)都被认为是通过模板转换进行重组的可能产物。37,38。SCE的形成通常归因于倒叉修复，但根据某些模型，sces也可能产生于复制后的模板转换。38。我们首先利用报告细胞SW 480SN.3分析bpde诱导的重组频率，该细胞系含有scneo报告结构，可以通过gc或SCE检测重组。39。50 NM BPDE诱导了本报告的可测重组，在PrimPol耗竭后，这一重组率降低(图1)。6A，补充图。7A)。相反，没有证据表明PrimPol耗竭对BPDE治疗后的群体生存或亚G1期群体的百分比有影响，RAD 51缺失对生存的影响也很小(图一)。6B，补充图。7b)。在BPDE处理后，PrimPol耗竭也没有增加DSB的形成(补充图)。7C)。这与先前的发现一致，即缺乏PrimPol的人类细胞对uv引起的dna损伤并不十分敏感，这表明tls或fk回归等其他途径可以补偿。12,40。提示PrimPol介导的途径可能主要影响BPDE诱导的突变和/或基因组重排水平，而不是细胞毒性。我们进一步利用显微镜研究SCE诱导作为交叉分辨重组事件的读出。50 NM BPDE和50 NM4-NQO均能明显诱导SCE形成。6C-E)。为支持这一点，PrimPol损耗阻止了BPDE-和4-NQO-的SCE形成，但不影响在未损伤条件下观察到的SCES的自发诱导(图1)。6d，e).
图6：大量加合物诱导的同源重组需要PrimPol。aBPDE诱导SW480SN.3细胞的相对重组频率。用50 NM BPDE处理细胞20 min，加入NONT或PrimPol siRNA。n=4(PrimPol siRNA溶剂)nbBPDE作用20 min后U2OS细胞在NONT、PrimPol或RAD 51 siRNA存在下的集落存活分析。n=4(RAD 51 SiRNA)nc姐妹染色单体交换(SCE)检测策略和中期传播的代表性图片对50 NM BPDE或4-NQO的响应。标尺：10μm。d50 NM BPDE或溶剂在NOT或PrimPol siRNA存在下作用于U2OS细胞后的SCE形成。线条代表着刻薄。3个重复的数据。e用50 NM4-NQO或DMSO处理U2OS细胞后，在NONT或PrimPol siRNA存在下形成SCE。线条代表着刻薄。3个重复的数据。f大体积DNA加合物的重组模型。左：在PrimPol存在的情况下，重新启动会产生缺口，用于RAD 51焦点的形成和重组修复。为了简单起见，在间隙处的潜在TLS事件和重组不会导致姐妹染色单体的交换。右：在没有PrimPol的情况下，笨重的DNA加合物要么被TLS绕过，要么通过叉的回归和与另一个叉子的会聚来稳定停滞的叉。源数据作为源数据文件提供。给出了至少三个独立实验的手段和扫描电镜(BAR)。星号表示p值(单向方差分析，*)p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).
