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依赖于PrimPol的单链间隙形成介导大量dna加合物的同源重组

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发表时间:2020-11-20 11:42作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

RAD 51介导的同源重组(HR)可以重新启动和修复停滞的复制叉,但HR也可以在绕过障碍后进行复制后修复。庞大的DNA加合物是重要的复制障碍损害,但目前尚不清楚它们是在停滞的叉子上激活HR,还是在正在进行的叉子后面激活HR。以BPDE-DNA加合物为模型病变,我们发现哺乳动物细胞中大量加合物诱导的HR主要发生在DNA/RNA引物PrimPol复制后的间隙。RAD 51在这些条件下的招募并不是由于分叉延迟,而是发生在由PrimPol重新启动和切除由Mre 11和EXO 1形成的间隙。相反,RAD 51双链断裂加载不需要PrimPol。在大量加合物中,PrimPol促进姐妹染色单体交换和基因重组。我们的数据支持哺乳动物细胞中大量加合物的HR包括复制后间隙修复,并确定PrimPol在HR介导的DNA损伤耐受中的作用。

导言

在DNA复制过程中,细胞对DNA损伤的反应是维持基因组完整性和预防癌症发展的关键。环境暴露常常导致大量DNA加合物、致突变性和致癌性DNA损伤,对DNA复制叉造成强烈的物理障碍。如果不通过核苷酸切除修复(NER)去除,那么这些加合物在DNA模板上的存在就会抑制复制的聚合酶,有可能导致复制叉状停滞。如果停止运转的叉子不能重新启动,它们就会崩溃成dna双链断裂(Dbs),这是剧毒和/或致突变性的。叉折叠也能激活同源重组(HR)来修复。1,2.

HR蛋白,如RAD 51,也参与了失速叉子的重塑和重新启动。我们以前证明,复制抑制剂如羟基脲(Hu)至少可以诱导两种RAD 51介导的HR通路。失速的叉子需要少量RAD 51重新启动,而已塌陷成dsb的叉子的人力资源修复需要更广泛的RAD 51加载和RAD 51聚焦的形成。3。RAD 51在停止的叉子上的功能从那以后一直被链接到复制叉反转。4,通过防止Mre 11切除来保护叉子5,并通过与DNA POLα的相互作用促进连续复制。6。大量加合物的来源,如紫外线辐射或环境诱变剂苯并[a]芘-二醇-环氧化合物(BPDE)强烈诱导RAD 51病灶的形成和HR,提示这些病变停滞和塌陷叉。7,8,9。然而,巨大的DNA损伤也可以绕过DNA损伤耐受通路,避免分叉停滞。通过重新启动可以避免分叉延迟,例如PrimPol,一种最近被描述的rna/dna primase,它同时发挥dna/rna primase和dna聚合酶的活性。10并能在紫外线损伤后再灌注吗?11,12,13,14。损伤的DNA可以通过容易出错的跨损伤合成(Tls)被绕过,这种合成是通过增殖细胞核抗原(PCNA)的单泛素化促进的,或者是通过PCNA多泛素化促进的无错误损伤耐受途径,也可以是利用重组蛋白。

最后一个途径需要RAD 51,并涉及模板切换到未受损的姐妹染色单体。机械地说,模板转换仍然是很难理解的。有人建议直接在停顿的叉子上操作,使用叉子反转,或者在叉子后面的复制后间隙操作,而叉子本身则通过重新启动来继续工作。15。在出芽酵母中,有证据表明,再引发和复制后间隙填充优于叉形反转,这一途径已被证明涉及一个双Holliday连接类中间体。16,17。虽然自20世纪70年代以来就有人提出,在dna损伤处重新启动也会导致哺乳动物细胞重组,但据报道,叉形反转在哺乳动物的背景中是经常发生的。4,可能比重新启动更可取。

因此,一个长期而重要的机械问题是:RAD 51对于大面积病变的复制,在叉子处还是在叉子后面,最重要的是在哪里?观察到的大面积病变的HR活性是否发生在停止运转的叉子、倒叉或复制后间隙,所涉及的分子机制是什么?

