HER 2阳性乳腺癌II期随机试验对新佐剂trastuzumab和/或雷帕替尼的病理和分子反应(Trio-US B07)

在这项由赛诺菲和葛兰素史克资助的多中心、开放标签、随机第二阶段研究人员赞助的新佐剂试验(Trio-US B07，临床试验NCT 00769470)中，早期HER 2阳性乳腺癌患者(N=128)在整个肿瘤翻译研究网络中从13个美国肿瘤学中心招募。受试者随机接受trastuzumab(T)；N=34)，雷帕替尼(L)；N=36)，或两者兼而有之(TL；N作为HER 2靶向治疗，每一位参与者单独给予一个周期的这种指定的抗HER 2治疗，然后是6个周期的标准联合化疗与相同的抗HER 2治疗。主要目的是评估手术时三臂的病理完全反应(PCR)的发生率。在意向治疗人群中，T(47%，95%可信区间[CI]30-65%)和TL(52%，95%CI 38-65%)的PCR率相似，而L(25%，95%CI 13-43%)的PCR率较低。在T臂，100%的参与者在手术前完成了所有方案指定的治疗，而L臂和TL臂分别为69%和74%。肿瘤或肿瘤床组织只要有可能就会被收集到治疗前(N=110)，经过一个周期的HER 2-单独靶向治疗(N=89)，而在手术时(N=59)。较高水平的HER 2扩增和激素受体(HR)阴性状态与较高的PCR率有关.HER 2靶向治疗一个周期后，肿瘤、免疫和基质基因表达发生较大变化。与聚合酶链反应(PCR)率相比，含L臂在此时表现出比T更大的增殖抑制作用。一个周期的HER 2靶向治疗后，所有手臂的免疫表达信号增加，并随着手术时间的延长而再次下降。我们的结果为早期评估抗HER 2治疗的敏感性提供了依据，并阐明了免疫微环境在HER 2靶向药物反应中的作用。

虽然trastuzumab在很大程度上提高了HER 2阳性乳腺癌患者的无病生存率。1,2,3,4,5，大约四分之一接受过trastuzumab治疗的早期疾病患者在第一个十年中会复发，这表明治疗耐药性仍然是一个挑战。6,7。新辅助治疗后获得的病理完全反应(Pcr)似乎是与疾病相关的结果的替代指标，包括HER 2+或三阴性亚型的无事件生存(Efs)或整体生存(OS)。8,9。因此，新佐剂越来越多地被应用于有前途的新疗法的临床研究中。10。当加入新辅助化疗时，trastuzumab已被证明可以提高PCR率。11,12,13,14和EFS12。在HER 2高表达细胞株中观察到trastuzumab与口服HER 1/HER 2靶向酪氨酸激酶抑制剂雷帕替尼之间的协同作用。15,16HER 2+肿瘤异种移植模型17。临床上，使用雷帕替尼和trastuzumab的双重HER 2抑制对OS有明显的改善，而仅在转移的情况下则明显改善了OS。18,19。几种新佐剂试验比较了使用trastuzumab和lamatinib的双HER 2阻断方案与只使用trastuzumab或lamatinib的方案。20,21,22,23,24,25。所有的研究都显示，与trastuzumab相比，使用双HER 2-阻断技术的PCR率更高，只有两项。20,22差异有统计学意义。这些试验基于化疗主干、治疗顺序、HER 2指导治疗的持续时间以及PCR的定义不同，这可能部分地解释了这些相互矛盾的结果。

HER 2靶向治疗的这些试验和其他试验的翻译科学的一个主要目标是确定对治疗高度敏感的肿瘤，例如治疗可能会减少升级，以及那些具有原发性抗药性的肿瘤，在那里可能需要新的策略。HER 2靶向治疗反应的多种生物标志物已经从这些努力中涌现出来，但目前还没有经过验证的生物标志物能够准确地预测PCR以允许病人分层。雌激素受体(ER)表达降低26,27和较高的HER 2扩增或表达26,27,28与较高的PCR率有关。应用pam 50表达型内禀亚型，在含her 2靶向治疗方案后，分类为her 2富集固有亚型的肿瘤显示出较高的pcr率，而her 2+肿瘤则将其归类为其他固有亚型。26,27,29,30,31。有免疫激活证据的肿瘤(肿瘤浸润淋巴细胞[TILs])29,32,33免疫基因的高表达26,27,29,31,33)也有较高的PCR率。这些不同的响应签名相互关联，当使用多个签名时，可以提高预测PCR的能力。34如何独立地促进HER 2靶向治疗的敏感性或耐药性尚不确定。肿瘤在her 2靶向治疗中的变化也是未知的：一项关于trastuzumab和lamatinib联合治疗的研究表明，经过短期her2靶向治疗后，内禀亚型改变为正常亚型可能会预测pcr。30HER 2靶向治疗与内分泌治疗相结合，HR+/HER 2+肿瘤常转化为腔A亚型35。然而，迄今为止，很少有研究能够评估HER 2靶向治疗期间肿瘤细胞基因表达和微环境组成的变化。

在这里，我们报告了第二阶段随机新佐剂试验的结果，目的是评估与trastuzumab和/或lamatinib联合化疗的PCR率。在本研究中，肿瘤(或肿瘤床)样本被收集在治疗前，经过一个周期的HER 2靶向治疗(不进行化疗)，在完成HER 2靶向治疗后加上化疗。这些样本的组织病理学和表达数据可以评估生物标记物之间是如何相互关联的，并验证它们作为PCR预测因子的性能。重要的是，治疗中的活检也被用来评估这些生物标记物、信号通路和微环境成分在HER 2靶向治疗过程中的变化。

