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T细胞活化的基因组图谱显示记忆性T细胞对CD 28共刺激的敏感性增强

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发表时间:2020-11-25 12:52作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

T细胞活化是免疫应答的关键驱动因子.CD 28共刺激是CD4 T细胞反应的重要调节因子,但其在幼稚T细胞和记忆T细胞中的相对重要性尚不完全清楚。利用不同的模型系统,我们观察到人类记忆T细胞对CD 28共刺激比幼稚T细胞更敏感。为了解构T细胞受体(TCR)和CD 28如何协调人T细胞的活化,我们利用不同强度的TCR和CD 28刺激细胞,并分析了基因的表达。我们发现,参与细胞周期进程和分裂的基因在记忆细胞中是由CD 28驱动的,而在幼稚细胞中受TCR控制。我们进一步证明T辅助分化和细胞因子的表达受CD 28的控制.通过染色质可及性分析,我们观察到当TCR和CD 28同时参与时,AP1转录调控增强,而NF-kB基序在CD 28敏感基因附近的开放染色质丰富。最后,我们发现CD 28敏感基因在与免疫疾病相关的GWAS区域富集,提示CD 28在疾病发展中起着重要作用。我们的研究提供了关于共刺激在幼稚和记忆性T细胞反应和疾病易感性中的不同作用的重要见解。

导言

T细胞对病原体的反应能力和对宿主抗原的耐受能力对人类健康至关重要。过度激活记忆性T细胞是许多常见的复杂免疫疾病的特征,如自身免疫性关节炎和系统性红斑狼疮[1, 2]。全基因组关联研究(GWAS)已经将许多风险变体定位到编码调节T细胞刺激通路的基因上,包括CD 28, CTLA 4ICOS基因定位于2q33.2[3,4,5,6]。虽然相关变异体的确切影响尚不清楚,但它们与基因组非编码区的映射表明,它们对基因表达调控有影响。7, 8]。这意味着免疫疾病GWAS变异体可能通过调节共刺激通路的活性而发挥作用。最近的两项研究表明,与免疫疾病相关的gWAS变异体在T细胞刺激后活跃的染色质区域中富集。9, 10]。在记忆性CD4 T细胞的早期激活过程中,SNP的富集信号最强。10],表明相关变异体在第一次细胞分裂之前,在细胞激活的早期事件中聚集在对通路的调控上。有了这种记忆性T细胞激活的遗传锚,更好地理解T细胞激活过程中的途径可以指向新的药物靶点。

T细胞刺激最初发生在次级淋巴组织,T细胞与专业抗原提呈细胞(APC)相互作用。这里传递两个协调信号:第一个通过T细胞受体(TCR)识别与MHC分子结合的抗原,第二个通过上调共刺激配体提供。在这方面,CD 28是与CD 80和CD 86配体相互作用的T细胞表达的主要共刺激受体。TCR和CD 28信号的协调对T细胞的活化、增殖、分化和存活至关重要,使CD 28通路成为控制T细胞反应的关键检查点。11, 12]。在不同的免疫条件下,CD 28共刺激的水平差异很大。例如,表达CTLA-4的调节性T细胞(Tregs)的存在可降解CD 80和CD 86配体[13影响CD 28共刺激。事实上,CTLA-4的表达不足与自身免疫性疾病的发生有关。14,15,16,17]由于CD 28信号增加[18, 19]。CTLA4-Ig通过靶向CD 28途径调节T细胞活化,也是治疗复杂免疫疾病的一种成功途径。20].

在此,我们结合免疫基因组学的方法来研究TCR和CD 28在CD45RA激活中的作用。+和CD45RA人CD4-T细胞亚群通过刺激不同强度的TCR和CD 28细胞。首先,我们使用细胞模型的组合来确定这些T细胞亚群是否以类似于CD 28共刺激的方式响应。我们发现CD45RA中的CD 28对细胞分裂的控制有明显的差异。CD45RA主要由TCR驱动的细胞+细胞。然后,我们利用基因表达和染色质活性谱来映射这些受体的单独和共同刺激所产生的转录过程。我们发现T-助手(Th)分化、趋化因子受体和细胞因子的表达等主要效应功能在两种细胞亚群中都受到CD 28的强烈影响。最后,我们发现一些与常见免疫疾病相关的变异体在CD 28敏感基因中富集,提示这种共刺激途径在疾病发病机制中起着重要作用。我们提供一个网站来检查细胞类型和刺激特异性基因的表达。Www.sanger.ac.uk/science/tools/costimulation/costimulation.