为了解决这些问题,我们以BPDE-DNA损伤为模型,研究了大体积DNA加合物对人体细胞的HR诱导作用。与紫外线损伤一样,BPDE加合物与人类疾病密切相关。它们是由常见的环境致癌物苯并[a]芘(B[a]P)引起的。B[a]P是已知最有效的致癌物之一,广泛存在于烧烤肉类以及交通、工业、炉灶和香烟烟雾中。18,19。BPDE加合物引起吸烟诱发肺癌的特异性突变特征20,21。它们是nner的弱底物,未修复的加合物普遍存在于个体的dna中。22,23。Bpde加合物可以通过tls聚合酶以无错误和易出错的方式绕过。24,25。然而,与紫外线诱导的环丁烷嘧啶二聚体(Cpds)形成对比,当复制过程中bpde加合物的含量较低且与生理相关程度较高时,这主要是引起HR的原因。7,8。因此,BPDE加合物是研究大体积加合物HR的高度重组和优良的模型病变。1A).

图1:大量DNA加合物在没有复制叉状停滞或折叠的情况下诱导RAD 51病灶形成。

a低剂量BPDE诱导的DNA修复和损伤耐受通路原理图,在鸟嘌呤上形成大量的加合物。核苷酸切除修复;TLS:跨损伤合成;HR:同源重组。b1650 NMBPDE作用1h后,γH2AX(绿色)和复制叉(CldU,RED)在U2OS细胞中共定位。图像代表n=2.标尺:10μm。c高浓度BPDE释放后U2OS细胞中H2AX病灶>8γ的细胞百分比。n=3dBPDE诱导的RAD 51病灶。图像代表n=3.标尺:10μm。eBPDE浓度升高后U2OS细胞释放出>5个RAD 51病灶的百分率。n=3。f从BPDE释放后失速叉子的百分比。U2OS细胞经CldU脉冲标记,经BPDE处理后释放至Idu。n=4(1650海里)ngBPDE浓度升高后释放出>1053 BP1病灶的细胞百分比。n=3。h顶部:RAD 51和α-微管蛋白(负载控制)在U2OS细胞经RAD 51或非靶向(NOT)siRNA耗竭48h后的蛋白水平。图像代表n=2.底部:DNA纤维标记策略。i50 NM BPDE释放后失速叉子的百分比如下(h)NOT或RAD 51 siRNA作用细胞48h。n=3。j50 NM BPDE释放后,对照组或RAD 51缺失的U2OS细胞中有>10 53BP1病灶的细胞百分比。n=3.源数据作为源数据文件提供。给出了至少三个独立实验的手段和扫描电镜(BAR)。星号p-与溶剂相比的数值,除非另有说明(C,E,F,G的单向方差分析和Dunnett‘s试验;I,J,*的单面学生t检验)p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).

利用低浓度的BPDE是无毒和重组的,我们报告说RAD 51病灶的形成和HR激活响应于大量的DNA加合物,可以独立于复制叉的停滞或崩溃。在这种情况下,RAD 51被招募到复制后的单链间隙,这些间隙是由PrimPol的再启动活动和切除相结合产生的。我们的数据支持哺乳动物细胞中大量加合物的HR活性可能与复制后修复相关,并确定PrimPol在DNA损伤耐受中的作用。

结果

为了研究大体积DNA加合物的HR,用BPDE处理U2OS细胞20 min,然后释放到新鲜培养基中。治疗后,由于修复缓慢,BPDE病变持续时间超过24小时。26。我们检查了一系列的浓度,从低非细胞毒性(50 NM)到高剂量和细胞毒性剂量(500 NM和1.65M)(补充图)。1A)。BPDE诱导的磷-S 139组蛋白H2AX(γH2AX)病灶与5-氯脱氧尿苷(CldU)共同定位于正在进行的复制叉,支持治疗导致复制应激(图1)。1B).

然后我们开始量化BPDE对病灶的诱导作用。在所有的实验中,焦点在显微镜下被直接量化,在图中显示的图像是为了说明。γH2AX病灶在所有浓度的BPDE中都有相似的诱导,并持续了至少24小时,与无效的修复一致(如图所示)。1C)。RAD 51病灶分析显示,BPDE释放后数天可诱导HR。与以前的研究一致7,850 NM BPDE释放后RAD 51病灶阳性细胞百分比较高BPDE强(图1)。1D、e)。这些观察并不仅仅是由于细胞周期的改变,因为50 NM BPDE对细胞周期分布的影响很小,500 NM BPDE诱导S期而不是G1期阻滞(补充图1)。1B、C)。此外,50 NM BPDE(补充图)后,每个阳性细胞的RAD 51病灶数也明显增加。1D).