比较病理性完全反应(PCR)率

年龄18-70岁的女性，年龄18-70岁，患有Ⅰ-Ⅲ期单侧HER 2+乳腺癌，有资格接受肿瘤学(TRIO)-B07的翻译研究，注册为NCT 00769470(Www.clinicaltrials.gov)。该试验在美国的13个中心招收了参与者，第一名参与者参加了2008年12月22日的课程，最后一名参与者参加了12/20/2012年度课程；四年后注册结束，140名计划参与者中的130名结束。前20名参与者被分配给trastuzumab和lamatinib(TL)，接下来的110名参与者被随机分配到三种武器中的一种，每一种都有一个HER 2靶向治疗周期，分别是单用多西他赛和卡铂联合相同的HER 2靶向治疗：trastuzumab(T)、apatinib(L)、trastuzumab和lamatinib(TL)(Fig)。1)。两名参与者在开始任何治疗之前退出了研究，并被排除在有效性和安全性分析之外。在128名参与者中，25名在手术前完成了他们指定的学习治疗，但仍然完成了手术(10名L组，15名TL组)。一名参与者(L)未完成手术。所有128名参与者都参加了意图治疗(ITT)分析。基线特征(表)1)三个治疗臂之间平衡良好。患者年龄中位数为48岁(27~78岁)。激素受体阴性(HR−)56例(44%)，ER和/或孕激素受体阳性(HR+)72例(56%)。临床解剖Ⅰ期6例(5%)，Ⅱ期86例(67%)，Ⅲ期36例(28%)。

病理完全反应(PCR)是研究的主要终点，它被定义为乳腺内没有活的侵袭性肿瘤细胞，并在明确手术时检查腋窝淋巴结。ITT人群总PCR率为43%(95%可信区间(CI)34~52%)，其中T组47%(95%CI 30~65%)，L组25%(95%CI 13~43%)，TL组52%(95%CI 38~65%)。2)。使用两两比较(χ(2)L组PCR显著低于TL组(P<0.05)。p但T与L之间无显着性差异(P>0.05)。p=0.14)或T和TL(p=0.88)。在激素受体状态的探索性分析中，HR+肿瘤的PCR率低于HR-(分别为33%(95%CI 23~46%)和55%(95%CI 42~68%))。在HR−组中，L组与T组相比，差异无显着性(P>0.05)，而在HR+组中，L组与T组相比，差异无显着性。p=0.04)和TL(p=0.03)。

安全性和耐受性

总的来说，80%的参与者在手术前完成了所有方案指定的治疗：T组100%(34/34)，L组69%(25/36)，ARM TL组74%(43/58)。在含雷帕替尼武器中，22%的参与者因不良事件而停止新辅助治疗(8/36在L，13/58在TL)。另有5名患者在完成协议规定的治疗前因同意戒断而退出了研究(N=2升，N=1 TL)，进行性疾病(N=1，TL)，或不遵守(N=1，L)。各治疗组的相对剂量强度分别为：T组98%，L组85%，TL组86%。

没有人死亡，也没有发生充血性心力衰竭的报道。左室射血分数较基线下降>10%，低于正常下限5例(T 1例，L 2例，TL 1例)。最常见的≥3级AEs分别为疼痛(9%，19%，19%)，腹泻(3%，14%，28%)，中性粒细胞减少(12%，14%，14%)，贫血(9%，8%，7%)，低钾血症(6%，6%，9%)和感染(6%，14%，9%)。2).

肿瘤治疗前临床变量及亚型

所有分子分析在表达可评价队列中进行，它省略了没有活检或rna数量或质量不足的样本，包括110名接受治疗前肿瘤活检的参与者、89名接受her 2靶向治疗后进行治疗活检的参与者(与治疗前活检相匹配)和59名治疗后切除标本(与治疗前活检相匹配)。治疗武器、HR状况和PCR结果在表达可评估队列和总体队列之间的分布相似(补充表)。1).

我们首先检查治疗前，临床和基于表达的亚型与PCR之间的关系(图)。2A，补充表2)。HR-状态与较高的PCR率(OR)2.3(95%CI1.0~5.0)、强(3+)HER 2免疫组织化学染色(OR 11.9(95%CI2.1-304))和较高的HER 2荧光原位杂交(FISH)比率(HER 2拷贝数与着丝粒17拷贝数之比)有关。ß=0.13(95%CI0.01~0.26)。HER 2 FISH比值与PCR的相关性在HER 2 FISH比值很高的肿瘤中是由较高的PCR率驱动的：在HER 2鱼比<12的肿瘤中，8.6%的HER 2 FISH比率为85.7%，而在FISH<12的肿瘤中为39.2%，与HER 2 FISH比值无相关性(p=0.41)。

尽管HER 2扩增是根据ASCO-CAP 2007指南在当地确定的，但表达谱显示19个肿瘤(17.3%)的HER 2和其他基因在扩增子中的基线表达水平较低(log 10比<−0.10)(图10)。2B)。FISH对17例残留组织充分的肿瘤进行了集中检测，70.6%的肿瘤HER 2扩增，29.4%的HER 2未扩增。在低HER 2表达的肿瘤中，HR+占84.2%(16/19)，只有21.1%(4/19)有PCR，提示HER 2的低表达可能与HER 2缺乏反应有关。

利用激素受体以外基因的表达和HER 2本身的表达，乳腺癌可分为5个内在亚型(包括HER 2富集型)或11个整合亚型。36,37(包括IC5，占HER 2+肿瘤的大多数)。本征亚型已被证明与HER 2靶向治疗的反应相关。26,27,29,30。其中，56%的肿瘤为HER 2丰富的固有亚型，78%的肿瘤为IC5。在两种亚型中，HER 2亚型的PCR率均高于非HER 2亚型：HER 2亚型为50.0%vs33.3%(OR 2.0(95%CI 0.98~4.41))，IC5亚型为47.7%vs25.0%(OR 2.7(95%CI1.0~8.1))。分类为ic5而her 2富集的肿瘤的更大比例是由23%的ic5肿瘤分类为正常的类固有亚型所致，这种亚型可能包括高度非肿瘤细胞污染的肿瘤。30,38提示，与固有亚型分配相比，整合簇分配对肿瘤细胞的差异可能不太敏感。事实上，HER 2富集肿瘤的肿瘤细胞比例被定义为代表侵袭性肿瘤细胞的比例，高于正常肿瘤(17.7%比6.4%，双面肿瘤)。t-测试p=5.5e-6)，而IC5与其他综合集群之间无差异(15.5%vs 13.0%)，p=0.39)(附图。1).

因为HER 2和IC5肿瘤倾向于HR-(48.4%的HER 2富集肿瘤与33.3%的其他肿瘤)，χ2 p=0.16；48.4%的IC5对16.7%的其他p=0.0096)，并有较高的HER 2鱼类比率(平均HER 2鱼类比率7.4在HER 2-富集与5.8在其他方面，双面。t-测试p=0.050；7.5在IC5对4.2在其他，p=1.7e-5)，这些临床评估的变量在一定程度上决定了肿瘤亚型与PCR之间的关系。我们的基础多因素PCR模型包括节点状态、接受trastuzumab(ARM 1和3 vs ARM 2)、HR-状态和HER 2鱼比(肿瘤大小和患者年龄在单因素模型中与PCR无关)。实际上，当将内在亚型或综合亚型添加到该模型中时，它们并不显着，而原来的四个变量仍然存在(补充表)。3).

