脑肿瘤端粒维持机制的无创性评估

端粒维持是癌症的普遍特征。大多数肿瘤，包括低级别少突胶质细胞瘤，使用端粒酶逆转录酶(TERT)表达来维持端粒，而星形细胞瘤则采用端粒延长(ALT)途径。虽然TERT和ALT是肿瘤增殖的标志和有吸引力的治疗靶点，但缺乏对TERT和ALT成像的翻译方法。这里我们证明了TERT和ALT与唯一的1核磁共振波谱(MRS)-在基因工程和病人衍生的胶质瘤模型和病人活检中可检测到的代谢特征。重要的是，我们利用这些信息机械地验证了超极化[1-13丙氨酸向丙酮酸的通量作为ALT状态和超极化的成像生物标记物[1--]13丙氨酸向乳酸的通量作为低级别胶质瘤TERT状态的影像学生物标志物。总之，我们已经确定了TERT和ALT状态的代谢生物标志物，这为将关键的致癌信息整合到非侵入性成像模式中提供了一种方法，可以改进肿瘤诊断和治疗反应监测。

端粒维持机制是癌症的基本特征。1。端粒是重复的核蛋白结构，保护染色体末端免受dna损伤。2。随着每一个细胞的分裂，它们都会变短，直到细胞经历衰老或凋亡。2。为了无限期地增殖，肿瘤细胞必须获得一个tmm。1,2,3。端粒酶逆转录酶TERT)在癌症中，包括在低级别少突胶质细胞瘤(Lgogs)中，主要表达为tmm。2,3,4,5。TERT是端粒酶合成端粒DNA的催化亚基，除干细胞外，其在正常体细胞中的表达在出生时被沉默。3。突变TERT启动子在癌症中最常见的非编码突变中的排名3,4,5并为转录因子GABP创造了一个新的结合位点，该位点重新激活。TERT表达6,7。与lgogs不同，低级别星形细胞瘤(Lga)激活了一种不依赖TERT的同源重组介导的新端粒dna合成机制，即替代端粒延长(Alt)途径。8,9,10。染色质重塑蛋白α地中海贫血/智力低下综合征X-连锁的功能缺失突变ATRX)，发生在大多数LGA中，与ALT通路的诱导有关，ATRX重新表达已被证明可以抑制丙氨酸转氨酶途径。4,11,12,13.

TMMS是有吸引力的治疗靶点。TERT启动子突变只发生在肿瘤细胞中，而不发生在正常体细胞或干细胞中。3。虽然直接靶向TERT活性会导致干细胞抑制而产生毒性。3，抑制TERT突变体表达TERT破坏GABP功能的启动子是一种可行的治疗策略。6。ALT也是药物发现的焦点。8,14。蛋白激酶atr是丙氨酸转氨酶途径的关键调节因子，它选择性地杀死了ALT阳性的胶质瘤，脑穿通物atr抑制剂berzosertib和azd 6738目前正在针对实体肿瘤进行临床试验。15.

以前的研究已经将TERT与代谢重排联系在一起。16。戊糖磷酸途径对TERT脱糖葡萄糖通量的药理或遗传抑制作用17和新的脂肪酸合成在胶质瘤中的作用18。TERT还与氧化还原状态的改变有关，特别是与更高水平的还原型谷胱甘肽(GSH)和降低癌细胞的氧化应激有关。19。虽然人们对谷丙转氨酶与代谢之间的联系了解较少，但研究表明，谷丙转氨酶细胞下调了端粒相关蛋白rap 1的表达。13与新陈代谢有关20.

临床胶质瘤患者的治疗很大程度上依赖于非侵入性磁共振成像(Mri)方法，如T1加权前、后钆、t2/flair和扩散加权成像。21因为胶质瘤的解剖位置及其浸润性质可以禁止活检取样和/或手术切除。22,23。然而，解剖MRI不足以检测导致胶质瘤增殖的分子事件，不能将“真”肿瘤与胶质增生、水肿和坏死的形态相似的区域区分开来。24,25。重要的是，没有可靠的方法来区分肿瘤复发与治疗相关的影响，如假性进展和假性反应。26,27.