接下来,我们确定了BPDE治疗对复制叉减速和停滞的影响.这首先需要为DNA纤维分析开发优化的CldU和Idu双脉冲标记协议.我们最初使用第二个标签(Idu)添加了BPDE,以测量BPDE对复制叉进程的即时影响。只有非常高的BPDE浓度(1.65M)强烈减慢了复制速度(附图)。1E)。在BPDE孵育前后30 min,用CldU标记U2OS细胞,检测BPDE孵育过程中或治疗后停滞的分叉。然后用Idu清洗和标记细胞,以检测任何正在进行的叉子持续20分钟(如图所示)。1F)。停滞的叉子被定义为CldU轨道,而不是Idu轨道。根据我们以前的测量26,27,我们计算出,用50 nmBPDE处理20分钟,可诱导150个加合物/10。8碱基对。如果平均复制叉复制6×104碱基对28,约10%的叉子可能会遇到病变。然而,较高的BPDE浓度增加了叉状停滞,50 NM BPDE并没有导致失速叉的显著增加(图1)。1F)。类似的结果也得到了使用叉不对称作为叉子延迟的读数(补充图)。1F)。这表明,在这种情况下,复制叉可以在损坏的模板上继续进行。

我们以前曾报道过,RAD 51招募到停滞的叉子并不会导致RAD 51焦点的形成,相反,它需要叉式折叠成dsb。3。这就提出了用50 NMBPDE处理可引起DSB形成的问题。对DSB标记物53BP1病灶的分析和脉冲场凝胶电泳(PFGE)对DSBs的物理检测表明,50 NM BPDE诱发的DSB较少,而500 nm和1.65 mBPDE可诱导DSB的形成。1g,补充图。1g,H)。有趣的是,1.65MBPDE的高细胞毒性处理可能抑制γH2AX下游的DSB反应,因为PFGE检测到的DSB与RAD 51或53BP 1在这些条件下的诱导不一致。1E,g,补充图。)。综上所述,这些数据没有提供证据表明50 NM BPDE诱发的RAD 51病灶与DSB的形成有关。相比之下,500 nm BPDE诱发的RAD 51病灶与DSB的形成有良好的相关性(图1)。1E,g)。这就提出了低剂量BPDE治疗后RAD 51灶形成的机制和作用问题。

RAD 51是为了响应HU处理而促进分叉重新启动。3。相反,RAD 51的siRNA耗竭并没有增加释放后从低(50 NM)或高(1.65M)BPDE浓度释放后的叉状停滞水平(见图)。1H,I,补充图。2A)。RAD 51还能促进紫外线或甲基甲磺酸甲酯(Mms)引起的病变的分叉减速或停滞。29,30。然而,我们没有发现任何证据表明RAD 51在BPDE损坏的模板上促进叉子减速(补充图)。2B)。此外,RAD 51是修理倒塌的叉子和防止DSB积累响应胡。3。RAD 51耗竭对50 NM或500 NM BPDE诱发的53BP 1病灶水平无明显影响(图1)。1J,补充图。2C)。这些实验没有提供任何证据证明RAD 51是需要防止叉塌陷,或修复倒塌的叉子,以响应BPDE损伤。

初级波尔再引发促进大体积加合物的间隙形成

RAD 51加载启动HR需要形成长段ssDNA,最初被RPA包覆,然后被替换为RAD 51。RPA聚焦分析表明,在50 NM BPDE释放后,在没有叉状停滞或DSB形成的情况下,ssDNA迅速形成(附图)。)。BPDE释放后24~48h,RPA病灶消失(图1)。2A)。γH2AX病灶在BPDE释放后24~48h内也可得到解决,提示其主要标记为ssDNA(补充图)。2F)。RAD 51的缺失损害了BPDE诱导的RPA病灶的分辨力,提示RAD 51参与了BPDE诱导的ssDNA的修复。2A).

