Th17相关的乳腺免疫，但不是高系统的Th1免疫应答与保护

尽管乳制品行业对预防奶牛乳房炎的需求很高，而且提高乳腺炎效果的空间也很大，但预防接种仍然滞后。我们之前比较了两种免疫方案大肠杆菌只使用肌内路径或肌内和乳腺导管的组合，也被称为“主要和拉”策略。记忆期的同源乳挑战显示，免疫对乳腺炎过程有很好的改善作用，尤其是在局部免疫的奶牛中，与肌肉注射组和对照组相比，单用佐剂组的乳腺炎过程更为明显。在此，我们通过rna-seq转录组和血浆细胞因子15-plex分析，在rna-seq转录组的时间点进行全血分析。大肠杆菌乳腺炎在各组间有显着的临床和实验室差异。免疫母牛血液中炎性细胞因子产生减少，干扰素γ增加，感染后12h出现T淋巴细胞活化特征。急性期中性粒细胞减少较轻，也存在与中性粒细胞发育和单核细胞活化有关的途径。此外，三头乳腺内免疫奶牛的愈合速度更快，乳房炎持续时间更短，其基因图谱与其他奶牛不同，但对乳腺炎易感性的差异一无所知。当检测CD4 T细胞在乳腺组织中的基因表达时，发现乳内免疫奶牛不仅在攻击后，而且在未受感染的对照区，也发现了IL-17相关通路的富集。这些发现表明，局部免疫动员了保护机制，这种机制依赖于感染前3型免疫相关CD4 T细胞的沉降。

乳腺炎是奶牛的主要疾病。1，由多种细菌感染乳腺而发展。临床病例主要是大肠杆菌和[医]uberis链球菌，同时金黄色葡萄球菌更多的是从慢性亚临床乳腺炎中分离出来的。由于乳腺组织和牛奶中白细胞的吸收，很容易发现感染，最终导致牛奶体细胞数(Scc)的增加，这是乳制品控制计划中广泛采用的指标。2.

乳腺炎的防治严重依赖抗生素，因此乳腺炎是乳牛普遍使用的主要原因。3。需要抗生素治疗的替代物，以减少抗生素的使用和抗生素耐药性的蔓延。4。制定提高乳腺防御能力的策略是一个很大的可能性，而在基于免疫的方法中，疫苗接种将是一条很好的道路。5。不幸的是，市场上基于细菌的疫苗，如大肠杆菌J5，受到一定数量的限制，减少了它们在奶牛群中的普遍使用。这些疫苗降低了自然暴露后临床乳腺炎的发病率，主要降低了乳腺炎和牛奶损失的严重程度。6,7。由于需要新的发展来克服现有商业疫苗效率低下的问题，进展缓慢的部分原因是缺乏对疫苗在乳腺中的运作方式以及对预防感染的确切保护机制的了解。

实际上，局部免疫反应主要依赖于早期有效地吸收中性粒细胞来控制细菌感染。IgG 1和G2亚型中的抗体，以及较小程度的IgA，由于其在反刍动物中的浓度低于其他哺乳动物，似乎并不起主要作用，尽管它们通常是由现有疫苗诱导的。

通过粘膜途径提供疫苗是肠外给药的一种有趣的替代方法。8。经呼吸道、消化和生殖器黏膜表面的局部免疫已被证明能诱导与组织驻留的CD4和CD8记忆T细胞相关的局部免疫。9,10,11。严格地说，乳腺没有粘膜表面，尽管它有时与粘膜共同的免疫系统有关。令人惊讶的是，通过乳腺内免疫(IMM)诱导对乳腺病原体的强烈免疫反应在乳制品反刍动物中鲜见报道。Lascelles的开创性工作12乳母羊使用活葡萄球菌，但是这些研究的主要局限是在注射攻击疫苗之前没有关于乳腺状况和随后的炎症的信息。实验性感染时存在较高的SCC，可能阻止了细菌接种物的增殖，从而阻止了乳腺炎的发生。最近，在当地用被杀的疫苗进行免疫[医]uberis链球菌降低乳腺炎发生频率对奶牛下一次泌乳的影响13。局部注射死亡人数少大肠杆菌细菌也有一定的保护作用，但由于对照组引起的乳腺炎的严重程度较低，在攻击时是否真的存在免疫力是值得怀疑的。14.