肿瘤预处理及微环境基因表达谱

为了评估治疗前肿瘤基因表达谱的变异性，我们计算了单样本基因富集分析(Ssgea)评分。3910套调控基因：肿瘤信号基因集(ESR 1)40，ERBB 240，以及扩散41)，一套免疫基因，被设计用来捕捉肿瘤中的免疫浸润(估计)42，已确定与HER 2靶向治疗反应相关的免疫基因集(Gepar76 To)。33泰夫43,44，以及N 983145)，一组被设计用来捕捉肿瘤间质浸润的基因集(估计)42，以及两个与乳腺肿瘤相关的间质瘤基因集(Desmedt和Farmer)。40,46(无花果)2C)。我们同样计算了38个与肿瘤过程和微环境有关的hallmark分子标记的ssGSEA分数。47(补充图。2)。Hallmark签名捕捉到了与策划签名相似的过程，有几个过程可能反映了微观环境组成的变化：例如，Hallmark上皮-间充质过渡(EMT)信号与乳腺癌间质信号相关(r=0.86-0.91)，Hallmark KRAS信号与免疫信号相关(估计)r这表明，每一种方法都记录了间质细胞或免疫细胞数量的相对变化，而不是肿瘤细胞之间的差异。

正如预期的，高度相关的雌激素信号与PCR相关，最强的是Hallmark雌激素反应早期信号(单因素Logistic回归分析)。p=0.0017)，包括HR+肿瘤(N=64，p=0.012)。ERBB 2通路(p=0.38)和扩散(p(=0.86)签名与PCR无关。基质信号与乳腺癌的治疗反应有关，包括HER 2+病。26,46，但在我们的队列中，间质标记与PCR之间没有相关性。这些结果与治疗臂或激素受体状态无关。乳腺癌间质信号具有良好的相关性(Pearson相关系数)。r=0.85)，与一般的间质签名不太好(r=0.56-0.76)。

免疫基因集紧密相关(r=0.81-0.90(估计数，Gepar76 to和Teff)。一个免疫签名(N 9831)与其他三个(r=0.53-0.80)，也与增殖呈负相关(r=−0.46)，提示其可能与肿瘤增殖和免疫浸润有关。较高比例的间质肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)分散在癌细胞间质中，并已被证明可预测HER 2+乳腺癌的治疗反应。32，则与更高的基于表达的免疫评分有关(>10%的−与≤的5%的双侧免疫评分分别为0.21和0.21)。t-测试p=1.2e-5(附图)3)。>10%间质TILs的肿瘤倾向于较高的PCR率(OR 2.3(95%CI0.9~6.3))，免疫评分较高的肿瘤则倾向于较高的PCR率。ß=1.5(95%CI−0.3-3.2)(补充表)2)。更高的免疫浸润预测更大的pcr的趋势是由含有trastuzumab的手臂驱动的，这与免疫系统对抗体trastuzumab的反应的作用可能比小分子抑制剂lamatinib更大的作用相一致。48(ß=3.2对TCH而言，ß=TCL的−0.5，以及ß=1.9用于TCHL；相互作用p=0.20)(补充表2)。重要的是，免疫基因标记与HR-状态密切相关，并与PCR密切相关：使用gepar76 to，HR阴性时的平均免疫评分为0.17，而HR阳性时的平均免疫评分为0.02(双面)。t-测试p=5.5e-4)。有趣的是，我们在HR+亚组观察到了与PCR相关的免疫浸润增加的趋势(ß=2.1(95%CI−0.4~4.8)(不是HR-亚组)，我们还发现ESR 1通路评分40HR+肿瘤与免疫浸润呈负相关(图一)。二维空间)。由于HR信号减少与免疫浸润增加密切相关，即使在HR+肿瘤中也是如此，因此两者之一或两者都可能导致HER 2靶向治疗的反应增加。

接下来我们使用Cibersort检测免疫细胞亚型在治疗前的流行情况。49和免疫国家50，每种方法都使用大量的基因表达数据来解除免疫亚群体的免疫功能。为了限制多重假设检验，我们研究了两种反褶积方法(血浆细胞、B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞、M0巨噬细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、肥大细胞和树突状细胞)中平均流行率最高的10种细胞类型。病理组织学上以淋巴细胞浸润为主(平均91.8%)，以巨噬细胞为主(平均48.8%)，CD4+T细胞(平均24.9%)和肥大细胞(平均22.4%)为补充图。4A，B)。用CiberSort，CD8+T细胞在HR肿瘤中的比例较高(双侧fdr调节)。t-测试p细胞亚型与聚合酶链反应无相关性(补充图)。4C，D)。用免疫状态分析，HR−肿瘤M1巨噬细胞比例较高(经调整)pHR+肿瘤NK细胞比例升高(经调整)p同样，也没有任何细胞类型与聚合酶链反应相关(补充图)。4E、F)。这两种免疫反褶积方法都具有较高的免疫含量，CD8+T细胞(Cibersort：r=0.43，按FDR调整p=3.2e-5，免疫国家：r=0.27，按FDR调整p=0.042)和M1巨噬细胞(CiberSort：r=0.27，按FDR调整p=0.47，免疫国家：r=0.53，按FDR调整p=2.39e-8)组分较高。这些免疫细胞亚型和总免疫含量在HR-状态分层时呈同一方向相关(附图)。5)。提示CD8+T细胞和M1(抗肿瘤)巨噬细胞可分别从其他免疫细胞亚群中浸润或排除在肿瘤中，HR-和HR+肿瘤中也有类似的免疫细胞浸润。

短期HER 2靶向治疗后全球基因表达的变化

接下来，我们对HER 2靶向治疗后2~3周收集的89个肿瘤的基因表达谱进行了检测，并将每一个肿瘤与其相应的治疗前对照进行了比较。我们观察到肿瘤表型的显着变化，短期靶向治疗在基于表达的亚型、基因标记和单个基因的水平上。