结果

CD 28促进CD45RA细胞增殖记忆T细胞

为了研究人T细胞不同亚群对CD 28共刺激的需求,我们使用了表达CD 86(CD 28配体)的B细胞株(DG 75)。21]将CD 28和超抗原TSST-1作为TCR的配体。为了本研究的目的,我们将原始细胞定义为CD45RA。+记忆细胞为CD45RA承认它们是这些细胞亚群的不完美标记。我们最初通过滴定abatacept(CTLA4-Ig)来调节CD 28共刺激,CTLA4-Ig是一种用于治疗免疫疾病(如类风湿关节炎)的药物,通过阻断共刺激来降低T细胞活化。我们通过对高亲和力反应T细胞(TCR Vβ2)进行门控,比较了幼稚T细胞和记忆T细胞的增殖反应。+)确保对TSST的强烈认可。这些数据表明,记忆和幼稚T细胞在不存在abatacept的情况下反应良好,而朴素细胞对2μg/ml以上的抑制反应敏感(图1)。1A,B和补充图。斯1A)。相反,与幼稚细胞相比,记忆细胞只表现出比幼稚细胞高10倍浓度的抑制作用和更广泛的细胞分裂。这些数据与以前的概念一致,即与幼稚T细胞相比,记忆T细胞对共刺激的依赖程度较低,当CD 28的参与被阻断时,T细胞会继续增殖。然而,这些数据也可以用一种不同的方式来解释,因为它承认CD 86并没有被吸收能力完全阻断,因此游离CD 86的残留水平可能足以支持记忆中的增殖,而不是幼稚的T细胞。以这种方式查看数据,可以认为CD45RA事实上,细胞对CD 28残留水平较低更敏感。为了解决这个问题,我们还测试了DG 75细胞的反应,其中CD 86被删除,使用CRISPR。CD 28配体的完全丢失导致了大量的进一步抑制,尤其是在记忆细胞中(如图所示)。1B表明abc假设可能是正确的。这些数据在几个不同的捐助者之间是一致的,并支持CD45RA模型。记忆性T细胞似乎对CD 28信号更敏感,因此被abatacept阻断不能完全破坏CD 28共刺激。

图1:CD 28刺激促进记忆T细胞增殖。
figure1

A, B纯化CD4+CD 25在CD 86介导的DG75B细胞、TSST-1超抗原和abatacept的存在下,对记忆和幼稚T细胞进行CTV染色和刺激5d。流式细胞术检测Vβ2+T细胞的增殖,用AccuchCheck计数珠和FLOWJO增殖软件计算分裂Vβ2+门内的细胞数。B盒形图表示每一剂量TSST-1的分裂Vβ2+门内的细胞数,相对于对照组(无吸收)。C纯化CTV染色CD4+CD 25用抗CD 28或抗CD3刺激Cho-FCR转染者的记忆和朴素。刺激5d后,用流式细胞仪检测记忆和幼稚T细胞的增殖。用FLOWJO软件的增殖计算器测定细胞增殖指数和前体频率。D纯化CTV染色CD4+CD 25CD 86介导的DG 75细胞在T:DG=1:1的条件下,刺激记忆和幼稚,并指示可溶性抗CD3浓度持续5天。流式细胞术检测细胞增殖。BD采用双向方差法计算显着性,用Tukey诚实显着性差异检验进行组间均值比较。

自从以前的研究表明CD 28超激动剂抗体能够在体内触发记忆性T细胞反应以来22, 23],我们还研究了交联CD3和CD 28抗体对幼稚T细胞反应和记忆T细胞反应的影响。利用表达Fc-γ受体(FCR)的CHO细胞提供抗体交联,我们单独检测T细胞对CD3或CD 28刺激的增殖。1C和补充图。斯1B)。刺激后第5天,幼稚T细胞仅向抗CD3方向增殖,使大部分细胞分裂,而记忆T细胞的反应则变化较大。相反,CD 28交联导致记忆T细胞反应强劲,而幼稚T细胞则未见此反应。p-价值=0.0001)。此外,CD 28刺激后的大部分增殖记忆细胞随后分裂(如图所示)。1C),在CD3刺激记忆的CD4中不明显。+T细胞这些数据共同支持了记忆细胞比幼稚细胞更有效地利用CD 28共刺激的概念,相反,幼稚细胞对TCR刺激的反应更强。这些数据合在一起意味着这些共刺激受体在CD45RA转化过程中的主导地位发生了转变。+调至CD45RA表型

接下来,我们进行了典型的共刺激实验,TCR和CD 28信号同时存在,固定CD 28共刺激,同时通过抗CD3(图1)滴定TCR信号的强度。1D和补充图。斯1C)。这表明了与上述意见相一致的几项调查结果。第一,TCR刺激的滴定对幼稚T细胞的影响大于记忆,在最低剂量下CD3 T细胞增殖在幼稚细胞中被消除,而在记忆中则没有。我们假设这是因为记忆T细胞受到更有效的CD 28共刺激的支持,而幼稚细胞更依赖TCR,因此容易丢失。其次,我们观察到在低剂量的抗CD3(图1)。1D记忆性T细胞也显示出更广泛的分裂,这与CD 28为主的反应一致,类似于CD 28信号单独出现的情况(图)。1C).