在牛的疫苗试验中大肠杆菌我们以前报告过的乳房炎15，我们用了一个地方政府大肠杆菌粗抗原经过一次肌内注射(IM)免疫后，又被称为“素与拉”策略。与单纯IM注射相比，导管注射提高了免疫方案的效果。在这种情况下，抗体反应似乎在免疫防御中没有发挥重要作用，免疫奶牛乳中产生干扰素-γ(IFN-γ)的细胞相关免疫的发展是明显的。事实上，细胞介导的反应对于改善对保护的反应是必不可少的。大肠杆菌乳腺炎。

提高我们对基于疫苗的细胞免疫的认识。大肠杆菌感染后，我们对在乳腺炎试验期间采集的样本进行了全血转录组分析，并对上述研究的免疫阶段进行了分析。15。通过结合全血转录体和细胞因子蛋白表达的高通量评估，我们描述了大肠杆菌乳腺炎。此外，我们提供的证据表明，白细胞介素-17(IL-17)产生的T辅助细胞在乳腺组织中的沉降提高了对大肠杆菌乳房感染。

实验组的临床和生物学差异大肠杆菌乳房挑战

乳房炎试验包括两个不同的免疫治疗组(IM或IMM)，n=每组6人)和对照组(续)n=6)仅在指定日期肌肉内注射相同佐剂的组(如图所示)。1A)。接下来的结果已经在10天的时间里被更详细地描述过了。15。在此，我们总结了挑战期间观察到的主要临床和生物学差异。事实上，为了寻找每一种免疫计划的机制和具体效果，选择了三个时间点(0、12和40个HPI)作为这些群体中最具判断力的，其中有明显差异(Kruskal-Wallis)，p < 0.05), and corresponding to the acute (12 hpi) and the late (40 hpi) phases of the 大肠杆菌乳腺炎。考虑了几个标准：系统临床评分(图一)。1B)，白血球。1C)，以及中性粒细胞。1D)计数；产奶量(如图所示)。1E)；乳腺临床评分(图一)。1F)和牛奶细菌负荷(图1.1g).

a有免疫和实验挑战阶段的实验方案。系统性(b)和乳房(f)临床评分为观察盲于治疗的观察者记录的多项体征的综合值。产奶量表示为每次产奶量与接种前平均产奶量的相对百分比。e)。牛奶细菌学(g)以每毫升牛奶、白细胞(c)和中性粒细胞(d)计数同时显示。每个点对应于单个奶牛，颜色指示治疗组和盒图，显示每个时间点的均值和标准差。字母表示不同(Kruskal-Wallis，p < 0.05) between groups (a：：CONT对IM；b：：CONT对IMM；c：I对IMM)

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此外，在第0天(I0)和注射IM免疫后第7天(I7)和注射助推器(B7)时采集血样进行分析。共采集6个枣和6只动物的107份标本进行转录组分析，其中1份(CONT，12 HPI)由于提取后RNA含量低而丢失。用rna测序法建立全血转录组，每个样本平均读取值为1030万(r1+r2)(补充表)。1)。星对后用FeaturesCount获得的数据集包含24,617个牛基因。在…的急性期大肠杆菌乳房炎(12 HPI)，阅读次数明显低于其他时间点(Kruskal-Wallis，p < 0.05), except in the IMM group (Supplementary Table 1)。一个样本(IM，B7)由于主成分分析(PCA)中的离群数据而被从数据集中删除。总共有106个样本可用于统计分析。