磁共振波谱(MRS)是一种互补的方法，它是一种安全、非放射性的活体细胞、动物和病人的成像代谢方法。28,29,30...因为致癌事件常常与代谢重新编程有关1,31，MRS可以提供潜在肿瘤遗传学的下游读数。1H-MRS测定稳态代谢物水平，并用于临床。28。热极化13C-夫人13C标记的前体可以了解代谢通量，但它的低灵敏度限制了它的翻译值。28。然而，超极化的最新发展13C-MRS使信噪比提高了10,000倍以上，为代谢通量的成像提供了一种平移的方法。29,30.

TMMs作为肿瘤增殖的分子标志，是“真正”肿瘤负担的诊断性生物标志物。因此，成像TMM状态有可能非侵入性地区分肿瘤与正常脑和解剖上难以区分的胶质细胞病变、水肿、坏死、假性进展和假性反应。影像学TMMS也可以告知对化学放射治疗和新出现的TMM抑制剂的反应。在这种情况下，TMMS和代谢重新编程之间的联系提供了一个机会，利用TMM连接的代谢改变来实现在LGOG和LGAs中TMM状态的无创、MRS可检测的成像。

在这里，我们证明，在基因工程和病人衍生的lgog和lga模型中，以及在病人活检中，TERT与升高有关。1H-MRS-检测到NAD(P)/H、GSH、天冬氨酸和AXP(来自ATP、ADP和AMP的联合信号)水平，而ALT通路则导致α-酮戊二酸(α-KG)、谷氨酸、丙氨酸和丙氨酸的升高.重要的是，我们利用这些信息来识别和机械地验证超极化[1-13丙氨酸向丙酮酸的代谢是LGAs和超极化过程中ALT途径的在体成像生物标记物[1--]13丙氨酸向乳酸的通量是LGOG中TERT表达的体内成像生物标记物。

TERT表达与ALT通路1基因工程胶质瘤模型中可检测到的代谢信号

我们从基因工程的、永生化的正常人星形胶质细胞(Nha)模型开始我们的研究。32表达突变体异柠檬酸脱氢酶1(IDHmut)，这是LGOG和LGAs的一个决定性特征。33,34。我们检查了被设计成内源性再激活的细胞。TERT表达(NHA)TERT)或激活下面的ALT通路ATRX损失(NHA)ALT)13,32,35,36。作为对照，我们检查了仅表达的细胞。IDHmut缺乏TERT或ALT通路(NHA)控制)13,35. TERT端粒酶在NHA中的表达和活性已被证实。TERT单元格(以前在参考文献中)。35和补充图。1A、b)。同样，与之前的研究相一致13，我们核实了ATRX在NHAALT细胞(附图)1C，d)通过确认c-环的存在而激活ALT通路(补充图)。1E)，它是由单链端粒dna组成的染色体外圆圈，被认为是ALT途径的特异性和可量化标记。37,38。NHA的ALT状态ALT细胞以前也是通过检测端粒姐妹染色单体交换(T-SCE)来确认的，T-SCE是ALT途径的另一个表型标志。13。补充表1提供细胞株及其IDHmut和TMM状态的概述。

我们检测了细胞提取物中稳态代谢物的含量。1H-夫人(无花果。1A)。为了以一种公正的方式识别tmm连接的代谢改变，我们对1H-MRS数据到主成分分析(PCA)。如图所示。1B，PCA区分了NHA的代谢特征。控制、NHATERT，以及NHAALT细胞。偏最小二乘判别分析(PLSDA)在投影(VIP)评分中的重要性分析39提示NAD(P)/H(NAD的联合信号)升高+、NADP+，NADH和NADPH，因为这些实体不能可靠地被1H-MRS)、GSH、天冬氨酸和AXP在NHA中的应用TERT细胞与NHA的区别控制(补充图。2A)。增加α-kg、谷氨酸、丙氨酸和axp在nha中的作用ALT细胞与NHA的区别控制(补充图。2B)。NHA中NAD(P)/H、GSH和天冬氨酸升高TERT和较高的α-kg、谷氨酸和丙氨酸在nha中的含量。ALT区分这两种模式(附图)。2C)。绝对代谢物水平的单因素分析1H-MRS谱证实了这些结果的统计意义(p < 0.005 for all metabolites; Fig. 1C)。我们进一步测量了NAD的水平。+、NADP+、NADH、NADPH、α-KG、GSH和氧化谷胱甘肽的分光光度法测定.与以往将TERT与氧化还原状态联系起来的研究相一致17,18,19，我们的结果表明NADH(图)。1D)和NAD+(无花果)1E)在NHA中显著升高。TERT细胞相对于NHA控制和NHAALT，导致NAD减少+/NADH比率(附图)二维空间)。α-kg在nha中较高。ALT细胞相对于NHA控制和NHATERT(无花果)1F)而NADPH(附图)2E)和GSH(附图)。2F)在NHA中显著升高。TERT细胞相对于NHA控制和NHAALT。氧化谷胱甘肽含量无差异(补充图)。2G)或NADP+(补充图。2H)在NHA之间控制、NHATERT，或NHAALT模特们。