综上所述,使用几种不同的方法,上述数据表明,幼稚和记忆T细胞激活受TCR和CD 28信号优势的影响不同。同时,记忆T细胞对CD 28的敏感性高于幼稚T细胞,因此ABatacept对它们的抑制作用较弱,对直接CD 28交联的反应也较强。此外,CD 28共刺激在记忆T细胞导致增强增殖,使T细胞更有效地进展到以后的分裂。相反,幼稚的T细胞主要利用TCR信号来推动增殖,因此在抑制TCR信号时对CD 28信号的丢失和TCR信号的耗尽更为敏感。

幼稚T细胞和记忆性T细胞在激活时会操作不同的基因表达程序。

为了进一步了解幼稚细胞和记忆细胞差异使用CD 28信号的影响,我们分析了不同刺激条件下的基因表达情况。通过对抗CD3抗体和CD 86表达载体的滴定,产生了4种共刺激条件(低TCR+低CD 28,低TCR+高CD 28,高TCR+低CD 28,高TCR+高CD 28),以及来自TCR(HighTCR)和CD 28(HighCD 28)的独立信号。1B和补充图。斯2A,B).

经过16h的刺激后,我们对活化的CD 25进行了分类。+CD45RA+朴素与CD45RA内存子集(参见“材料和方法”一节)。通过比较静息状态和刺激状态下两种细胞类型的基因表达谱,我们观察到每个子集的基因表达特征,与已发表的细胞标记相一致。24](图1.2A和补充表1)。在记忆细胞中差异上调的294个基因中,我们发现了与T细胞迁移有关的基因(如趋化因子受体)。CXCR 3, CCR 6GPR 1细胞粘附分子CD 58(lfa-3)和β1整合素),细胞内信号(磷酸酶,钙信号分子,例如。SYT 11, ITPRIPL 1,以及激酶。CDKN1A记忆性T细胞存活和同型平衡(细胞因子受体)。IL1R1, IL2RB, IL12RB2IL18RAP)、讲师和Fas)和影响T细胞分化的转录因子。MAF, Tbx 21, RORC, BHLHE 40PRDM 1). PECAM 1(CD 31),是幼稚T细胞子集的著名标记[25],是幼稚细胞中差异上调的33个基因之一。这证实了我们基于CD45RA标记的分类策略成功地捕获了具有主要表型的纯真和记忆CD4的群体。+T细胞

图2:幼稚T细胞和记忆T细胞对TCR和CD 28刺激的反应不同。
figure2

A静息幼稚细胞与静息记忆细胞差异基因表达试验火山图,刺激幼稚细胞和静息记忆细胞。蓝色染色的基因与差异表达的基因对应,对数2倍变化>1,FDR<5%。标记为DEG,最低p-价值观。B利用所有基因的表达进行主成分分析。前两个组分共同解释了53.7%的观察到的变异,并与刺激强度和细胞类型相关。每个点对应于单个样本,通过刺激着色,并根据细胞类型形成。C刺激后被刺激细胞与静息细胞之间的差异表达试验确定的上调基因数目(折叠改变≥2和fdr≤0.0 5)。D基因因刺激而升高的例子。情节显示不同刺激条件下的阅读计数。p-通过比较刺激和静息状态,用DESeq 2 Wald检验计算值。

正如预期的那样,在不同的刺激条件下,我们观察到活化T细胞的比例是可变的(占所有细胞的11-78%)(附图)。斯2C)。然而,仅通过对CD 25进行排序+我们保证测量的基因表达能反映不同信号强度诱导的细胞活化状态,而不受活化细胞百分比变化的影响。为了评估不同刺激条件下细胞转录组的整体差异,我们应用主成分分析(PCA)观察到,PC1反映细胞刺激(解释41.4%的变异性),PC2对应于细胞类型(解释变异的12.3%)。2B)。事实上,当直接观察每个因素解释的变异时,大多数基因表达差异的解释是刺激(47%)和细胞类型差异(10%)(补充图)。斯二维空间以及“材料和方法”部分)。PC2分离朴素T细胞和记忆T细胞,证实了朴素T细胞和记忆T细胞转录反应的明显差异,表明CD45RA虽然是朴素和记忆细胞的不完善标记,但足以在全局基因表达水平上分离这些亚群。PCA还捕捉到两种细胞类型的刺激强度梯度,强的共刺激条件与PC1上未受刺激的细胞距离最远,中间的刺激强度介于两者之间。令人惊讶的是,强CD 28单独(FCR-抗CD 28)是较低的反应条件中的幼稚细胞,但它聚集在较高刺激条件的记忆细胞。因此,对转录程序的全球分析也捕捉到了之前观察到的幼稚T细胞和记忆T细胞之间的功能差异。

为了了解这两种刺激诱导的子集特异性反应,我们比较了静息和刺激的朴素T细胞和记忆T细胞的基因表达谱(假发现率≤0.0 5和折叠改变≥2;图2)。2C表S2)。正如预期的那样,大多数上调基因是在两种细胞类型之间共享的,但幼稚细胞的差异上调基因(Degs)数量(平均为1243)多于记忆细胞(平均为847对);t-测试p-价值=0.034)。这很可能反映了在幼稚细胞中,由于从更深的静止状态过渡到激活,基因表达水平发生了更大的变化。这方面的例外是CD 28单独刺激,增加了记忆细胞中更多的基因。在未受刺激状态下,幼稚细胞和记忆细胞之间的差异表达分析显示,在记忆细胞中有更多的基因像预期的那样高表达(如图所示)。2A).