全血转录体通过rna-seq鉴定主要生物学功能。大肠杆菌乳腺炎

作为与牛相关的血液转录体大肠杆菌乳腺炎以前从未报道过，我们首先调查了CONT组基因表达的变化。PCa结果显示，表达谱随时间而变化，分别在0~12 HPI(PCA轴1：53.8%)和0~40 HPI(PCA轴2：24.3%)之间有明显的分离(图2：24.3%)。2A)。在这两个时间点上用DESeq 2鉴定了差异表达的基因(DEGS)，并与接种前的时间点进行了比较。在12和40 HPI时，DEGS分别为5214个(2653个以上和2561个低表达基因)和3385个(2202个以上和1183个以下)。DEG列表在两次的时候大多是不同的，因为在两组之间有少数基因是常见的，如Venn图所示(832个以上，447个被下调的DEG)(见图)。2B)。火山图显示了对12 HPI的测定结果(图1)。2C)和40 HPI。二维空间)比较，以及前10名表达过高或表达不足的DEGS的列表，可在补充表中查阅。212和40个HPI时间点。为了进一步描述反应和识别共同调控的基因和功能块，制作了一个热图(图)。2E)，根据时间对样本进行聚类。排名前500位的DGS被划分为四个模块，它们代表了不同的时间点。用ToppFun软件确定了各功能模块，并给出了评价各功能之间相关性的树状图。在12小时内，细胞对脂多糖的应答及细胞因子介导信号通路的调控是最活跃的功能体液反应和巨噬细胞活化晚期以40 HPI为特征。中性粒细胞迁移和细胞对活性氮的响应两次检测均有显着性差异。血浆IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-10细胞因子及CCL 2、CCl 4、CXCL 10趋化因子在12 hPI(Kruskal-Wallis，Kruskal-Wallis)时显著升高。p < 0.01), and returned to initial values at 40 hpi; only IL-1RA plasma concentration was increased at both 12 and 40 hpi (Supplementary Fig. 1).

免疫IM和imm免疫母牛转录组谱的比较

为了比较各组间的血液转录水平，我们首先在两个免疫组中分别寻找DEGS。DESeq 2分析后，两组均在12和40 HPI时检测到DEGS。在IM组和IMM组中显示前10位基因向上和向下表达的列表列在补充表中。3和4。12 HPI组间DEG值无明显差异(图1)。3A，c，但IMM组在40 HPI时明显低于对照组(图1)。3B，d)。维恩图如附图所示。2来确定常见的去管制基因的数量。有趣的是，免疫母牛的DEG数在12 HPI时低于对照组，而IMM组在40 HPI时的差异更大，DEG数仅占IM组和CONT组获得的DEG数的10%，支持了该组系统愈合早的观点。总的来说，样本基本上是根据全球热图中的时间聚在一起的(如图所示)。3E)，除3个在40 HPI下采集的IMM牛的样本与接种前采集的样本一起进行分组外。在此时间点后，这些奶牛的细菌排泄量最低(<100细菌/mL)，其乳腺感染在48h后实际清除，比其他奶牛快一倍。事实上，这三头IMM牛的表达谱不能区分0到40 HPI，这表明这些牛的基因表达几乎恢复到感染前的状态。根据其较低的临床评分和基因表达谱，他们被进一步定义为治愈的奶牛。前500位被划分为四个模块，由ToppFun软件确定，本质上与免疫功能有关(如图所示)。3E)。在12小时内，激活的功能是对细菌的防御反应，和中性粒细胞趋化性，如前面所示的CONT组。在40小时内，I型干扰素信号和体液免疫反应IM组明显激活，恢复速度最慢。各组间在0 HPI时间点的分布是一致的，表明各组间没有任何持续的免疫激活或生理差异。血浆细胞因子剂量表明，免疫后早期(12 Hpi)，免疫组的促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α及CCL 2和CCl 4的表达明显低于对照组(12 HPI)，提示IM组和IMM组感染后的炎症反应明显降低(附图)。3)。在40 hPI时，IM组干扰素γ和CXCL 10浓度较高，与该组在反应后期干扰素相关通路的激活相一致(图)。3E).