我们的研究确认了IDHmut酶产物2-羟基戊二酸(2-HG)的类似水平。33,34，在NHA之间控制、NHATERT，以及NHAALT模型(附图)3)，表明上述代谢生物标记物与TERT或ALT状态有关，而与IDHmut相反。然而，为了进一步评估IDHmut, TERT，和ATRX，我们还检查了不表达IDHmut而且要么ATRX-缺乏(NHA)ATRX-IDHmut−)13或表示TERT(Nha)TERT+IDHmut−)35。缺乏IDHmut在这些细胞系中的表达已被证实。13,35。我们也证实在nha中没有2-hg。ATRX-IDHmut−和NHATERT+IDHmut−细胞经1H-夫人(见附图。3)。以前的研究表明ATRX在不存在.的情况下的损失IDHmut不会导致丙氨酸转氨酶途径的发展13。根据这些研究，我们证实在nha中没有c圈。ATRX-IDHmut−细胞(附图)1E)。在这些细胞中，T-SCE的缺乏也已得到证实。13。重要的是，与NHA相比ALT细胞，1在nha中，可检测到的谷氨酸、α-kg、丙氨酸或axp的水平没有改变。ATRX-IDHmut−细胞相对于NHA控制细胞，从而连接这些代谢物与ALT途径(补充图。3)。类似的，与NHA不同的是TERTNHA细胞、GSH、NAD(P)/H、天冬氨酸和AXP水平无明显变化。TERT+IDHmut−细胞相对于NHA控制细胞(见附图。3)。总的来说，本节的结果表明GSH、NAD(P)/H、天冬氨酸和AXP是潜在的。1H-MRS-可检测的TERT状态生物标志物和谷氨酸、α-KG、丙氨酸和AXP作为低度胶质瘤ALT状态的潜在生物标志物。

超极化13丙氨酸可非侵入性监测基因工程胶质瘤模型中的TMM状态

α-KG参与丙氨酸由丙氨酸氨基转移酶介导的丙氨酸转化为丙酮酸的过程。2A)。乳酸脱氢酶催化丙酮酸进一步转化为乳酸依赖于NADH40,41。因为我们的数据表明α-kg在nha中升高。ALTNHA中NADH升高的细胞TERT细胞(见图1.1C，d)，我们检查了超极化的能力[1-13丙氨酸探针TMM状态。[1-13C]-丙氨酸极化(T1=44±4s，12%极化，与以往研究一致。)42,43)，添加到活细胞和动态的悬浮液中。13C谱。纳哈控制细胞只产生少量的[1--]-13C]-丙酮酸和[1--]-13C]-乳酸，与这些细胞中α-KG和NADH的限值水平一致(见图)。2B)。相反，NHAALT细胞产生较高水平的[1--]13C]-丙酮酸盐，与α-KG升高相一致(图1)。2C)。然而，进一步转换为[1-]13由于限制NADH，乳酸是最小的。纳哈TERTNADH较高的细胞，转化为超极化的细胞[1--]13丙氨酸至[1-]-13C]-丙酮酸盐，然后进入[1--13乳酸(图1)。二维空间)。这些结果在显示[1-最大产量]的建立曲线中得到突出显示。13C]-NHA中的丙酮酸ALT细胞(图1.2E)和最大产量[1--13乳酸在NHA中的含量TERT(无花果)2F)。定量表明，NHA中丙酮酸/丙氨酸的比值显著升高。ALT细胞相对于NHATERT和NHA控制(无花果)2G)和显著高于NHA的乳酸/丙氨酸比值TERT细胞相对于NHAALT和NHA控制(无花果)2H)。这些结果表明，超极化的差异代谢[1--]13C]-丙氨酸至[1-]13丙[丙酮酸]或[1-]-13乳酸非侵入性监测低级别胶质瘤细胞TMM状态。