a非T-或RAD 51-siRNA处理的U2OS细胞在BPDE释放后有>10个RPA病灶的百分比。溶剂释放3h。n=3。bS1内切酶修饰DNA纤维分析原理图及DNA纤维标记策略。cS_1修饰DNA纤维在溶剂或50 nm BPDE处理的细胞中的CldU/Idu比值b)。S1:S1内切酶。线条代表着刻薄。3个重复的数据。dRAD 51介导的单链DNA缺口修复的原理图在复制阻断性病变重新启动后。ePrimPol和SMC 1蛋白水平(负载控制)在50 NM BPDE和溶剂(-)释放后6小时后,在U2OS细胞中的蛋白水平在PrimPol或非siRNA耗尽后48h。千吨级。代表.n=3。f在NONT或PrimPol siRNA存在下,50 NM BPDE释放后停顿叉的定量。n=3。g50 nm BPDE处理细胞S1修饰DNA纤维后的CldU/Idu比值b)NOT或PrimPol siRNA作用48h后。线条代表着刻薄。3个重复的数据。h顶部:野生型(WT)和Primase-Death(CH)PrimPol变异体的蛋白质结构域。底部:内源性PrimPol缺失和V5标记的PrimPol变异体的异位表达。iU2OS细胞经上述处理后,异位V5标记WT或CH PrimPol、内源性PrimPol(长时间暴露,通道1和4)和SMC 1(负载控制)的蛋白水平。代表.n=3(-Dox:WT和-Dox:CH)n=2)。j用或不含PrimPol shRNA的50 NM BPDE释放后停顿叉的定量和编码GFP(-)或WT或CH PrimPol的表达结构。纤维标记与(f) n=3.源数据作为源数据文件提供。给出了至少三个独立实验的手段和扫描电镜(BAR)。星号p-与溶剂相比的数值,除非另有说明(单面学生的)t-A,F,单边Mann-Whitney对C,G的检验;J,*的单向方差分析p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).

为了特别测试是否在持续的叉后bpde病变处形成ssdna间隙,我们使用s1内切酶(S1)修饰的纤维测定法。31。依赖于S1的dna断裂的ssdna间隙或缺口允许在新复制的dna中特异性地检测这些病变(如图所示)。2B)。DNA纤维标记后,在DNA纤维扩散和染色前,用重组S1核酸酶对细胞核进行渗透和处理。Idu脉冲被延长到50分钟,以便捕捉更多的事件,尽管这会导致CldU/Idu比值与基于标记时间的预期值相比较偏高(图1)。2C,补充图。3A,B)。然而,如果新生dna中存在ssdna间隙,S1诱导的dbs会进一步缩短idu标记的纤维,从而提高cldu/idu比模拟处理样品。50 NM BPDE的释放,但不是从溶剂中释放,导致S1处理比模拟处理样品中的CldU/Idu比值增加,支持在复制含有BPDE损伤的DNA时在叉后产生ssDNA间隙(见图)。2C)。综上所述,这些数据表明RAD 51参与了复制后修复,RAD 51焦点成核位点可能位于ssDNA远离正在进行的叉子的区域。我们假设这个ssDNA可能在复制后的间隙形成,通过重新启动大面积病变下游的DNA合成(如图所示)。二维空间).

因此,我们研究了在ssdna间隙形成中重新启动的潜在作用。最近有报道称,rna/dna primase primPol在紫外线损伤后能重新发挥作用。11,12,13,14因此,是促进ssDNA间隙形成的一个很好的候选者(见图)。二维空间)。我们用siRNA12在U2OS细胞中耗尽原核(图1.2E,补充图。)。我们首先测试了PrimPol再启动是否是导致叉子持续进展的原因,以及50 NM BPDE治疗后缺乏叉子延迟的原因。事实上,我们观察到,当PrimPol耗尽时,50 NM BPDE会引起叉状停滞(图1)。2F)。此外,PrimPol的缺失阻止了叉后的ssDNA缺口诱导,如S1核酸酶纤维法所测(图1)。2G,补充图。3D-F)。有一点要注意的是,在抑制NAR和碱基切除修复的条件下,我们也没有进行S1核酸酶纤维检测,这两种方法都能诱导ssDNA间隙,并有助于BPDE处理后S1纤维的缩短。然而,切除修复引起的间隙将独立于PrimPol发生,因此不会影响PrimPol耗竭的整体影响。

PrimPol同时具有DNA/RNA引物酶和DNA聚合酶活性10。为了测试在bpde存在的情况下,是否需要PrimPol引物酶活性来继续复制叉子的进展,我们进行了野生型(Wt)和primase死突变体(Ch)突变体primpool的体外表达的拯救实验。11,32(无花果)2H)。这些实验都是使用不针对异位结构的可诱导shRNA的u2OS细胞系进行的。7(无花果)2I),以及siRNA缺失,再加上siRNA抗性WT或CH突变体PrimPol的重新表达(附图)。第三代)。只有WT PrimPol,而不是CH PrimPol,才能拯救BPDE诱导的叉子失速,支持重新启动防止BPDE诱导的分叉延迟(图1)。2J,补充图。3H,I).