为了评估不同刺激下基因表达调控的敏感性,我们对所选基因的表达谱进行了研究。我们观察到基因表达对不同水平的刺激是敏感的,并且在两种细胞类型之间存在差异。例如,IL2由共刺激调控的表达[26],除小剂量CD 28和TCR共刺激刺激记忆细胞外,其他条件下均有上调。有趣的是,IL2高CD 28单独作用于记忆细胞而不是在幼稚细胞中被上调(图1)。二维空间)。我们还检测了CD 28,CTLA 4和ICOS的基因表达谱,编码在一个260 kb的位点上。我们观察到,尽管它们非常接近,但每个基因都有一种独特的表达方式。例如,仅在单纯的TCR作用下,CD 28才在幼稚细胞中显著上调,而单纯的TCR则是如此。CTLA 4高TCR刺激显著升高,而CD 28刺激则无显着性差异。此外,CTLA 4在幼稚细胞中普遍被激活而上调,其中最强的TCR是最有效的。相反,ICOS表达对CD 28共刺激有普遍要求,导致幼稚细胞和记忆细胞显著上调。最后,我们观察到CD 86的表达只有在强烈的CD 28参与下才有反应,而在TCR刺激下才有反应。这些观察表明,在幼稚细胞和记忆细胞中的基因表达表现出不同的TCR和CD 28反应模式,它们对特定的刺激和强度都很敏感。

滴定TCR和CD 28识别对特定信号敏感的基因

在上述观察的基础上,我们试图全面评估每个刺激信号在幼稚T细胞和记忆T细胞基因上调中的作用。将基因分类为CD 28或TCR敏感,我们使用两种基因表达的分类模型(线性和开关).线性模型反映了基因对刺激强度的反应改变了基因的表达,而开关模型则反映了基因表达的数字开关状态(图1)。3A)。在这两种细胞类型中,我们能够对1566个基因给予独特的刺激敏感性,这意味着这些基因的表达对TCR或CD 28的强度更敏感。我们观察到,大多数刺激敏感基因(84%)遵循线性模型(补充图)。斯3A),表明一个基因的表达可以通过信号强度而不是信号的存在或缺失来调节。

图3:TCR和CD 28滴定法识别对每个信号敏感的基因。
figure3

A在线性模型中,我们要求随着刺激强度(基因表达中≥1.5倍递增)基因表达的线性增加,分别评价朴素细胞和记忆细胞。不遵循线性模型的基因被测试为开关模型。在这里,我们假设一个‘开关’的表达模式,其中一个基因是显着地上调(折叠变化的≥2),以回应或存在的CD 28或TCR。在这两种模型中,我们使用了所有七种条件,例如在检测CD 28敏感基因时,我们将TCR单独与静止刺激分组,因为它们都没有接收到CD 28信号。一个基因被分为两个类别之一,没有重叠,并按线性模型排序。B比较幼稚和记忆细胞中TCR或CD 28敏感基因的数量。C利用fgsee在幼稚和记忆细胞中富集TCR敏感和CD 28敏感基因的标记通路。DG2M检查点途径富集区。E所选转换基因的基因表达谱,改变两种细胞类型之间刺激敏感性的基因。在刺激名称下面的数字代表了通过以下方法导出的朴素T细胞与记忆T细胞之间差异的显着性。t-测试。

接下来,我们评估了幼稚细胞和记忆细胞对这两种刺激的敏感性是否不同,并发现与每种刺激相关的基因比例在两种细胞类型(卡方)中有所不同。p-数值=1.6×10−94)。我们观察到,幼稚T细胞中的大多数基因是TCR敏感的(1056;图1).3B表S3),而较少的基因是CD 28敏感的(n=360)。然而,在记忆细胞中,我们观察到更多的基因是CD 28敏感的(n=351)比TCR敏感(n=299)。因此,我们得出结论,tcr敏感基因和cd28敏感基因在幼稚细胞和记忆细胞之间的分布不均匀,tcr敏感基因向幼稚细胞转移(Fisher的精确检验)。p-数值=1.33×10−82CD 28敏感基因向记忆细胞转移(Fisher‘s精确检验)p-数值=2.15×10−4)。根据细胞类型内的两两比较以及与静止状态相对应的六种情况,我们定义了一组在刺激时被上调的基因。在这组中,我们观察到1224个基因在幼稚细胞中的表达(55%)和489个基因在记忆细胞中的表达(29%)对单个刺激是敏感的(补充图)。斯3B)。这表明记忆细胞中的大多数上调基因对任何一种刺激都有反应(即TCR或CD 28能够驱动这种反应),或者它们确实是CD 28共刺激依赖的,同时需要TCR和CD 28。