1H-MRS和超极化13C]-丙氨酸可跟踪患者LGOG和LGA模型中TERT表达或ALT通路的调节。

接下来，我们研究了在临床相关的、患者源性的lgog和lga模型中TERT表达和ALT通路的调制是否导致了相应的调节。1H-MRS-可检测到的代谢改变和超极化[1-13丙氨酸代谢。为此，为了了解TERT状态，我们对bt 54神经球进行了研究，这些球最初是从一位携带IDHmutLGOG肿瘤44,45,46，并检查了沉默的效果。TERT使用两个不重叠的siRNA寡核苷酸TERT。我们证实大幅减少了TERT端粒酶的表达和活性(附图)。1A，对细胞增殖无伴生影响(附图)。4A)。如图所示。3A, 1H-MRS-NHA中与TERT相关的代谢物的可检测水平TERT模型(参见图1)。1CBt 54 TERT−神经球的NAD(P)/H、GSH、天冬氨酸和AXP较BT 54 TERT+显著降低。分光光度法证实NADH和NAD+Bt 54 TERT−神经球相对BT 54 TERT+减少，导致较高的NAD+/NADH比率(附图)4B–d)。相反，与ALT状态相关的代谢物水平，即α-KG、谷氨酸和丙氨酸在BT 54 TERT−神经球中没有改变。3A)。重要的是，与TERT沉默后NADH减少一致，超极化[1--]13丙氨酸被代谢成[1--]-13C]-丙酮酸，但进一步代谢为[1--]13C]-乳酸在BT 54 TERT−细胞中消失(图1)。3B)，导致超极化乳酸/丙氨酸比值显著下降，超极化丙酮酸/丙氨酸比值相应增加(图一)。3C).

为了询问ALT状态，我们检查了bt 142神经球，这些球是从ATRX-缺乏IDHmut LGA肿瘤47并已被证明使用ALT通路维持端粒。13。与以前的研究一致12,13，我们通过短暂的再表达抑制bt 142神经球的ALT通路。ATRX(见附图。1C以证实ATRX mRNA水平和补充图。4EATRX蛋白水平)。我们通过证实c-环的丢失，证实了BT 142 ALT−神经球对ALT途径的抑制作用(补充图)。1E)和T-SCE(补充图.)1g)。ALT通路的抑制并不能抑制BT 142的增殖(附图)。4F)。与我们在nha模型中的结果一致，通过1H-MRS显示α-KG、谷氨酸、丙氨酸和AXP在BT 142 ALT−神经球中相对于BT 142 ALT+显著降低(图2).三维空间)。相反，与TERT相关的代谢物水平，即NAD(P)/H、GSH和天冬氨酸，则不受ALT途径的抑制而改变。三维空间)。重要的是，与BT 142 ALT−神经球中还原的−-KG一致，超极化[1--]13丙氨酸对丙酮酸的代谢显著降低(图1)。3E)。定量数据显示BT 142 ALT−神经球的超极化丙酮酸/丙氨酸和乳酸/丙氨酸比值相对于BT 142 ALT+显著降低。3F).