PRIMPOL重新启动和端部处理促进RAD 51加载

接下来我们研究RAD 51病灶的形成是否依赖于PrimPol介导的再启动和ssDNA间隙的形成。U2OS细胞中的PrimPol缺失可特异性地抑制BPDE诱导的RAD 51灶的形成,但不抑制自发RAD 51灶的形成(图1)。3A,b)。BrdU掺入证实,这不是由于细胞周期的变化或抑制DNA复制后的PrimPol耗尽(图一)。3C,补充图。4A)。进行中普里波尔用qRT-PCR(补充图)证实了mRNA在时间过程中的缺失.4B)。此外,在肺上皮性癌A 549和正常肺成纤维细胞mrc 5细胞中,还观察到RAD 51病灶的形成。普里波尔敲除MRC 5细胞(补充图)。4C-E).

图3:PrimPol介导的再启动促进RAD 51负载,以响应庞大的DNA加合物。

an=3.标尺:10μm。b50 NM BPDE释放后U2OS细胞在NONT或PrimPol siRNA存在时出现>5个RAD 51病灶的百分比。n=3。c代表细胞周期分布的释放后,从溶剂(1小时)或50 NM BPDE存在NONT或PrimPol siRNA。流式细胞术前用BrdU孵育30 min标记复制细胞。百分比是三个独立实验的平均值,如图所示。S4A. d50 NM BPDE释放后RAD 51>5个病灶的细胞百分比,有或不伴PrimPol shRNA缺失和表达结构编码GFP或WT或CH PrimPol。溶剂释放1h。n=3.源数据作为源数据文件提供。给出了至少三个独立实验的手段和扫描电镜(BAR)。星号p-数值(B的单边学生t检验或D的单向方差分析,*)p < 0.05, **p < 0.01).

接下来我们进行了拯救实验,以测试在BPDE存在下RAD 51病灶的形成是否需要PrimPol引物酶活性。PrimPOL缺失细胞中RAD 51病灶的形成可以被PrimPol WT的异位表达所挽救,但不能通过Primase死亡的PrimPol Ch突变体来挽救,这再次表明RAD 51病灶的形成需要重新启动的活性(图1)。三维空间)。用siRNA耗竭结合siRNA抗性PrimPol变体的表达获得了类似的结果(补充图)。4F).

离体实验表明,PrimPol在dna损伤下游的14个核苷酸附近重新启动。33。这样短的ssDNA缺口需要进一步切除核酸酶,如Mre 11和外切酶1(EXO 1),以便RAD 51病灶的形成(图1)。4A)。为了研究这些间隙的切除,我们使用了单分子分析的切除路径(SMART)。34。用BrdU处理细胞48h,用BrdU标记所有DNA。4B)。DNA纤维铺展,BrdU免疫染色,不进行酸变性,然后用显示延伸的ssDNA(图一)。4C)。BPDE治疗明显诱导ssDNA轨迹,这需要PrimPol和EXO 1(如图所示)。4C,d)。相反,依托泊苷诱导的DSBs的ssDNA轨道明显长于BPDE诱导的轨道,并且需要EXO 1,而不需要PrimPol(补充图)。5A)。这支持BPDE诱导的ssDNA轨迹不是由切除的DSB所致。为了进一步研究切除活性对BPDE诱导的ssDNA径迹形成的贡献,我们使用了Mre 11酶活性的化学抑制剂PFM 01(图11)。4E)。PFM 01治疗也减少了ssDNA轨迹的长度(如图所示)。4E,f),提示通过Mre 11和EXO 1切除进一步扩大初始短间隙。Mre 11和EXO 1的活性可能是促进ssDNA间隙切除的添加剂,但我们还没有进行测试。