在两个时间点(12和40 HPI)的DEGS与0 HPI进行了Deseq 2的比较。比较0和12 HPI基因表达差异的火山图(a, c)，在0和40 HPI(b, d)分别为肌内(IM)组和乳腺内(IMM)组。红色点对应的基因q值<0.0 1，a AbSBI 2 FoldChange>2。e给出了对照组和免疫组前500 DEG感染过程中的热图。用ToppFun进行功能分析，并根据乳腺和全身评分、时间和治疗组的不同，用树状图显示一般解除管制的基因的生物学功能之间的关系。MS乳腺评分，SS全身临床评分。红色箭头表示有0和40个HPI曲线的IMM母牛无法区分(进一步设计为已治愈的奶牛)。

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如图所示，确定与系统和乳腺评分相关的生物学功能。1B，f对这组基因表达数据进行加权相关网络分析(WGCNA)。12个模块与乳腺和/或全身评分显著相关。值得注意的是，免疫组的T辅助1型细胞相关模块在12 HPI时被激活，表明通过IM或IMM途径的免疫方案改变了乳腺感染期间的免疫应答过程(补充图1)。4)。这些结果也表明，免疫促进了在乳腺炎早期血液中动员的T细胞反应。

系统和地方路线大肠杆菌免疫诱导不同基因表达谱

因为免疫改变了大肠杆菌对第一次肌肉注射和助推器注射后的乳腺炎进行检测，以破译各种免疫方案动员的免疫相关功能。比较各组免疫前的转录组数据(I0)，差异无显着性(P>0.05)。对注射i7后第7天的初步反应分析表明，注射后7天内有600个基因为DE。大肠杆菌/佐剂(n=12头牛)与单独佐剂(n=6头牛)(图1)。4A)。DEGS与免疫功能有关分泌、髓样白细胞活化及免疫效应过程(补充表)5)。注射B7后，通过IM或IMM途径，各组间基因表达谱差异有显着性(P<0.05)。有趣的是，与CONT组相比，免疫组DEG的数目更多，IM组和IMM组分别有389和416个基因上调。4B)。这些结果表明大肠杆菌抗原和微生物相关的分子模式，如脂多糖(LPS)，除了佐剂(Cont组和IM组相同)外，对二级反应有很强的影响。IM组DGS与干扰素α/β信号转导和细胞因子信号在免疫系统中的作用功能，而imm组的degs与中性粒细胞脱颗粒和趋化因子信号通路职能。Venn图显示，IM组和IMM组共有399个上调基因。这些基因与中性粒细胞脱颗粒和先天免疫系统职能(补充表)6)。此外，当CONT组未激活任何模块时，免疫组中的4个模块通常被上调。单核细胞富集和免疫激活-属簇作为主要模块。模块TLR和炎症信号仅在B7时点在IMM组被激活(如图所示)。4C)。所以，从大肠杆菌乳腺腔内的培养上清液刺激了一种系统反应，这与先前致敏奶牛佐剂中杀菌IM免疫诱导的反应有本质上的不同。

IMM治愈奶牛血液转录组谱与早期治疗的关系

我们随后注意了两个IMM亚组的比较，他们的临床症状和血液转录组在晚期乳腺炎(40 HPI)时有显着性差异。为了确定治愈牛的特性，在所有可用的日期对它们的血液状况进行了进一步的检查。对来自I0和B7数据的前500位可变基因进行了PCA分析(如图所示)。5A)。在B7时点，母牛与未治愈母牛的免疫反应存在显着性差异，说明不同母牛对免疫的反应不同，且与早期治愈有关。为了进一步推进这一假设，对tmod R软件包进行了模块化分析。两个模块在所有的动物中是常见的单核细胞富集和免疫激活-属簇作为主要模块。三个模块在治愈的动物中被进一步激活，这些模块的功能被中性粒细胞, 细胞周期与转录，和TLR和炎症信号(无花果)5D)。这些功能的提高支持了以下观点：系统反应的差异与中性粒细胞的动员有关，可能是间接的结果，而不是导致免疫治疗快速性差异的真正原因。

为了寻找在乳房炎期间治愈或未治愈的IMM奶牛之间差异动员的基因和免疫功能，对前500名奶牛进行了12和40 HPI的PCA检测，在12 HPI时表现出相似的特征，而在40 HPI时又有显著差异(图4)。c.)。DESeq 2分析仅发现26个基因(治愈组为21个，治愈组为5个)，而在40个HPI时，DEGS的数目为307个，其中22个基因在治愈组中上调，285个基因在非治愈组中表达。生物学功能在补充表中列出7。同样，这些功能上的差异并没有说明三头治愈的奶牛与其余的牛相比，早期愈合的可能原因。