为了确定对CD 28或TCR敏感的基因是否在幼稚T细胞和记忆T细胞中调控相同的细胞过程,我们测试了这些基因是否在标记功能通路中富集。27(见“材料和方法”一节;图1。3C)。我们观察到DNA复制G2M检查站,CD 28敏感于记忆细胞,TCR敏感于幼稚细胞。这与触发CD 28和TCR诱导的幼稚T细胞和记忆T细胞的增殖差异是一致的。1)。我们观察到三个基因(CDC6, CD 20CHEK 1)驱动G2M通路的富集,G2M在幼稚细胞中具有TCR敏感性,而在记忆细胞中转变为CD 28敏感性。因此,我们试图在我们的数据集中找出其他的“转换”基因,即对两种细胞类型之间的不同刺激敏感的基因。我们鉴定了一组在幼稚细胞中对TCR敏感的18个基因,并在记忆细胞中改变为CD 28敏感性。其中,我们鉴定了转铁蛋白受体。TFRC(CD 71),这是铁的摄取和促进增殖所必需的,以及MCM 10这是启动DNA解旋酶活性和复制的一个重要因素。三维空间表S4)。这些数据共同强调了细胞周期/DNA复制途径的富集作为CD 28在记忆T细胞中的靶点,而后者则是由幼稚细胞中的TCR控制的。此外,这些结果在转录水平复制我们早期的功能观察,天真和记忆T细胞显示不同的增殖反应对TCR和CD 28的刺激。

T细胞效应功能主要由CD 28控制。

我们观察到,大多数基因的表达被广泛归类为免疫细胞途径,例如通过JAK/STAT 3发出IL6信号, 炎症反应干扰素α与γ反应CD 28敏感基因比TCR敏感基因在两种细胞类型中的富集程度更高(图1)。4A)。我们检查了是哪些基因推动了这种富集,并发现许多细胞因子和趋化因子在CD 28的控制下(如图所示)。4B)。例如,CXCL 10CXCL 11推动了这四条途径的浓缩IL6IL15RA推动了.的浓缩通过JAK/STAT 3发出IL6信号, 炎症反应干扰素γ反应。我们还发现了参与共刺激和细胞激活的基因,这些基因驱动了浓缩,例如CD 274(PD-L1)(PD1在这两种细胞类型中都没有检测到)干扰素ɣ反应CD 70推动浓缩炎症反应。由于大多数T细胞刺激实验都使用tcr和CD 28来激活细胞,因此不清楚哪些T细胞功能由tcr控制,哪些由CD 28控制,以及它们在原始细胞和记忆细胞之间有何不同。因此,我们检查了在数据集中表达的所有细胞因子和趋化因子,以及选定的共刺激分子(如图所示)。4C)。值得注意的是,在我们的模型中,对主要Th亚群的分化必不可少的细胞因子的表达受到CD 28的控制,包括IFNG(Th1),IL4IL 13(Th2)和IL17A, IL17FIL 22(Th17)。此外,我们观察到Treg转录因子的表达,Foxp 3,对CD 28刺激也敏感。

图4:T细胞的效应功能主要由CD 28控制。

A通过JAK/STAT 3反应获得IL6的途径富集图。B在这两种细胞类型中,细胞因子、趋化因子和共刺激因子的例子都是CD 28敏感的.这个x轴对应于CD 28(T细胞占CHO-CD 86细胞的比例)的水平,y轴对应于基因表达的log 2计数。C对至少一种细胞类型的至少一种刺激敏感的细胞因子、趋化因子和共刺激分子。上面两行表示记忆或幼稚T细胞的刺激敏感性。以下热图中的颜色表示基于每种细胞类型线性模型的基因表达的对数2倍变化。D用CHO-FCR细胞交联抗CD 28或抗CD3抗体刺激纯化的ctv染色CD4+CD 25−记忆细胞和幼稚细胞。刺激5d后,用流式细胞仪检测记忆和幼稚T细胞的增殖。显示表达IL 13、IL17A、IFNɣ、IL2和IL 10的分裂细胞百分比。采用双向方差法计算显着性,用Tukey诚实显着性差异检验进行组间均值比较。

为了确认这种刺激选择性是否也存在于蛋白质水平,我们用流式细胞术检测细胞因子的表达。4D和补充图。S4)。我们观察到IL-13(Th2细胞因子)仅在CD 28刺激的记忆T细胞中特异表达。另一方面,IFNɣ(Th1细胞因子)和IL-17A(Th17细胞因子)仅由记忆细胞表达,并受到两种刺激的刺激。CD 28刺激时,记忆性T细胞表达IL-17A的百分比高于TCR刺激(P<0.05)。p=0.03)。此外,CD 28刺激可显著提高记忆T细胞中IL-2的表达。p-数值=7.9×10-5),与CD 28交联后较高的增殖能力相一致(图1)。1C)。最后,我们还观察到一种不寻常的趋势,即TCR在记忆T细胞中诱导IL-10的表达,而在幼稚T细胞中,IL-10的表达随CD 28的升高而升高(尽管没有统计学意义)