除了评估沉默的效果TERT表达或ALT途径如上所述，我们也质疑我们的代谢成像生物标记物在等基因患者衍生模型，要么是ALT+或TERT+。以前的研究表明TERT在ALT+细胞中的表达可能导致TERT+表型，从而提供一个等基因平台来询问TMM状态48,49,50。因此，我们研究了两对患者衍生的LGA模型(BT 142 ALT+和MG 119 ALT+)。TERT(BT 142 TERT+和MG 119 TERT+)。MGG 119神经球是从An中分离出来的。ATRX-缺乏IDHmut LGA肿瘤51之前已经证明过使用ALT途径作为他们的TMM。13。在此，我们证实MGG 119 ALT+神经球使用ALT途径，这一点可以从ATRX表达式(附图)1C)，c-环的存在水平与u2OS细胞中观察到的水平相当，而u2OS细胞被认为是ALT表型的标准。37,38(补充图。1E)与T-SCE(附图)的发生。1F)。而MGG 119 TERT+和BT 142 TERT+神经球则表现出TERT表达和端粒酶活性(附图)。1A(B)伴随c-圆形成的损失(附图)。1E)和T-SCE(补充图)的损失。1F)。重要的是要注意到TERTMGG 119 TERT+和BT 142 TERT+神经球的表达和端粒酶活性与NHA观察到的内源性水平相当。TERT和患者派生的BT 54 LGOG模型(见附图)。1A、b)。如图所示。4A，b, 1MGG 119 TERT+和BT 142 ALT+神经球中TERT连接代谢物(GSH、NAD(P)/H和天冬氨酸)的H-MRS水平显著高于MGG 119+和BT 142 ALT+神经球，ALT连接代谢物(α-KG、谷氨酸和丙氨酸)水平显著低于MGG 119+和BT 142 ALT+神经球。与AXP无法区分NHA一致TERT和NHAALT模型(见附图。2CMGG 119 TERT+和BT 142 TERT+神经球与相应的ALT+对应物相比，AXP水平无显着性差异(图5)。4A，b)。我们还证实了MGG 119 TERT+和BT 142 TERT+神经球模型中NADH水平相对于MGG119 ALT+和BT 142 ALT+分别升高(补充图图)。4G，h)。重要的是，MGG 119 TERT+和BT 142 TERT+神经球与NADH升高相一致，表现出明显的超极化[1--]。13C]-超极化乳酸[1--]13丙氨酸分别相对于MG 119 ALT+和BT 142 ALT+神经球(图1.4C-f)。总之，本节的结果表明TERT的表达和ALT通路与我们的1H-MRS生物标记物和超极化物[1-13丙氨酸代谢在临床相关的，患者源性的LGOG和LGA模型。

TERT的表达和ALT途径导致原位肿瘤异种移植体内稳态代谢物水平的改变。1H-夫人

接下来，我们检查了1H-MRS生物标记物在原位肿瘤移植中的应用。自从NHA控制细胞缺乏TMM，在体内不形成肿瘤。35。因此，我们检查了1原位NHA体外提取液的H-MRS谱TERT和NHAALT异种肿瘤移植，并与无瘤健康对照进行比较。如图所示。5A与我们的细胞研究一致，NHA中NAD(P)/H、GSH、天冬氨酸和AXP显著升高。TERT肿瘤与正常脑和NHA的关系ALT肿瘤。α-kg、谷氨酸、丙氨酸和axp在nha中显著升高。ALT肿瘤与正常脑和NHA的关系TERT(无花果)5A)。我们进一步证实了nha中NADH的显著增加。TERT用分光光度法测定肿瘤。5B)。我们观察到与IDHmut这些模型的背景及对肿瘤的增殖等2-hg显著升高。35磷胆碱52在NHA中TERT和NHAALT相对于正常大脑的肿瘤(图)。5A)。与以前的研究一致28我们还观察到正常脑组织中的总肌酸和N-乙酰天冬氨酸含量明显高于两种肿瘤模型(图1)。5A)。这些结果表明1H-MRS在原位肿瘤移植中有检测TERT或ALT状态的潜力.