在IM组和IMM组之间的比较中，除中性粒细胞动员外，没有DEG和NOR功能，这一事实导致了一种机制，解释了局部免疫奶牛的更好结果，至少有两种可能性：(1)在乳腺炎过程中这些是短暂的，在选定的时间点无法识别分析；(2)血液中不存在功能差异，因为它们驻留在与局部免疫有关的乳腺组织中。

Th17极化CD4 T细胞在imm区乳腺组织中占主导地位，并在攻击后被激活。大肠杆菌

以前，局部免疫与在目标组织中招募和建立CD4和CD8 T细胞有关。此外，由于血液中没有发现差异，我们假设乳房组织中可能发展出导致乳腺炎结局不同的机制。为了检测T辅助细胞室与乳腺免疫相关的表型，6头奶牛(3头，3头IMM)再次受到同样条件的攻击(图1)。6A)。经胶原酶处理后，经16 HPI荧光细胞分选，从乳腺组织中分离出CD4 T细胞(CD 45+CD4+细胞)。对4种不同的条件进行了检测：3头连续奶牛和3头IMM奶牛中的1头受到攻击的奶牛和1头健康的纯化(纯度>95%)CD4 T细胞的RNA测序显示，IL-17相关通路在IMM母牛细胞中的表达明显过高。DGS的分布特征与免疫有关，而与乳腺区的挑战状态有关，提示Th17表型的驻留细胞存在大肠杆菌乳房挑战。利用ToppFun软件对生物功能进行分析，如图所示的树状图所示。6B。前500个基因分为四个模块。模块1与imm组相关，并与中性粒细胞脱颗粒和不良磷酸化调控。模块3与Th17细胞分化和CD40L信号通路。这些模块在IMM感染的腺体和非感染的腺体中表达。单元2与IL-17信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用仅在感染区表达。与感染相关的模块主要与IL-17信号和中性粒细胞迁移，表明局部Th17反应促进了中性粒细胞的动员，而中性粒细胞对中性粒细胞有保护作用。大肠杆菌感染。

a具有免疫和挑战阶段的实验方案。在CONT和IMM奶牛的四种条件下，分别对被挑战牛和对照牛进行DEGS的评估。b根据这些条件，给出了一个显示前500度的热图。用Toppgene进行的功能分析是对每一个相关基因块中功能的树状图。p值<0.05)。c本文给出了感染的imm和感染的cont条件下CD4 T细胞中degs的基因网络，并显示了与IL-17细胞因子的关系。. d在16 HPI条件下，根据预先确定的组织匀浆量，测定了非感染和攻毒区奶牛组织IL-17A和CCL 2的产生情况。单个值显示为n=每组3头牛。

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采用DESeq 2分析鉴定的DEG表，用智能路径分析软件评价CONT组和IMM组感染时通路激活的差异。基因网络显示感染期间IMM组IL-17相关网络被强烈激活。6C).

为证实免疫季产生白细胞介素-17a(IL-17A)过量，测定了乳汁中细胞因子的分泌情况。大肠杆菌接种和组织收集前的16 HPI。尽管动物数量较少，但局部免疫的奶牛乳中IFNγ和IL-17A的分泌往往较高，而IL-10的分泌较低(附图)。5)，根据上一次报告15。当细胞因子在感染区的组织中被检测时，IL-17A和CCL 2诱导的细胞因子在IMM奶牛中更为丰富(图一)。6d此外，还检测到IL-1α的差异(补充图)。6)。值得注意的是，除了干扰素γ细胞因子外，牛奶与组织浓度之间的相关性很弱。