这些结果表明,许多与CD4 T细胞效应功能相关的基因主要受CD 28通路的控制。

CD 28和TCR诱导T细胞染色质活性变化

为了更好地理解tcr和cd28刺激下的基因表达调控,我们用atac-seq分析了染色质的可达性。28]和以H3K27ac为标志的活性增强子和启动子[29]。为此,我们将静息细胞与单独刺激高TCR、高CD 28或高TCR及高CD 28刺激的细胞进行比较。在全球范围内,我们观察到,记忆细胞的特点是在两个染色质可达点的峰值更多(8.6%以上的峰值;p-值=0.094)和H3K27ac(峰值增加9.4%);p-价值=0.0016)(附图。5A).

为了了解TCR和CD 28刺激是否启动了特定的基因表达调控方案,我们测试了转录因子结合位点(TFBS)的富集。我们使用每种细胞类型的所有峰,并比较刺激和静息状态。这揭示了tcr和CD 28共同刺激的细胞与单个刺激物之间染色质可达位点中丰富的TF基序高度相关(Pearson)。R2=0.86仅用于CD 28和PearsonR2=0.91只用于hTCR,使用ATAC-seq)。在丰富的基序中,我们鉴定了AP1转录因子复合物的组成成分(补充图)。5B),在诱导免疫应答中起着重要作用。核受体家族蛋白的转录因子基序在单纯的强TCR刺激的幼稚T细胞中完全富集,这与诱导这些细胞的过敏反应是一致的。使用H3K27ac Chm-seq数据观察到类似的结果(补充图)。5B).

然后,我们在我们定义的对CD 28或TCR敏感的基因附近测试了开放染色质中丰富的转录因子基序。我们观察到AP1转录因子基序在TCR和CD 28敏感基因中都富集,这与AP1作为T细胞激活的全球调节因子的重要性一致(图1)。5A,B)。TCR敏感基因的富集比CD 28敏感基因更显着,尤其是在幼稚细胞中。相反,NF-kB和RELB转录因子在CD 28敏感基因附近的开放染色质中最显著富集,这表明NF-kB是TCR和CD 28-敏感基因差异的潜在机制。30, 31].

图5:TCR和CD 28信号诱导染色质活性的特定变化。
figure5

A仅以刺激敏感基因周围的开放染色质(以150 kb窗口)和静止状态下无差异表达基因周围的开放染色质为背景,检测开放染色质在开放染色质中的富集程度。B在测试刺激敏感基因时,前20位最显着地丰富了转录因子。C相对于细胞因子周围开放染色质的静息状态,趋化因子的覆盖范围更丰富,而趋化因子则是一种辅助刺激因子。浓缩计算为log 2(在受刺激细胞中的覆盖率/在静息细胞中的覆盖率)。p-数值是使用配对计算的t-测试。只显示p-数值<0.05。D周围染色质的选择示例CXCL 10基因。

我们还检查了染色质可及性,在细胞因子和共刺激基因附近,我们认为这些细胞因子和共刺激基因对TCR或CD 28信号很敏感。5C)。高水平CD 28刺激的细胞组蛋白乙酰化程度较高,对CD 28敏感的细胞组蛋白乙酰化程度较高,高TCR刺激细胞对TCR敏感的基因也较高。我们观察到,72%的病例在刺激被测基因周围的染色质时,染色质的开放是一致的。我们可以进一步找出一组显示差异的基因,与TCR和CD 28的差异敏感性以及高的富集评分一致(补充图)。5C)。例如,TSS周围的染色质CXCL 10基因(图1.5D)仅在CD 28单独存在或协同刺激(TCR和CD 28共同作用)的情况下发生变化,而仅TCR没有作用。另一方面,周围的染色质CD 28与其他两种刺激相比,与其他两种刺激相比,基因本身在单纯的T细胞中对高TCR有更大的反应(补充图)。5D)。因此,对于选择的基因,TCR或CD 28刺激对基因表达的差异效应可能是通过染色质组织和转录因子募集的特定变化而介导的。

免疫gWAS基因对CD 28敏感基因的富集

T细胞活化在免疫介导的疾病发展中的作用已得到充分证实,与T细胞活化、分化和贩运相关的SNP基因已通过GWAS与疾病风险密切相关。5, 32,33,34]。我们试图研究免疫疾病相关基因是否对TCR或CD 28敏感的基因进行了富集,从而表明这两种刺激途径中的任何一条都参与了疾病的发病机制。

在我们的浓缩分析中,我们测试了10种免疫介导的条件,过敏(ALL)35哮喘(AST)[36腹腔疾病(CEL)[37],克罗恩氏病(CD)[37, 38],溃疡性结肠炎(UC)[38],1型糖尿病(T1D)[6]、多发性硬化症(MS)[39、类风湿关节炎(RA)[5],银屑病[40]和系统性红斑狼疮(SLE)[41]。我们使用了阿尔茨海默病[40, 42、骨密度(BMD)[43、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)[44]和精神分裂症(SCZ)[45]作为阴性对照,我们不会期望观察到与这些性状相关的基因座的显著富集。大多数被测试的免疫疾病表现出更明显的富集(改变)。pCD 28敏感基因与TCR敏感基因比较值<0.01).T1D例外,对CD 28和TCR敏感的基因都有类似的富集(图一)。6A).