图4:在PrimPol依赖的单链DNA间隙加载RAD 51需要dna末端切除。

aMre 11和EXO 1核酸酶活性及Mre11抑制剂PFM 01和MILIN靶向性的原理图。b顶层:单链DNA定量智能分析策略。底部:EXO 1和α-微管蛋白(加载控制)在U2OS细胞中的蛋白水平。图片来自n=1。cSMART分析50 NM BPDE或溶剂(-)在NOT(-)、PrimPol或EXO 1 siRNA存在下释放20 min后的单链DNA。图像代表n=3.标尺:10μm。dBPDE后SMART分析的量化c)。线条代表着刻薄。3个重复的数据。e使用Mre 11抑制剂(MRE11I)PFM 01和具有代表性的天然BrdU区域图像进行智能分析的策略。标尺:5μm。fMre 11抑制剂PFM 01存在或不存在时,50 NM BPDE 20 min释放4h后单链DNA的SMART分析。线条代表着刻薄。3个重复的数据。g在Mre 11抑制剂MILIN或PFM 01存在或不存在时,50 NM BPDE释放后有>5个RAD 51病灶的细胞百分比(e). n=3。h50 NM BPDE释放后,在NOT或EXO 1 siRNA存在下48h后,RAD 51>5病灶的细胞百分比。n=3源数据作为源数据文件提供。给出了至少三个独立实验的手段和扫描电镜(BAR)。星号表示p-值(D,G的单向方差分析,F的单面Mann-Whitney,H,*的单面t检验)。p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).

然后,我们利用Mre 11(分别为MILIN和PFM 01)的外显子和内切酶活性的化学抑制剂以及EXO 1的siRNA耗尽,研究了切除对RAD 51病灶形成的影响。Mre 11活性和EXO 1均为BPDE诱导的RAD 51灶形成所必需,支持PrimPol介导的HR起始包括切除(图1)。4G,h).

PrimPol还在UV和4-NQO加合物上促进RAD 51的加载。

为了探讨PrimPol再引发对其他大面积病变HR起始的相关性,我们用UV-C辐射诱导CPD和6-4光产物,并测定了PrimPol存在和不存在时对ssDNA间隙形成的影响(图1)。5A)。紫外-C辐射诱导了大量的s1内切酶敏感位点,在约150个加合物/10下,损伤密度将高于50 nmbpde。6碱基对35。当PrimPol耗尽引起模拟和UV-C辐照样品中的一些S1敏感位点时,在PrimPol耗尽后,S1敏感位点的UV特异性诱导减少(图1)。5B,补充图。6A,B)。此外,还需要PrimPol才能有效地形成RAD 51病灶,以响应UV-C诱导的大体积损伤,以及化学致癌物4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO)诱导的大量DNA加合物(图1-NQO)诱导嘌呤的大量加合物(图1)。5C,d)。UV-C后RAD 51形成的原始波尔要求总体小于BPDE和4-NQO。部分原因可能是由紫外线损伤的nner活性引起的重组。36。综上所述,这些数据表明,PrimPol介导的再启动会为RAD 51在大量DNA加合物上加载而产生ssDNA间隙。

图5:PrimPol促进RAD 51聚焦点的形成,特别是对大量加合物的反应。

a紫外线(UV-C)照射S1修饰DNA纤维的检测策略。b5J/m处理细胞S1修饰DNA纤维后的CldU/Idu比值2UV-C或模拟处理为(a),在NOT或PrimPol siRNA存在下。线条代表着刻薄。4个重复的数据。c5J/m释放后>5个RAD 51病灶的细胞百分比2UV,在NOT或PrimPol siRNA存在下。模拟照射释放时间为3h。n=3。d5 0 NM4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO)处理后,在NOT或PrimPol siRNA存在下,RAD 51>5病灶的细胞百分比。DMSO释放1h。n=3。e在NONT或PrimPol siRNA存在下,2mm羟基脲(HU)作用24h后,RAD 51>5病灶的细胞百分比。n=3。f在非T或PrimPol siRNA存在下,2Gy电离辐射(IR)释放后EDU阳性细胞的百分率>10 RAD 51。模拟照射释放2h。n=3.源数据作为源数据文件提供。给出了至少三个独立实验的手段和扫描电镜(BAR)。星号表示p值(B的单向方差;单面学生的方差)。t-测试C-F,*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).

然后,我们调查了在DSB启动HR的条件下,RAD 51聚焦是否需要PrimPol。我们使用2mm Hu处理24小时,或2Gy的电离辐射(IR),这两种处理都是通过叉式塌陷或直接诱导DSBs的。3。对于RAD 51负载不需要PrimPol作为对DSB诱导治疗的反应(如图所示)。5E,f)。同样,用500 NM BPDE治疗在叉状停滞后主要诱发DSB相关的HR(如图所示)。1E-g对500 NM BPDE(补充图)来说,RAD 51的负载不需要PrimPol。6C)。在500 NM的BPDE(补充图)中,PrimPol重新启动仍在发生.6d,E),表明PrimPol介导的ssDNA间隙可以被引导到其他的间隙填充途径,如TLS。这一观察结果与有报道称高BPDE损伤负荷有利于TLS而不是HR的报道是一致的。7,8。缺乏PrimPol在DSB诱导重组中的作用符合RAD 51加载到切除的DSB末端的标准模型,这不需要任何重新启动。