总之，这些数据支持了这样的观点，即局部注射促进了乳腺组织中Th17基础免疫的沉降，进一步放大了这一观点。大肠杆菌感染。

我们的目的是破译与局部免疫途径相关的免疫机制，从而更有效地保护乳腺免受感染。大肠杆菌。我们分析了在我们之前的挑战研究中采集的血液和牛奶样本。15。我们提供的证据表明，平行评估的两种免疫方式激发了不同的免疫反应。这些数据强烈地表明，从大肠杆菌对局部途径的培养使Th17极化的CD4 T细胞在乳腺组织中得以建立，而这些CD4 T细胞在未免疫的奶牛中是无法检测到的。

我们以前报道过，与对照牛相比，乳腺炎的临床症状在免疫方面没有那么严重，细菌清除速度更快，白细胞减少。然而，全身免疫(IM)和局部免疫(IMM)的反应也有显着性差异，IM组炎症反应持续时间较长。我们现在认为，这与一种与I型干扰素通路相关的信号增强有关，这可能是LPS释放的tLR 4-myd 88信号的结果。大肠杆菌感染区的细菌。这也可能是在注射40 HPI后，IM组牛奶中检测到的T细胞晚期流入的结果。这些细胞在乳腺受到攻击时在血液中循环，由于趋化因子和内皮细胞粘附分子的表达，这些细胞被吸收到发炎的乳腺组织中。一些细胞可能由于抗原识别而在局部增殖，或由于局部细胞因子的产生而非特异性地被激活。因此，它们可能导致了乳房炎晚期炎症反应的增加，而CONT和IMM组的愈合已经在进行中。

我们选择用rna-seq来评估血细胞转录组，而不是像我们先前描述的那样，评估乳腺组织或乳细胞基因的表达。16,17或其他团体18。事实上，这种方法允许我们进行一项动力学研究，并随着时间的推移，在乳腺炎过程中细胞组成比牛奶更稳定的组织上寻找机制。事实上，在感染后，牛奶中吸收的细胞基本上是中性粒细胞(>90-95%)，如前面所示。15而这些不超过三分之一的牛奶细胞在健康的腺体。此外，由RNA完整性数(RIN)评估确定的RNA质量在血细胞上优于牛奶细胞，在这些细胞中有许多白细胞死亡或凋亡/死亡。如果中性粒细胞是对抗乳腺感染的必要的终末效应，它们并不代表免疫诱导的中央型细胞。相反，CD4和CD8 T细胞在感染腺体的牛奶中只占少数，因为它们在接种时在牛奶中的数量非常低(通常低于10)。4细胞/mL)。后来，当感染强烈的炎症革兰氏阴性菌时，他们真的很难从大量且高度活化的中性粒细胞中分离出来。

我们选择保留6个关键时间点，3个在感染过程中破译保护机制，0HPI对应于我们的时间点，3个在免疫期间I0对应于第一次注射前的时间点。在cont组中，感染阶段的血液转录组提供了有关对a的反应的信息。大肠杆菌感染后，可根据时间对样本进行良好的聚类。乳腺感染后，随着大量基因的解除，血液白细胞基因的表达发生了迅速的变化。部分原因是血液白细胞成分的改变。15同时也改变了细胞的活化和功能。事实上，与中性粒细胞和细菌识别有关的功能在感染高峰时被高度激活，而在40 HPI时，这些功能被单核/巨噬细胞活化和B细胞反应所取代。血液转录体实际上揭示了在乳房炎过程中被动员或激活的基本功能。血液是一个很好的取样室，用于研究乳腺感染的免疫反应，其他地方也显示了这一点。19。这可能是由于高血流量通过泌乳乳腺，这是一个良好的灌注，代谢活跃的器官。