图6:CD 28敏感基因丰富免疫GWAS位点.

A免疫介导的疾病位点(所有过敏、AST哮喘、CD Crohn病、UC溃疡性结肠炎、CED腹腔疾病、T1D型糖尿病、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、银屑病)中TCR-和CD 28-敏感基因的富集。以阿尔茨海默病(AD)、骨密度(BMD)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)和精神分裂症(SCZ)为阴性对照。B含有两个基因的ms相关位点,ZC2HC1AIL7,这是对CD 28敏感的。在上面板中显示LD(红色)中的所有SNPs,并报告GWAS指数变异,rs1021156。其中,灰色标记的两个变体rs 3808619和rs 60486739重叠CD 28上调的H3K27ac峰,预计会破坏IRF结合位点。

大多数免疫疾病相关的基因变异属于基因组的非编码区,先前的研究表明,疾病相关变异体富含活性增强子。9, 46]。因此,我们研究了H3K27ac或ATAC在CD 28敏感基因附近的活性区或开放染色质区的疾病SNPs图谱。我们观察到,平均每个性状,67%的驱动富集的基因也至少有一个疾病相关的变异重叠一个活跃的启动子或增强子或染色质可访问的位点(补充图)。6)。因此,我们测试了这些SNPs是否破坏了TFBS,将我们的分析局限于我们先前确定的丰富的TFs。我们发现36%的疾病相关变异重叠活性启动子或增强子,或开放染色质区也破坏了TFBS。最常被破坏的是与过敏、克罗恩病和多发性硬化症相关的转录因子的IRF家族。两个与MS有关的SNP[39]和高LD(r2>0.8)报告的指数变异体rs 1021156在ZC2HC1A/IL7轨迹(图)6B)。其中一个变体rs 3808619位于ZC2HC1A风险等位基因导致转录因子IRF家族结合减少,STAT 1结合增加(图1)。6B)。第二个变体rs 60486739位于IL7,小等位基因导致IRF转录因子结合增加(图1)。6B)。这两个基因均对CD 28刺激记忆细胞敏感,仅在被刺激的记忆细胞中存在含有rs 60486739变异体的H3K27ac峰,提示该变异体在调节该增强子中的TF结合和影响该基因的表达水平方面具有潜在的功能作用。

这些结果表明,与免疫介导的疾病相关的变异体可能影响染色质活性,并通过调节CD 28敏感基因的表达来引导T细胞活化的结果。

讨论

T细胞活化的过程是免疫疾病发展的基础,对其控制的详细理解对于设计更有效的治疗方法至关重要。生产性T细胞活化涉及TCR通过CD 28等受体与共刺激信号联合识别抗原。11]。然而,这两种信号的相对强度可能是高度可变的,取决于T细胞激活的设置。了解在免疫应答过程中对CD 28共刺激的需求,对于许多治疗方法,包括自身免疫和移植中的免疫抑制,以及癌症的免疫治疗,都是非常重要的。

关于幼稚细胞和记忆细胞对CD 28共刺激的要求有多大不同,目前仍有争论,普遍的观点是,与幼稚T细胞相比,CD 28共刺激对记忆激活的要求较低。47,48,49,50]。最近,研究开始质疑这一结论,并显示CD 28对小鼠记忆T细胞反应的影响[51, 52]。我们的研究为CD 28在记忆T细胞活化中的重要作用提供了额外的支持,包括对人类记忆CD4的影响。+T细胞增殖和效应功能。我们通过使用一系列不同的细胞模型来获得这一结论:我们可以操纵TCR和CD 28的水平;(Ii)只分离和分析真正被刺激的T细胞,从而减少可变激活的混杂效应(Iii)按照CD45RA表达的定义,分别评估朴素细胞和记忆细胞;(Iv)通过映射rna和CD 28强刺激所引起的染色质变化,对基因表达进行全基因组范围的观察。这使我们能够分离共刺激的两个独立部分,并识别出以TCR或CD 28敏感的方式表达的基因。通过使用这些多种方法,我们的数据表明,虽然幼稚T细胞和记忆T细胞都使用CD 28共刺激来增殖,但记忆T细胞实际上可能更敏感:利用CD 28增强细胞周期,驱动影响特定转录因子的染色质重排和靶向T细胞效应细胞因子。

重要的是要认识到,我们已经使用过的模型可能会有相关的警告。特别是,利用FCR+CHO细胞上的抗体,使用交联CD3和交联CD 28,不太可能像这些受体的天然配体所触发的那样,再现相同的细胞反应。事实上,CD3没有天然配体,CD 28有两种不同的亲和力。尽管如此,抗体结扎已经被用来有效地阐明TCR和CD 28下游的信号,这表明这些信号本身是有代表性的,尽管这些信号是由生理上不发生的异常高强度的刺激传递的。在这里,我们使用CD 28抗体来帮助描述CD 28信号,并与不太具有攻击性的刺激进行比较,包括通过CD 86滴定TCR和CD 28信号。