以病理组织学为基础的平均肿瘤细胞密度估计为治疗前的14.7%和治疗中的6.5%(双面配对)。t-测试p=9.3e-9)，值得注意的是，在评估的83例治疗活检中，有39%没有肿瘤存在。虽然缺乏细胞不太可能反映单一周期的HER 2靶向治疗后肿瘤组织的缺失，有趣的是，无癌的治疗活检对PCR有一定的预测作用(OR 2.5(95%CI 1.0-6.5))，表明肿瘤在治疗早期出现的生物学上的斑片状，虽然在我们的基础多变量PCR(补充表)中添加这个变量并不显着。3)，因为肿瘤的缺失在联合臂中更常见(χ2)。p=0.0079)。

半数以上(53.9%)的肿瘤在短期HER 2靶向治疗后改变了其固有的亚型，其中79.2%的肿瘤转变为正常的亚型(图1)。3A；补充图。6和7)。肿瘤亚型转化为正常型，至少部分原因是治疗时细胞减少：87.0%的活检组织中未确定为正常的肿瘤，而56.7%的活检组织被确认为肿瘤(χ)。2p=0.026)(附图。8)。与以前报道的不同30，转化为正常-样与PCR无关(34.2%vs 33.3%)，而且转换为腔A是罕见的，这表明内分泌治疗的加入可能驱动了这一转变在先前的研究35。在靶向治疗中，整合亚型比内在亚型更稳定，这可能是因为它对微环境的依赖性较小：25.8%的肿瘤改变了整合亚型(53.9%)，χ2。p=2.4e-4，其中82.6%转化为整合型9亚型(IC9，可能误诊为下细胞性肿瘤)。3A；补充图。6和7)。与固有亚型相似，转化为IC9与PCR无关(31.6%vs34.3%)。

我们评估了治疗前的相同特征，以产生肿瘤信号和治疗后微环境变化的全球图景。基因集富集分析(GSEA)51在47个标记(Teff-高排除仅3个基因)中，20个在FDR<0.1时增加，包括间质和免疫信号，15个减少，包括增殖、ESR 1信号和ERBB 2信号(图1)。3B；当只分析已知肿瘤存在的肿瘤子集时，这些结果是相似的(归一化富集分数的相关系数)。r=0.98)(附图。9)。然后我们使用ssGSEA评分。39对于每一个这些特征来量化每个肿瘤治疗过程中每个信号的变化程度。许多变化的签名彼此密切相关(如图所示)。3C)，但有三种类型的变化在很大程度上是不同的：增殖减少，免疫成分增加(r=−0.19之间的PAM 50增殖和免疫评估评分，p=0.069)，基质成分增加(r=−0.15之间的农民基质和PAM 50增殖评分，p=0.17；r=0.39之间的农民基质和免疫评估分数，p=1.2e-4)。而各种免疫特征紧密相关(图一)。3C)，我们使用了未来的免疫评估基因集，因为它被设计为以一种不偏倚的方式捕捉肿瘤的整体免疫浸润，而Gepar76 to和Teff高基因集被设计用来预测反应。

ERBB 2和ESR 1信号与免疫浸润和间质浸润均呈反相关关系，因此很难确定其所观察到的信号减少是否仅仅是由于相对于其他细胞类型(ERBB 2和ESR 1信号较少)肿瘤含量降低所致，或者肿瘤细胞在治疗后是否独立地经历了这些通路的激活减少。我们通过免疫评估和Farmer间质瘤评分建立了一个预测ERBB 2(或ESR 1)信号的线性模型，发现ERBB 2信号与预测的ERBB 2信号相关。r小于观察到的ESR 1信号与预测ESR 1信号(0.69)的相关性(补充图)。10)。用IHC评估治疗前后ER蛋白表达的变化N=73)，我们没有观察到治疗后组织化学评分(H-记分)下降(相反，有ER表达增加的趋势：治疗前为60.2，治疗前为69.5，双面配对)。T-试验p治疗后H评分与治疗前H评分密切相关(r=0.83)(图1。三维空间)。IHC的结果表明，在全球范围内观察到的ESR 1信号的明显减少实际上是由于微环境组成的变化，而不是肿瘤细胞本身的变化。相反，在一项平行的研究中，对这一队列进行的原位蛋白质组学分析表明，HER 2靶向治疗14-21天后，肿瘤细胞中的ERbb 2蛋白水平确实下降了。52因此，虽然总样本中免疫和基质成分的增加可能有助于减少全球基因表达中的ERBB 2信号，但肿瘤细胞本身也显示ERBB 2表达减少。

四大类改变(增殖、免疫、间质和ERBB 2信号转导)与PCR(补充图)无关。11)，与以前的报告形成对比53,54以及这个队列中的蛋白质数据52治疗中的免疫浸润，无论用免疫评分还是间质TILs来评估，都不能比治疗前的免疫浸润更有预见性(附图)。12)。HR状态下签名的变化也没有差异(补充图)。13)。然而，两种签名在ARM上有显着性差异(fdr<0.1，根据12种假设进行调整)：间质信号随L的增加多于T(fdr调整的双面信号)。t-测试p=0.078)，有TL中间体，Tl的增殖特征比T(fdr调整后)的下降幅度更大。p=0.078)，L中间(图1)。3E)。为了证实这些变化发生在肿瘤细胞中，我们检查了Ki 67 IHC，再次指出TL对细胞增殖的抑制作用最大，其次是L，其次是T：Ki 67百分率的几何均值在治疗过程中从29.8%变化到11.4%。N=25；p=0.0016)，从23.8%增加到17.3%(N=21；p=0.13)，T值从25.9%到23.1%(N=21；双面配对t-检验log2Ki 67值p=0.17)(图1。3F).