与对照组相比，免疫奶牛血液转录组的变化要小得多，正如以前的报告所显示的那样。大肠杆菌J5杆菌素减少临床症状和相关症状，如产奶量下降，这是一个与严重程度密切相关的指标。大肠杆菌乳腺炎20。事实上，与对照组相比，免疫组12 HPI的DEGS数比0 HPI时间点少，IM组和IMM组的DEG分别减少44%和57%。另一方面，在40 HPI时，IMM组仅出现这种下降，DEGS下降90%，证实IMM组乳腺炎持续时间较短，符合有记录的全身和乳腺临床征象。炎症细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)和趋化因子(CCL 2和CCl 4)的分泌减少证实了这一点。此外，IM组在40 HPI时检测到IFNy的高分泌，与系统免疫启动的Th1相关CD4或CD8 T细胞的激活相对应。这一产量在imm奶牛中的产量较低，可能是因为它们只在佐剂中注射了一次疫苗，或者因为它们的抗原来自大肠杆菌乳腺腔内的培养上清液不能扩大或分化出与全身免疫相同的大小和(或)表型的细胞。对于IL-17细胞因子，在任何时间点血浆中均未检测到分泌的差异。15.

为了寻找与系统和/或乳腺评分相关的途径，实施了WGCNA。它可以识别IM组与淋巴细胞功能相关的两个不同的模块和IMM组的粒细胞脱颗粒。与IM组相比，IMM组的T细胞活性较弱，这一迹象令人感兴趣，并导致我们研究乳腺组织中的CD4 T细胞，而不仅仅是血细胞间隔。

我们提供证据表明，白细胞介素17产生的CD4 T细胞在细菌抗原暴露的乳腺组织中富集.这些细胞的抗原库还不清楚，它们是否是特定于大肠杆菌其他组织中CD8 T细胞的抗原仍有待确定。21。白细胞介素-17细胞因子在细胞外细菌免疫应答中的作用现已确定。22。这种细胞因子在真菌和细胞外细菌感染时，通过诱导上皮细胞和/或基质细胞产生CxCL 8，从而参与局部防御，进而在感染部位诱导中性粒细胞内流和抗菌肽分泌。23。其在牛乳房炎中的作用已在几个报告中得到强调。在乳房炎模型中大肠杆菌在小鼠感染中，乳腺中的IL-17反应起着重要的作用。大肠杆菌乳腺炎症清除与减轻24。在奶牛中，尽管有报告称乳腺炎病例中检测到了IL-1725,26在减轻乳腺炎严重程度方面仍然缺乏明确的证据。

IL-17表达的CD4 T细胞可能被抗原提呈细胞局部激活，IL-17的表达可能伴随着IL-23的分泌和T乳滞留记忆(TRM)细胞的激活。IL-17细胞因子通过作用于上皮细胞和基质细胞诱导CXCL 8的分泌和中性粒细胞的募集，这一途径在模块化分析中被证明是上调的。不幸的是，通过每4小时测量一次牛奶中的细胞吸收量，我们无法显示各组间的内流差异。牛奶中的细胞数量可能与组织中的早熟性或再生强度不完全相关，因为中性粒细胞需要穿越上皮屏障才能到达乳腔，并在牛奶中被识别。此外，中性粒细胞的杀菌活性可能因其所遇到的3型相关的细胞因子/趋化因子的不同而有所不同。同样，我们也不能用体外试验显示出各组间的吞噬功能和杀伤活性的差异。15表明抗体反应不是细菌清除和乳腺炎愈合机制的核心。不幸的是，在感染区的分泌物中没有测量抗菌肽的产生，以寻找与3型免疫相关的其他机制。

决定乳腺TRM细胞表型的因素是另一个需要解决的重要问题。在启动免疫的过程中，我们使用了一种已知的佐剂来促进牛细胞反应的发展，其Th1/Th17图谱就像以前使用的像卵清蛋白这样的模型抗原所显示的那样。27。用热杀菌全血法检测同一母牛产生干扰素γ和IL-17时，IM和IMM母牛的细胞因子产量远远高于连续奶牛。虽然牛和牛之间存在高度的变异，但注射增强剂后，IM组IFNγ和IL-17的生成增加，提示免疫诱导循环CD4 T淋巴细胞产生IL-17A和/或IFNγ，而IMM组则相反。导管内浓缩注射大肠杆菌这一步骤的上清液培养有助于在组织中吸收T细胞。促炎细胞因子反应大肠杆菌-来源的LPS可能促进了T细胞的归巢和/或局部增殖，特别是如先前在肺中描述的那样，IL-17表达的CD4 T细胞的增殖更为明显。28或者肠道29CD4和CD8分别为TRM细胞。乳腺组织中T细胞归巢的机制可能是决定因素，有待进一步研究，以确定解决局部更有效的T细胞免疫问题的最佳方式，提高免疫方案的有效性。