我们的数据表明,在某些情况下,CD 28可以单独有效地刺激记忆细胞,虽然不熟悉,但与以前的观察结果一致[23, 53]关于CD 28的功能,并暗示这一方法可能是衡量CD 28驱动效应的一种合法措施。首先,不幸的CD 28超激动剂抗体(Tgn 1412)试验测试了CD 28共刺激特异性扩展和激活Tregs的能力,揭示了对CD 28-的强烈反应,这种反应是由效应记忆T细胞特异性地驱动的。23]。其次,最近的数据表明,人类Treg细胞也可以通过单独使用CD 28抗体来扩展[53]。这与我们的观察是一致的,因为Tregs主要由记忆细胞组成,而CD 28刺激提高了记忆细胞的表达。Foxp 3。第三,现在有越来越多的证据表明,在小鼠中有条件地删除CD 28,表明记忆性T细胞反应依赖于CD 28的刺激[54,55,56,57]。虽然我们不一定把孤立的强CD 28信号设想为生物学中经常发生的一种现象,但我们的方法有助于确定CD 28信号的下游影响,而与经常用于抗CD3作为TCR信号代理的方法并无不同。事实上,我们还用FCR交联抗CD3进行比较,观察到一个强的TCR信号就足以诱导细胞分裂的关键驱动因素的表达,从而引发幼稚T细胞的增殖。令人惊讶的是,抗CD3对记忆性T细胞的增殖作用较小.因此,我们得出结论,记忆细胞不仅对激活信号更敏感,而且两种细胞类型在TCR和CD 28的使用上也有差异。因此,我们的数据表明,当细胞从CD45RA中转时,我们的平衡已经从tcr转移到cd28。+调至CD45RA现状。

CD 28参与记忆T细胞增殖的概念,从最近有关癌症治疗的检查点阻断的数据来看是很有趣的。有人认为PD-1的阻断对恢复耗尽的效应T细胞是很重要的,它需要CD 28信号。58, 59]。同样,这与我们的数据很好地一致,并且支持肿瘤中分化记忆T细胞使用CD 28的概念。我们的发现也与CTLA-4和PD1阻断(两者都增加CD 28信号)的事实是一致的,它们都能触发自身免疫[60, 61].

最后,我们的发现对理解复杂的免疫介导疾病的易感性有进一步的意义,其中T细胞激活是病理生物学过程的标志之一。免疫疾病的GWAS已经绘制了数百个相关的危险位点,其中许多含有免疫功能的基因。然而,所鉴定的基因在T细胞活化过程中的具体作用尚不清楚.通过检测对特定刺激的T细胞基因表达敏感性,我们证明GWAS基因对CD 28敏感基因的富集,而不是tcr敏感基因,从而增加了通过CD 28共刺激来支持T细胞激活在免疫介导疾病易感性中的作用。

例如,最近的一项研究发现,与健康对照组相比,IBD患者炎症肠组织中细胞因子癌基因M(OSM)的表达水平较高。62]。在我们的数据集中,OSMCD 28敏感基因是CD 28敏感基因之一,是CD 28敏感基因在CD和UC中富集的基因之一。Ctla-4领域的数据进一步证实了CD 28共刺激在免疫介导疾病中的重要性。63]。小鼠CTLA-4的丢失和人类的杂合子突变显示出深刻的自身免疫,其中肠病是一个一致的特征[14, 16, 17]。CTLA-4通路通过竞争同一配体直接调节CD 28刺激的事实[13意味着CD 28是这些自身免疫表型的直接驱动因子。然而,鉴于CD 28的激活会影响多个其他共刺激途径和效应功能,在解释CD 28影响时,需要考虑这些下游靶点的重要性。此外,这些基因中有一些对其他在本研究中没有被研究过的共刺激分子也很敏感,这突出了用一系列共同刺激器进行类似实验的重要性。

综上所述,我们的研究提供了新的洞察TCR和CD 28共刺激在激活和增殖人幼稚和记忆性CD4 T细胞中的作用,以及这些刺激对免疫疾病易感性的影响。

材料和方法

样本收集和DNA分离

采集8例健康成人的血样,年龄22~46岁。采用Ficoll-Paqueplus(GE保健,英国白金汉)密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMCs).CD4+用阴性选择EasySep CD4从PBMC中分离T细胞+浓缩工具包(StemCellTechnologies,Meylan,法国)根据制造商的指示。从活PBMCs中提取DNA。

用于RNA提取分析的样本是根据商业供应商批准的机构审查委员会协议获得的。ATAC-seq和H3K27ac Chm-seq的样品来自于NHSBT剑桥郡.所有研究用途均经研究道德委员会批准(参考编号:15/NW/0282)。


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