PrimPol促进HR和姐妹染色单体交换

最后,我们研究了PrimPol介导的再启动是否需要支持整个HR通路的激活,从而导致基因重组。基因转换(Gc)和姐妹染色单体交换(Sces)都被认为是通过模板转换进行重组的可能产物。37,38。SCE的形成通常归因于倒叉修复,但根据某些模型,sces也可能产生于复制后的模板转换。38。我们首先利用报告细胞SW 480SN.3分析bpde诱导的重组频率,该细胞系含有scneo报告结构,可以通过gc或SCE检测重组。39。50 NM BPDE诱导了本报告的可测重组,在PrimPol耗竭后,这一重组率降低(图1)。6A,补充图。7A)。相反,没有证据表明PrimPol耗竭对BPDE治疗后的群体生存或亚G1期群体的百分比有影响,RAD 51缺失对生存的影响也很小(图一)。6B,补充图。7b)。在BPDE处理后,PrimPol耗竭也没有增加DSB的形成(补充图)。7C)。这与先前的发现一致,即缺乏PrimPol的人类细胞对uv引起的dna损伤并不十分敏感,这表明tls或fk回归等其他途径可以补偿。12,40。提示PrimPol介导的途径可能主要影响BPDE诱导的突变和/或基因组重排水平,而不是细胞毒性。我们进一步利用显微镜研究SCE诱导作为交叉分辨重组事件的读出。50 NM BPDE和50 NM4-NQO均能明显诱导SCE形成。6C-E)。为支持这一点,PrimPol损耗阻止了BPDE-和4-NQO-的SCE形成,但不影响在未损伤条件下观察到的SCES的自发诱导(图1)。6d,e).

图6:大量加合物诱导的同源重组需要PrimPol。

aBPDE诱导SW480SN.3细胞的相对重组频率。用50 NM BPDE处理细胞20 min,加入NONT或PrimPol siRNA。n=4(PrimPol siRNA溶剂)nbBPDE作用20 min后U2OS细胞在NONT、PrimPol或RAD 51 siRNA存在下的集落存活分析。n=4(RAD 51 SiRNA)nc姐妹染色单体交换(SCE)检测策略和中期传播的代表性图片对50 NM BPDE或4-NQO的响应。标尺:10μm。d50 NM BPDE或溶剂在NOT或PrimPol siRNA存在下作用于U2OS细胞后的SCE形成。线条代表着刻薄。3个重复的数据。e用50 NM4-NQO或DMSO处理U2OS细胞后,在NONT或PrimPol siRNA存在下形成SCE。线条代表着刻薄。3个重复的数据。f大体积DNA加合物的重组模型。左:在PrimPol存在的情况下,重新启动会产生缺口,用于RAD 51焦点的形成和重组修复。为了简单起见,在间隙处的潜在TLS事件和重组不会导致姐妹染色单体的交换。右:在没有PrimPol的情况下,笨重的DNA加合物要么被TLS绕过,要么通过叉的回归和与另一个叉子的会聚来稳定停滞的叉。源数据作为源数据文件提供。给出了至少三个独立实验的手段和扫描电镜(BAR)。星号表示p值(单向方差分析,*)p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).

讨论

我们已经证明,在哺乳动物细胞中大量的dna加合物的dna复制过程中,在PrimPol的再启动活性所产生的单链间隙中,在没有停滞或折叠复制叉的情况下,HR激活可能发生(见图)。6f)。这一途径与DSB修复既有相似之处,也有不同之处。

先前的工作已经提出了在紫外线和顺铂病变中重新启动和PrimPol的作用。9,11,12,13,14,41。因此,预计在其他大面积病变中也会发生再起作用.然而,我们的发现解决了长期存在的问题,表明在庞大的dna加合物中,RAD 51焦点形成和姐妹染色单体交换(传统上与复制叉崩溃和dsb修复相关)与修复复制后间隙有关。此外,这些复制后的间隙是由PrimPol产生的,它对PrimPol在DNA损伤耐受过程中的作用有很大的影响。

大多数dna损伤或复制阻断治疗会导致叉子减慢和/或停滞,以及叉的逆转。4。因此,在大多数形式的复制压力下,RAD 51在这样的叉处所描述的功能可能是活跃的。然而,我们认为,除了叉反转,叉子重新启动和损坏叉子的修复,HR在复制后间隙构成了RAD 51在复制块响应中的另一个重要功能。其中几条途径之间可能存在竞争。最近有报道称,PrimPol斥责与复制叉逆转竞争,以应对顺铂的损害。41。本研究还表明,顺铂和紫外线作用24h后,PrimPol mRNA和蛋白水平升高,这有利于作为一种适应性机制的启动而不是叉子的逆转。41。然而,这种反应是针对BRCA 1缺乏背景的。41,我们的qrt-pcr数据显示普里波尔BPDE后24h在BRCA 1-熟练U2OS细胞中的mRNA表达(附图)。4B).