在研究免疫反应时，血液转录组分析可以确定IM和IMM中是否存在差异基因，而在Cont组中发现的DEG很少(图1)。4B)。在B7，免疫组中存在与单核细胞、中性粒细胞和T细胞有关的功能激活。与炎症反应和干扰素通路相关的模块在IM组被激活，表明在佐剂中接受两次疫苗注射的组具有较强的全身炎症反应。PCa显示，在B7时点，反应差异已经存在，增强了记忆40 HPI时所见的功能，如中性粒细胞相关功能的激活和TLR信号的激活。相反，在感染高峰时(12 HPI)，图谱难以区分。这表明治疗组的IMM牛在注射助推器时有反应，这预示着感染后更快的愈合。目前不能排除对免疫反应的基因控制，以解释这种差异。

总之，我们提供了一些证据，证明这两种免疫途径和两种不同的免疫方式E.大肠杆菌抗原对乳腺的免疫激活和保护性免疫效果不同大肠杆菌感染(图1.7)。局部免疫途径提供了一些机制大肠杆菌乳腺炎控制在仅接受佐剂的奶牛上。系统免疫有助于在乳腺感染后产生抗原特异性活化/记忆T细胞的循环池。然而，这种招募发生在晚些时候的乳腺炎过程中，似乎没有地方免疫接种那样具有保护作用。相反，抗原增强剂能够在当地建立TRM细胞，而TRM细胞从感染一开始就会作出反应。我们提供了一个原则证明，乳腺3型免疫可能有助于保护乳房炎。在乳腺中激发3型免疫很可能有助于开发新的商业疫苗。

该原理图描述了我们目前对乳腺内免疫的有益效果的看法，并对两种免疫途径进行了比较。在佐剂中全身性注射杀灭细菌会产生大量Th1/Th17循环CD4 T细胞。注射大肠杆菌通过乳头导管培养上清液抗原，可使CD4 TRM细胞在乳腺组织中沉降，这些细胞可在乳腺组织中表达IL-17，并在早期通过中性粒细胞的募集而动员保护性反应。大肠杆菌乳腺炎。

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动物与伦理声明

所有的实验程序、临床和实验室记录都曾在Herry等人中作过描述。15。所有涉及动物的程序均由Val de Loire(法国)道德委员会批准，DGRI的协议APAFIS#813-2015061109103810v2。动物研究符合欧洲第2010/63/UE号指令规定的所有适用规定。所有方法均由核准的工作人员按照上述道德操守委员会批准的相关标准作业程序采用。本研究中使用的所有动物均严格按照良好的临床实践处理，并尽一切努力将痛苦降至最低。总之，总共有18头荷斯坦-弗里斯兰小母牛在15月龄时进行了同步受精.在妊娠的最后三个月，12头母牛被注射热灭活注射免疫。大肠杆菌P4按制造商的建议在Montanide ISA 61VG(SEPPIC，法国)油佐剂中乳化。两个月后，一半的小母牛(IM组，n第二次注射作为助推器。另外一组收到50克浓缩蛋白。大肠杆菌P4在两个季度(IMM组，n=6)。对照组的奶牛(续)，n6)于同一时间肌肉注射佐剂2次。然后，奶牛在一个健康的小区平均49天的牛奶中注射一种大肠杆菌P4菌悬液(10)3细菌)。

第一次挑战后四十天，一种新的乳房输液大肠杆菌P4使用与以前相同的条件进行，以收集组织样本和评估局部反应。6头先前受到攻击的奶牛(3头，3头IMM)接种在一个健康(SCC<50,000细胞/mL)中，而以前没有受到攻击的四分之一。未收集临床资料。对SCCS进行了评估和大肠杆菌再次分离细菌，以检查接种是否有效地诱发乳腺炎。攻击后16h和组织收获前分别对牛进行安乐死。