超极化13丙氨酸非侵入性监测基因工程和患者源性lgog和lga模型的TERT表达和ALT通路

然后，我们研究了在体内用超极化技术进行TMM非侵入性成像的可行性[1-13丙氨酸首先，我们获得了动态1315 mm轴向脑板的C谱，并将无瘤健康大鼠与原位nha大鼠进行比较。TERT或NHAALT肿瘤。静脉注射超极化后[1-13丙氨酸，我们观察到了[1-13C]-丙酮酸和[1--]-13乳酸在NHA中的含量TERT以乳酸为主要产物峰的荷瘤大鼠。5C，d)。注射超极化[1--]13丙氨酸进入NHAALT荷瘤大鼠表现出相当大的超极化[1--]13C]-丙酮酸盐并限制进一步转化为超极化[1--]13乳酸(图1)。5E)，使丙酮酸成为主要的产物峰(如图所示)。5E，f)。相反，无肿瘤健康对照大鼠没有表现出超极化的代谢[1-13C]-丙氨酸至[1-]13丙[丙酮酸]或[1-]-13C]-乳酸(补充图1)。5A、b)。NHA的代谢差异TERT或NHAALT在总结中重点介绍了荷瘤大鼠和无瘤对照。13补充图C谱。5C。重要的是，乳酸/丙氨酸的比值能区分NHA。TERT来自健康大脑的肿瘤(附图)。5D)，而丙酮酸/丙氨酸比值则能区分NHA。ALT来自健康大脑的肿瘤(附图)。5E)。超极化的信噪比无显着性差异[1-13丙氨酸(附图)5F)无瘤大鼠与荷瘤大鼠之间。应该注意的是，在NHA中TERT和NHAALT荷瘤大鼠超极化丙氨酸极大值(注射后18s)和丙酮酸(注射后21s)之间存在时间延迟，丙酮酸和乳酸极大值之间进一步延迟(24 s后注射；见图2)。5D，f)。结合缺乏超极化丙氨酸代谢在无瘤健康动物(补充图。5A这些结果表明丙氨酸代谢到丙酮酸或乳酸可能起源于大脑中的肿瘤。如果肝脏或血管中发生超极化丙氨酸代谢，丙氨酸、丙酮酸和乳酸被输入大脑，那么这三个物种都有可能同时出现在光谱阵列中，也可能出现在健康动物身上。

为了进一步验证这些发现并确定超极化的空间分布[1-13丙氨酸代谢，我们进行了二维回波平面光谱成像(EPSI)。53。静脉注射超极化后[1-13丙氨酸进入NHATERT-荷瘤大鼠，产生[1--13C]-丙酮酸和[1--]-13在肿瘤中观察到乳酸，但未观察到对侧正常脑体素，与细胞和细胞的数据一致。13C板坯收购，乳酸是主要的产品高峰(图)。6A)。乳酸/丙氨酸比值在NHA中显著升高。TERT肿瘤体素与对侧正常脑的关系(图)。6B)。超极化的信噪比无显着性差异[1-13C]-肿瘤与对侧正常脑之间的丙氨酸。6C)。这些结果在代谢热图显示乳酸在大鼠原位nha中的特异性定位中得到了突出的体现。TERT肿瘤(如图所示)。6d)。相反，超极化[1--]13丙氨酸分布在整个大脑中(如图所示)。6d).

为了建立临床相关性，我们还检测了超极化的能力。13丙氨酸用于评估患者源性LGOG模型的TERT状态。由于bt 54模型在体内不形成肿瘤，所以我们研究了SF 10417模型，该模型是从一位携带IDHmutLGOG肿瘤6,54. TERTSF 10417模型已经证实了端粒酶的表达和活性(补充图)。1A，b和以前的参考文献。6,54)。如图所示。6E，与国家医管局提供的数据一致。TERT模型，生产[1--]13C]-丙酮酸和[1--]-13C]-超极化乳酸[1--]13C-丙氨酸在肿瘤中可见，而对侧正常脑体素未见，乳酸含量高于丙酮酸。肿瘤体素组乳酸/丙氨酸比值明显高于对侧正常脑组(图1)。6f)，而在超极化方面没有差别[1-13丙氨酸信噪比(图1.6g)。重要的是，代谢热图显示，乳酸/丙氨酸比值描述了肿瘤，而丙氨酸则分布在整个大脑(图一)。六小时).

大鼠原位NHA的二维EPSI研究ALT肿瘤表现为[1--]13C]-丙酮酸和[1--]-13C]-肿瘤中的乳酸，而非对侧正常脑体素(图1)。7A)。与活细胞的数据一致13C平板实验显示，丙酮酸为主要产物峰，对侧脑的丙酮酸/丙氨酸比值显著高于对侧脑(图1)。7b)。超极化无显着性差异[1-13C]-肿瘤与对侧正常脑的丙氨酸信噪比(图1)。7C)。代谢热图检查表明，超极化丙酮酸/丙氨酸比值是NHA肿瘤的有效圈定因子。ALT荷瘤大鼠(图1)。7D).