重要的是，虽然增殖和基质信号因治疗臂的不同而不同，但免疫标记没有变化(补充图1)。11)；由于缺乏对照臂进行反复活检而不进行干预治疗，因此不可能确定所观察到的免疫变化与HER 2靶向治疗或重复活检有关。事实上，我们注意到血红蛋白亚单位(HBA 1、HBA 2和HBB)是从治疗前到治疗前增加的前1%的基因，很可能反映了活检的影响。而血红蛋白亚单位表达的增加与免疫表达的增加无关(r在HBA 1表达与免疫评估评分之间，观察到的免疫改变可能与治疗本身无关。

HER 2靶向治疗和化疗的微环境变化

在完成联合化疗和HER 2靶向治疗后，在手术中收集59例肿瘤或肿瘤床标本，并与HER 2靶向治疗14~21d后的标本相比，其基因表达情况与其相应的治疗前组织进行比较。在这59例手术标本中，25例肿瘤进行了PCR，无肿瘤残留。对于子集(N39)对用于基因表达分析的手术切除区域的组织病理学进行了重新评估，其中73%的非PCR病例在分析样本中没有发现肿瘤的证据。因此，不能评估联合化疗和HER 2靶向治疗后肿瘤的变化，我们重点分析了在肿瘤床上观察到的免疫和基质变化。

与GSEA治疗前相比，在手术时评估相同的47个基因集(如图所示)。4A细胞增殖减少，ERBB 2信号转导减少，ESR 1信号转导减少，肿瘤含量降低。总体而言，her 2靶向治疗、联合化疗和her 2靶向治疗后GSEA归一化富集评分之间的相关性为：r=0.68。主要区别在于间质和免疫标记(图一)。4B)。四个基质特征(估计)42、hallmark emt和两个乳腺癌特异性间质信号。40,46)与HER 2单独靶向治疗同步增加；然而，化疗后，非乳腺癌信号仍然升高，而乳腺癌间质信号骤降，可能是因为这些信号捕获了与活性肿瘤间质相互作用相关的基因表达，或者受到化疗的不同影响。

免疫特征与乳腺癌特异性间质信号相似，单独HER 2靶向治疗后增加，但与HER 2靶向治疗联合化疗后减少。重要的是，这一结果不同于在平行研究中对这一队列进行的原位蛋白质组分析。52与治疗前相比，手术时免疫细胞增多。这种差异很可能是因为外科手术标本中的肿瘤细胞密度很低，通常为零，这与另一种福尔马林固定石蜡包埋核心的原位蛋白质组学分析所用的肿瘤浓缩策略形成了对比：大的肿瘤床组织很大程度上是一种免疫沙漠，而局部免疫细胞浸润则继续发生在肿瘤细胞岛附近。事实上，组织病理学数据支持这一假设(图)。4C)。根据定义，间质TIL在HER 2靶向治疗14-21天后略有增加(从9.9%增加到12.7%，双面配对)。t-测试p在14例有非零细胞的肿瘤中，无论是治疗前还是手术时，联合化疗和HER 2靶向治疗均稳定(8.5%vs9.5%，双面配对)。t-测试p=0.70)，与肿瘤所在部位的持续免疫浸润相一致。当我们评估整个幻灯片中的炎性细胞，包括没有肿瘤存在的样本时，趋势与表达数据一致：治疗中炎症细胞增加(从6.1%增加到8.0%，双面配对)。t-测试p手术时炎症细胞减少(从5.9%减少到3.5%，双面配对)。t-测试p=0.16)。

我们用了Cibersort49通过HER 2靶向治疗和化疗来解除免疫浸润的成分(如图所示)。4D)。Cibersort绝对分数从治疗前(平均0.55分)增加到治疗前(0.60分；双面配对)。t-测试p在手术时恢复到基线水平(平均0.54；p=0.53 vs.经过14-21天的HER 2靶向治疗，与治疗前相比，三个最显著的变化是血浆细胞减少(14.8%至9.7%，双面配对)。T-测试fdr-调整p=6.6e-8，M1巨噬细胞减少(10.2%至7.7%)，经FDR调整p=1.3e-5，CD8+T细胞增加(5.2%至8.3%，经FDR调整)p-2.5e-4)在联合化疗和her 2靶向治疗后手术时，与治疗前相比，最大的两个变化是m1巨噬细胞减少(11.0%至5.2%，fdr调整后)。p=5.0e-11，NK细胞增加(4.6%至7.4%，经FDR调整后)p=9.4e-8)。虽然采用另一种免疫反褶积方法，每种细胞类型的比例有很大的不同，但免疫状态50(无花果)4D)，经HER 2靶向治疗后，CD8+T细胞增加(FDR调节)。p=1.2e-9)，联合化疗和HER 2靶向治疗后，m1巨噬细胞减少(FDR调节)p=5.0e-4)和NK细胞增加(FDR调整后)p=2.8e-7)。

在本临床试验中，在新辅助化疗中，雷帕替尼加曲妥珠单抗并没有提高PCR率，而忽略曲妥珠单抗则PCR率较低(TCL为25%，TCL为47%，TCHL为52%)。其他试验也表明，trastuzumab的抗肿瘤活性优于雷帕替尼。20,21,27,55,56。联合使用trastuzumab和lamatinib的好处就不那么明显了。新阿尔托20结果显示，紫杉醇+雷帕替尼和trastuzumab治疗12周后，与一种HER 2靶向药+紫杉醇(NSABP B-41)相比，PCR率有显著提高。21和CALGB 4060127与Trastuzumab加化疗相比，双HER 2靶向治疗并没有显示出这样的改善。与其他研究相比，NeoALTTO的化疗疗程较短，可能是造成这种差异的原因之一。然而，每一项研究都显示，与单剂HER 2靶向治疗相比，Lapatinib和trastuzumab的PCR率都有数字增长，而在本研究中，当比较TCH(47%)和TCHL(52%)时，PCR率非常相似。值得注意的是，在TRIO B07中，与含雷帕替尼武器的参与者相比，参加TCL的参与者(100%)能够在手术前完成所有方案指定的治疗(TCL的69%和TCHL的74%)。另外，给TCH患者的平均相对剂量强度(98%)高于使用含雷帕替尼武器的患者(85%TCL和86%TCHL)。含雷帕替尼武器的剂量减少是由于雷帕替尼相关毒性所致，可能是导致手术时抗肿瘤活性下降的原因之一。

在三组B07中，尽可能采集新鲜冷冻和福尔马林固定石蜡包埋的组织标本，分别于治疗前、单独HER 2靶向治疗14至21天后和联合化疗与HER 2靶向治疗完成后进行手术。这些来自同一患者的系列标本允许评估肿瘤敏感性和耐药性的多个潜在生物标志物，以及这些生物标志物之间的相互关系以及它们在整个治疗过程中的变化。和以前的研究一样26,27,29,30我们发现，与其他固有亚型相比，被归类为HER 2丰富的固有亚型的肿瘤有更高的PCR率的趋势。在本研究中，我们还评估了整合亚型。36,37，与其他整合亚型相比，IC5中PCR的检出率更高。这些乳腺癌亚型与应答的关系似乎至少部分是通过her 2的高扩增和herr 2和ic5亚组中HR表达的降低而介导的，这与另一种报道一致，即当ESR 1和erbb 2的表达被纳入多变量分析时，固有亚型不再与PCR相关。27。在HER 2+肿瘤中，HER 2扩增水平可能无助于预测哪些肿瘤将受益于trastuzumab。57,58，但它可能有助于识别对trastuzumab非常敏感的肿瘤，从而为降级治疗提供依据。与HR信号密切相关的治疗前免疫浸润指标对预测PCR有一定的价值，尤其是在HR+肿瘤中，尤其是与trastuzumab治疗(而非雷帕替尼)有关。