为什么这些复制后的空白被切除并导入HR,而不是简单地由TLS来填补?我们推测HR和TLS依赖的间隙填充可以在ssDNA间隙竞争。间隙切除可预防TLS,促进HR,但在高损伤负荷下,TLS可能优于切除。这将是很重要的,以破译PrimPol重新启动和大量加合物的存在是否和如何影响TLS和模板交换之间的路径决定。未来的工作可能包括研究PrimPol对PCNA泛素化的影响。

我们的数据与最近在出芽酵母方面的工作相一致,报告称叉状停滞损伤引起的检查点激活也发生在EXO 1切除的复制后间隙,而不是直接发生在叉子上。42。此外,EXO 1切除是PCNA多泛素化的下游,促进模板转换。提出了一种模型,该模型由3‘(上游)连接处的多泛素化PCNA和加载在5’(下游)结上的9-1-1检查点钳来刺激间隙的切除。43(无花果)6f)。BPDE诱导的间隙的长度将需要进一步的研究,以确定PrimPol是否能在远离病变的地方进行再灌注,以及/或是否进行远程切除。

观察到切除和RAD 51病灶形成的作用后,块状加合物的HR似乎更像DSB修复,而不是停滞叉处已知的HR功能。据推测,支持重组的活动可能专门被招募到后复制环境中。15。这可能促进RAD 51病灶的形成,而远距离切除可以支持更精确的同源性搜索。相对于停滞的复制叉,RAD 51聚焦体的形成可能受到抗重组螺旋酶活性的抑制。15和重建的可能性,例如,通过叉反转(图1)。6f).

另一个未回答的问题是dna聚合酶α(POLα)重新启动对HR的贡献。POLα单独负责酵母中GAP的形成,而酵母中缺少PrimPol。17。在哺乳动物细胞中,随着POLα不断地在滞后链上重新启动,而且可能也是主要链,人们预计最多一半的GAP和RAD 51焦点的形成是依赖于PrimPol的。然而,PrimPol的缺失几乎完全消除了BPDE诱导的RAD 51病灶的形成、重组和SCE形成,表明在病变诱发的HR事件中,50%以上都需要PrimPol。我们只能推测,POLα可能以某种方式抑制了哺乳动物细胞的大面积损伤,或者PrimPol可能通过与dna修复因子相互作用,或者由于它更倾向于合成dna引物而在促进HR的间隙中起着额外的作用。1244。这将是重要的,如果挑战,进一步调查如何通过PrimPol重新启动特别促进人力资源依赖的间隙修复。

虽然我们已经证明了PrimPol在UV、4-NQO和BPDE DNA加合物上启动HR,但是研究其他大体积的损伤或复制障碍是否能进入这一途径是很有趣的。例如,dna-蛋白质交联,使HR参与修复。45,46并导致模板转换47提出了PrimPol是否也能对这些病变起作用的问题。PrimPol还在R-环和二级结构形成序列上重新定位。48,49在这些背景下,人力资源可能至少部分依赖于PrimPol。测试PrimPol如何在其他复制阻断结构中促进重组是非常重要的。

了解大体积加合物诱导HR的分子机制对人体健康具有重要意义。我们建议,这将是特别有用的解释更近期的癌症基因组学数据。BPDE处理的细胞和肺癌都含有未知来源的插入和缺失突变(Indels)。这些都是由于易出错的tls引起的点突变。20,50。Indels可能来自与复制相关的HR,例如在重新启动分叉时。51,或由有缺陷的HR引起,如brca突变型癌症。52。因此,重要的是破译哪些HR路径实际上是由大量加合物诱导的。此外,HR基因中的基因变异BRCA 2RAD 52对肺癌的易感性53,54。在ssDNA缺口处研究这类基因变异对HR的影响是很重要的。一个普里波尔变异体也被认为在癌症中起着潜在的作用。55.


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