为了证实我们在临床相关的LGA模型中无创监测ALT状态的能力，我们对原位BT 142肿瘤移植大鼠进行了2D EPSI。如图所示。7E，与NHA提供的数据一致。ALT超极化肿瘤13C]-丙氨酸代谢至[1--]13C]-丙酮酸和[1--]-13肿瘤体素内可见乳酸，对侧正常脑未见乳酸，以丙酮酸为主要产物峰。BT 142肿瘤的丙酮酸/丙氨酸比值明显高于对侧正常脑组织(图1)。7F)在超极化方面没有显着性差异[1-13丙氨酸信噪比(图1.7g)。这些结果突出显示在代谢热图显示肿瘤的丙酮酸/丙氨酸比值(如图所示)。7H)。综合起来，这些结果证实了超极化的效用。13丙氨酸在基因工程和患者衍生的LGOG和LGA模型中的非侵入性视觉化TMM状态。

谷氨酰胺酶1(GLS 1)、烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)、丙氨酸转运蛋白ASCT 2和LAT 2是TMM连锁代谢改变的分子决定因素。

接下来，我们开始机械地验证我们的代谢生物标记物。GLS 1是α-kg稳态的关键成分。31。GLS 1是谷氨酰胺转化为谷氨酸的限速酶，与α-kg处于平衡状态。31。GLS活性在NHA中显著升高。ALT细胞相对于NHATERT和NHA控制(补充图。6A)。对体内外肿瘤组织的检测显示，NHA中GLS活性也显著升高。ALT与NHA相关的肿瘤TERT和无肿瘤的正常大脑(附图)。6B)。重要的是，BT 142 ALT−神经球的GLS活性较BT 142 ALT+显著降低。8A)。为了直接证实GLS 1在连接ALT与α-KG和超极化[1-]中的作用13丙氨酸代谢，我们沉默了GLS 1在BT 142神经球中，利用两个不重叠的siRNA寡核苷酸进行RNA干扰。我们证实GLS 1在BT142GLS−神经球中的表达和活性明显缺失(补充图)。6C、d)。1BT 142 GLS−神经球中的H-MRS-可检测谷氨酸和−-KG较BT 142 GLS+显著降低(图1).8B)。超极化的检验[1-]13丙氨酸代谢显着地降低了丙酮酸和乳酸的产生。8C)，从而使BT 142 GLS−神经球中丙酮酸/丙氨酸和乳酸/丙氨酸的比值显著降低，与BT 142 GLS+相比(补充图1)。6E)。这些结果表明GLS 1是ALT途径、α-KG和超极化[1-]之间的一种机械联系。13丙氨酸代谢为丙酮酸。

NAMPT是将烟酰胺转化为烟酰胺单核苷酸的限速酶，在NAD中起着至关重要的作用。+癌症的生物合成55，包括低级别胶质瘤56。与NAD升高相一致+和NHA的NADHTERT细胞(见图1.1D，e)，NAMPT活性在NHA中显著升高。TERT细胞相对于NHAALT和NHA控制(补充图。6f)。Nha中NAMPT活性也显著升高。TERT肿瘤组织与NHA的关系ALT和无肿瘤健康的大脑(补充图。6g)。重要的是，TERT沉默显著降低BT 54神经球的NAMPT活性(图1)。8D)。为了询问NAMPT在TERT细胞中的作用，我们沉默了NAMPT在BT 54神经球中，利用两个不重叠的siRNA序列进行RNA干扰，证实了NAMPT表达和活性的显著丧失(附图)。6H，i)。NAMPT沉默显着减少NADH(图1)。8E)和NAD+(补充图。6J)。此外，[1]13C]-超极化产生乳酸[1-13C]-丙氨酸在BT 54 NAMPT−神经球中相对于BT 54 NAMPT+显著降低，导致[1-]的积累。13C]-丙酮酸(图1.8F和补充图。6K)。这些结果表明NAMPT在将TERT连接到NADH和超极化[1--]中的机制作用。13丙氨酸代谢为乳酸。