我们在HER 2靶向治疗中发现了大量的表达变化，包括减少增殖，增加免疫细胞浸润，增加间质信号，以及减少ERBB 2信号。我们同样观察到在治疗过程中内在亚型的变化率很高，一般是正常的，而一体化的亚型则更稳定。有趣的是，单用trastuzumab可减少增殖，以双HER 2治疗效果最好。观察到雷帕替尼在抑制增殖方面可能比曲妥珠单抗更有效，这对机会研究之窗有着重要的意义，因为在短期治疗后，肿瘤的增殖会被检查，以评估疗效。机会之窗研究主要用于评估内分泌治疗，但也越来越多地应用于其他靶向治疗。59,60,61,62。我们的结果表明，当比较两种治疗方法时，在PCR和存活方面更有效的方法(这里是trastuzumab)可能实际上会导致相应的或较小的增殖减少。的确，随着雷帕替尼的增加，细胞对化疗效果的敏感性降低，从而降低了PCR率，这是合理的。这也是合理的，拉帕替尼诱导更直接的变化肿瘤细胞，但trastuzumab使他们更免疫原性。值得注意的是，我们观察到，与trastuzumab相比，Lapatinib的间质信号有更大的增加，这可能与lamatinib与间质室的独特相互作用相一致。63，但免疫标记在所有手臂上都有类似的增加。由于这项研究不包括控制臂，参与者在没有介入治疗的情况下接受治疗活检，因此我们不能排除观察到的治疗中的免疫浸润与重复活检有关。64而不是HER 2-靶向治疗本身。然而，我们注意到，在平行的原位蛋白质组研究中，观察到的免疫浸润程度的差异与聚合酶链反应有关。52说明免疫浸润治疗具有生物学意义。

我们在her 2靶向治疗14-21天后观察到的免疫特征增加，特别是CD8阳性T细胞的增加，随着手术时间的延长而消失，这可能是因为手术时的样本基本上没有肿瘤，这与肿瘤富集和原位蛋白质组分析的结果形成对比。52。联合化疗和HER 2靶向治疗也与NK细胞的相对增加有关，类似于蛋白质组数据所观察到的情况。52，M_1样(抗肿瘤)巨噬细胞相对减少。M1巨噬细胞信号的丢失是否与肿瘤细胞本身有关，在肿瘤细胞旁易燃可能类似巨噬细胞浸润。65，或在HR+/her 2−乳腺癌化疗中，巨噬细胞表型向肿瘤前状态转移。66，仍有待确定。这些免疫细胞亚群的改变可能会影响免疫干预的最佳时机，而对CD8阳性T细胞活性的操纵可能对化疗前HER 2靶向治疗最有用。

在HER 2靶向治疗14-21天后，我们在肿瘤中观察到的许多表达变化中，没有一种可以预测PCR，而不是在同一队列中进行原位蛋白质组分析。52。值得注意的是，许多正在治疗中的肿瘤标本没有或非常低的肿瘤细胞，反映了现实世界的活检条件，但潜在地掩盖了重要的生物学差异。此外，肿瘤内反应的异质性和RNA信号与肿瘤表型的相关性差，可能有助于单次活检的大量RNA谱是定量比较治疗变化的次优方法。因此，虽然我们的工作确定了HER 2靶向治疗前后化疗所发生的变化，但需要更多的方法来识别这些变化中可能预测治疗敏感性或耐药性的相关生物变异性。本试验中组织的均匀收集--新鲜冷冻和福尔马林--固定石蜡包埋--使得这些问题可以利用各种新技术进一步探索。未来的研究也将受益于纵向取样，包括在治疗的活检，以及统一的组织收集和储存，这样迭代学习是可能的，从最初的特征。

病人

参与者是在加州大学洛杉矶分校(加州大学洛杉矶分校)(包括在圣莫尼卡、巴伦西亚、加利福尼亚大学西湖和帕萨迪纳的卫星诊所)和另外12个美国网站招聘的，这些网站是通过肿瘤学翻译研究(Trio)--美国网络(Bakersfield、Fullerton、Redondo海滩、内陆山谷、Santa Maria、Orlando(佛罗里达)、Santa Barbara(2个站点)、拉斯维加斯、Olive View、好莱坞(佛罗里达)和San Luis Obispo)招聘的。年龄在18至70岁之间的妇女，如果她们有≤1和解剖I-Ⅲ期单侧HER 2阳性乳腺癌的ECOG表现状态，则有资格。两名70岁以上的妇女(年龄分别为76岁和78岁)被登记，但有礼仪例外。HER 2状态由当地评估的原位杂交(FISH或SISH)检测确定，并采用2007年ASCO-CAP指南，要求HER 2与CEP 17>2.2的比值或HER 2拷贝数平均大于6个信号/核。有关于ISH检测类型的不缺失信息的肿瘤(N89.7%使用鱼类，10.3%使用SISH。Ⅰ期患者需肿瘤大小为1cm，年龄小于36岁，肿瘤分级为≥2，或激素受体阴性(HR-)肿瘤。炎性乳腺癌被允许。充分的肾、血液学、肝脏和心功能(左室射血分数(LVEF)≥正常下限)。

排除标准包括：目前诊断为侵袭性或非侵袭性乳腺癌的事先接触化疗、放射或内分泌治疗、对同侧乳腺或胸壁的任何先前放射治疗、过去5年内任何其他恶性肿瘤的病史(除非黑色素瘤皮肤癌或子宫颈原位癌外)、先前存在的≥2级运动或感觉神经病变、预先存在的心脏病、需要积极治疗的慢性腹泻、需要肠外抗生素的并发感染、转移性乳腺癌、目前使用卵巢激素替代疗法的治疗或任何选择性雌激素受体调节剂目前的治疗。孕妇或哺乳期妇女被排除在外，有生育潜力的妇女需要避孕。

以下机构审查委员会批准了该研究方案：加州大学洛杉矶分校、橄榄树视图和西部。斯坦福大学的机构审查委员会也批准了分子分析。这项研究是根据良好的临床实践指南和地方法律法规进行的。在执行任何研究相关程序之前，每个参与者都签署了机构审查委员会批准的知情同意书。这次审判登记为NCT 00769470Www.clinicaltrials.gov.

研究设计、治疗和评估

TRIO B07是由肿瘤翻译研究(TRIO)研究小组进行的一项随机、多中心、开放标签的、三臂Ⅱ期研究。根据基础肿瘤大小(≤3cm和>3cm)和激素受体状态(HR+vs HR−)进行分层。随机化采用随机排列块设计，块大小随机变化在3~6之间。研究统计员产生随机分配序列。三名联络协调员登记了与会者，并将他们分配到干预部门。研究包括三个治疗组(武器1-3)。所有受试者每3周接受一次多西他赛加卡铂(TC)治疗。此外，ARM 1的参与者接受trastuzumab(TCH)，ARM 2接受lamatinib(TCL)，ARM 3同时接受trastuzumab和lamatinib(TCHL)。符合条件的参与者最初接受HER 2靶向治疗，不进行化疗(雷帕替尼口服剂量为1000毫克，口服21天和/或曲存扎布8毫克/千克，每次一次)，然后每三周给予HER 2靶向治疗加多西他赛和卡铂6个周期。6个化疗周期为伴发多西他赛(75 mg/m)。2(Iv)卡铂(AUC)6mg/mL/min血药浓度曲线下面积加曲妥珠单抗(6mg/kg IV)或雷帕替尼(1000 mg/d)，口服1~21天，或分别服用曲妥珠单抗和雷帕替尼。每个化疗周期后，参与者均需接受原代预防性白细胞生长因子治疗。治疗在所有规定的治疗方案完成后停止，疾病进展，不可接受的毒性，必须停止研究药物，或退出参与者的同意。在整个研究过程中进行安全性评估，从第1天到研究结束，治疗访问结束，手术后28天，或停止研究的时间。毒性分级采用NCI不良事件共同毒性标准(CTCAE)，3.0版。手术前不超过7个周期的trastuzumab和/或lamatinib(治疗周期和6个化疗周期)，TC化疗周期不超过6个周期。在第六个周期化疗后，被认为是外科候选人的参与者进行了护理标准的乳房手术和腋窝淋巴结取样。我们注意到，在一个开放标签的临床试验中，有潜在的选择偏见，因为参与者可能会选择退出，如果被随机地分配到他们认为相关的一个手臂与较少的利益。这可能导致治疗臂患者的测量/未测量基线特征不平衡。另一个潜在的偏差来源是由于方案的毒性，早期停止在手臂。这可能会影响PCR率以及相关的生物标志物分析。

为了测试TCHL的安全性，前20名参与者被分配到ARM 3。在打开扩张之前，对前20名参与者进行联合治疗的安全性分析。其余受试者被随机分为三组(1：1：1)。前6名参与者参与了卡铂的剂量提升评估(前3名参与者AUC为5 mg/mL/min，接下来3名为AUC 6 mg/mL/min)加多西他赛(75 mg/m)。2)、曲库单抗(6 mg/kg)和雷帕替尼(1000 mg/d)。多西紫杉醇和卡铂按机构惯例注射标准类固醇和抗呕吐预防。毒性治疗可推迟至21天。当一个循环进行毒性时，所有药物都保持同时给药。卡铂(AUC 5)和多西他赛(60毫克/米)的剂量延迟和减少。2)毒性，包括血液学、肝脏、神经系统和胃肠道毒性。Trastuzumab不允许减少剂量，但允许剂量延迟。剂量延迟和减少(750毫克/天)是允许雷帕替尼相关腹泻和中度至严重的皮肤反应。

所有参与者在化疗的第3周期后，对心功能进行评估，包括通过多次门控获取(MUGA)或超声心动图(超声心动图)测量左室射血分数(LVEF)。<28天的手术，视需要而定。对症状性充血性心力衰竭(CHF)或左室射血分数(LVEF)明显下降(低于基线左室射血分数(LVEF)>10分，低于正常人的体制性下限)的患者，应永久停止使用trastuzumab和(或)雷帕替尼的治疗，并在大约三周内进行第二次LVEF评估。

结束学习访问发生在手术后28天，或因任何原因退出/停止学习的时间。在研究结束后，所有参与者都可以在治疗医生的自由裁量权下，按照照护标准接受治疗(辐射、内分泌治疗、维持治疗)。在基线、每个治疗周期之前以及在所有规定的治疗方案完成时，通过体格检查进行临床肿瘤评估。如有临床表现，可进行放射学评估以排除大转移。

端点和统计分析

主要目的是通过评估总PCR率来评估每只手臂的临床疗效，即在明确手术时，乳腺癌和腋窝淋巴结中没有可行的侵袭性肿瘤细胞(ypT0/is ypN0)。肿瘤PCR率被确定为治疗意向(ITT)人群(包括所有接受研究药物的参与者，无论他们是否完成了所有方案指定的治疗)和可评估的参与者(仅包括那些完成了协议规定的术前治疗并接受了明确的乳房手术的参与者)。对于所有接受至少一剂研究药物的研究参与者，无论参与者是否完成了指定的治疗，都对来自权威外科手术的病理报告进行了集中审查。

在文献的基础上，对单剂生物制剂(Trastuzumab)联合多药化疗的PCR率估计为40%。11,67,68,69。抽样的56人被要求检测绝对20%的PCR率之间的实验治疗(假设60%的PCR率)和历史对照PCR率(约40%)，具有名义上的单向0.05显着性和90%的力量使用确切的二项法。70。在R.

作为二次疗效分析，采用卡方检验对两组武器进行PCR检测，结果表明，双侧I型错误率为20%。有60名参与者在联合臂和40名参与者在单一生物手臂，这项测试将有75%的力量来测试40%和60%的两臂之间的差异(TCL或TCL对TCHL)。71。另一个探索性配对比较联合组TCL和TCL对TCHL将以类似的方式进行。

次要终点包括安全性和耐受性，包括CHF发生率或LVEF显著下降(高于基线10%，低于正常的机构下限)。对接受任何一种研究药物的全部或部分注射的所有参与者进行了安全性分析。描述性统计用于总结不良事件的数量和类型。用x-平方法对不良事件进行比较。χ(二)测试。

由于前20名妇女被纳入ARM 3，而不是随机选择，排除这20人后也进行了病理完全反应(PCR)的探索性分析。对于这些分析，总的PCR率再次为43%(46/108)，而ARM 3为55%(21/38)，而前20例为52%。再次进行比较，发现ARM 2的PCR明显低于ARM 3(p武器1和2之间没有显著差异(p=0.07)或武器1至3(p=0.47)。

在对可评价人群进行预定向分析时，武器1、2和3的PCR分别为47%(16/34)、28%(7/25)和49%(21/43)。在这组分析中，使用卡方进行的配对比较中没有一项是显着的.用Logistic回归调整HR状态和肿瘤大小的分层因素(≤3cm与>3cm)，在比较ARM 2和ARM 3时，有显着性差异(P<0.0 5)。p=0.04)，但第1臂至第2臂(p=0.10)或第1至第3臂(p=0.88)。

基因表达谱

肿瘤组织在接受雷帕替尼和(或)trastuzumab(预处理样本)的运行周期之前和在运行周期开始后14-21天(在治疗样本)之前通过核心活检获得。每个时间点至少进行4次核心活检，每次14针，其中3次立即冻结，第4次采用福尔马林固定石蜡包埋法(Ffpe)。用RNeaseMiniKit(前根，巴伦西亚，CA，美国)提取RNA，用纳米滴一号分光光度计(美国威明顿，威明顿，温-费希尔)进行定量，用毛细管电泳(AgilentTechnologies，SantaClara，美国)对质量(RNA完整性数，RIN值≥5)进行鉴定。采用快速AMP标记试剂盒(Agilent Technologies)对RNA样品进行了氰化物5-CTP或菁3-CTP(Perkin Elmer，波士顿，MA，美国)标记。标记RNA在RNasy柱(前根)上纯化。用纳米滴一号分光光度计测定标记RNA的掺入频率和总浓度。在每一种情况下，每一张幻灯片上加825纳克的氰基5-CTP和一种花菁3-CTP标记的RNA。玻片在65°C下孵育16~17小时，用Agilent提供的洗涤缓冲液冲洗，然后按Agilent 60-mer oligo芯片处理协议的规定，用臭氧屏障覆盖。使用Agilent扫描仪(G2565CA)读取幻灯片，使用Agilent特征提取软件(10.7和11.0版本)提取数据。基因表达微阵列实验采用Agilent整个人类基因组44K 2色芯片，将每个基线样本与19份乳腺癌标本(包括HR阳性、HER 2扩增和三阴性标本)进行比较，并与HER 2靶向治疗2~3周后的相应样本进行比较，并将每一基线样本与其在明确手术(治疗后)时的匹配样本进行比较。

组织病理学

肿瘤切片用苏木精和伊红染色，由董事会认证的乳腺病理学家(GRB)对临床和反应信息视而不见。根据国际TILs工作组系统，评估了以下指标：肿瘤细胞、炎症细胞(定义为所有细胞在幻灯片上的百分比估计代表炎症细胞)、间质肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)。72，以及估计代表淋巴细胞的炎症细胞的百分比。

免疫组织化学

治疗前和治疗后14~21d分别行Ki 67(DAKO M 7240，稀释1：200)和ERα(AgilentSP1，M 3634，稀释1：200)免疫组化染色。未染色的切片按照先前描述的程序进行免疫染色。73盲目地被委员会认证的乳腺病理学(Mfp)评分。IHC图像在Aperio数字病理幻灯片扫描仪上数字化，Aperio ImageScope软件(12.3.2.8013版)用于图像的可视化和获取。Ki 67%阳性反映肿瘤细胞强(3+)、中度(2+)和弱(1+)的定性评分。对于ER，组织化学评分(H-记分)代表3x强染色(3+)核百分比、2 x中等染色(2+)核百分比和弱染色(1+)核百分比的总和。

表达式分析

Limma(3.28.21版)用于背景校正(规范exp)、阵列内归一化(黄土)和阵列间归一化(仅用于单通道分析)。74,75。战斗(SVA版本3.20.0)用于消除与芯片运行日期相关的潜在批处理效果76。利用单通道数据，用绝对内禀分子亚型(AIMS 1.4.0版)预测PAM 50内禀亚型。77和使用iC 10分类器(genefu版本2.16.0)的综合亚型，不包括给定队列内不均匀的子类型分布的规范化特征步骤。37。免疫细胞群用CiberSort版本1.06进行量化49和免疫国家(MetaIntegrator版本2.1.1)50。用估计版本1.0.13对样本的免疫成分进行了量化。42。利用双通道数据，基因集富集分析(Gsea)51(GSEA 4.0.2版)用于评估治疗和单样本GSEA(SsGSEA)的特征变化。39比较肿瘤(GSVA软件包1.32.0版和GSEABase软件包1.46.0版)的个体基因标志评分。由于与肿瘤过程或微环境缺乏相关性，以下12个Hallmark信号未被评估：根尖表面、根尖连接、过氧化物酶体、胰腺β细胞、精子发生、胆汁酸代谢、血红素代谢、胆固醇稳态、UV反应升高、UV反应下降、异生代谢、肌生成。

统计与重现性

计算基因签名之间的Pearson相关系数。用双面法评估激素受体状态或肿瘤亚型等基础肿瘤特征的基因信号差异。t-测试。基因标记、Ki 67或ER免疫组织化学和免疫组成的差异用双面配对法评估。t-测试。根据基线肿瘤特征的不同比例之间的差异被评估为χ2次试验。用Logistic回归法对基于表达的亚型、基因签名和其他变量之间的关联进行了分析，并对系数等于零的无效假设进行了双面Wald检验。p-R中的限值函数，用于报告估计的置信区间。R版本3.5.1和3.6.1用于所有统计分析。用于对基因表达数据进行比较的样本的确切数量在文本和图图中都有报告，其中最大的是N前处理样本=110，N=89的待处理样本，及N5 9例手术标本，但采用组织病理学资料(免疫组织化学、间质肿瘤浸润淋巴细胞百分比、荧光原位杂交数据)进行比较，样本量较小。