我们还检查了与超极化有关的其他因素[1-13丙氨酸代谢(见图1)。2A)。以前的研究表明，丙氨酸通过血脑屏障(Bbb)，通过氨基酸转运蛋白丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸转运体2(Asct 2)进入细胞。L-氨基酸转运体(LAT 2)57,58,59. ASCT 2和LAT 2在两种NHA中均有较高的表达。TERT和NHAALT细胞相对于NHA控制(补充图。7A)。与较高的转运蛋白表达相一致，胞内导入[1--]13从培养基中提取的丙氨酸在NHA中显著升高。TERT和NHAALT细胞相对于NHA控制(补充图。7b)。重要的是，沉默TERT表达显著减少ASCT 2和LAT 2表达和[1-]13C]-BT 54 LGOG模型中的丙氨酸进口(图1.8g，h)。类似地，表示ASCT 2和LAT 2以及[1-]13丙氨酸进口在BT 142 ALT神经球中相对于BT 142 ALT+显著降低(图1)。8I，j)。这些结果提示TERT的表达和ALT通路在LGOG和LGAS中的表达与丙氨酸进口的增加有关。

丙氨酸转氨酶(将丙氨酸转化为丙酮酸)的检测显示，NHA之间的活性没有显着性差异。TERT、NHAALT，以及NHA控制细胞(附图)7C)。正常脑与NHA之间丙氨酸转氨酶活性无显着性差异(P>0.05)。TERT或NHAALT肿瘤(附图)7D)。乳酸转化为丙酮酸依赖于乳酸脱氢酶的活性和NADH的稳态水平。40乳酸41。乳酸脱氢酶活性与稳态乳酸无显着性差异(P>0.05)。TERT、NHAALT，以及NHA控制正常脑和NHA之间的细胞TERT或NHAALT肿瘤(附图)7E-h)。综合起来，本节中提出的结果确定了GLS 1、NAMPT、ASCT 2和LAT 2在超极化[1--]中的机械作用。13丙氨酸在ALT和TERT模型中对丙酮酸和乳酸的代谢。

在lgog和lga患者活检中TERT的表达和ALT通路与MRS可检测的代谢重新编程有关。

最后，为了确定我们的代谢生物标志物对人类患者的有效性，我们检查了来自LGOG和LGA患者的活检。由于获得正常的脑活检具有挑战性，我们将肿瘤组织与非肿瘤性胶质细胞增生活检进行了比较。60。这也是为了检测TMM的状态是否能区分肿瘤和胶质细胞，这是目前一个具有挑战性的临床问题。24,25。首先，我们确认TERTLGOG活检组织中端粒酶的表达及活性9a，b)。我们通过测量来证实lga活检中存在ALT通路。ATRX损失和c-圆的形成(图.9C，d)。与我们的LGOG模型数据一致，LGOG活检组织中NAD(P)/H、GSH、天冬氨酸和AXP明显高于LGA和胶质增生(图1)。9E)。我们用分光光度法证实了NADH的增加。9F)。与以前的研究一致，我们还观察到了显著升高的胱硫醚。61牛磺酸62在LGOG中，与LGA和胶质细胞病变相关的活检。α-KG、谷氨酸、丙氨酸和AXP在LGA活组织中相对于LGOG和胶质细胞病变显著升高(见图)。9E)，与我们来自LGA模型的细胞和体内外数据一致。根据以前的报告，甘氨酸和苏氨酸在LGA活检中相对于lgog和胶质细胞增多。61。正如预期的那样，2-hg和磷胆碱在lgog和lga活检中相对于胶质细胞增多。62。与LGOG和LGA相比，胶质增生组织中肌肌醇、总肌酸和N-乙酰天冬氨酸含量显著升高.重要的是，与我们的细胞和体外模型的数据一致，在LGA活检中GLS活性明显高于LGOG和胶质细胞(图1)。9g与LGA和胶质细胞病变相比，LGOG组织NAMPT活性明显升高(图1)。9H)和丙氨酸转运蛋白的表达ASCT 2和LAT 2在LGOG和LGA活检中与胶质细胞病变的相关性均较高(如图所示)。9I)。综上所述，这些结果机械地验证了我们的MRS-可检测的代谢生物标志物和假定的分子机制在病人样本中，并突出了他们在区分肿瘤和胶质疾病方面的潜在用途。

端粒维持是癌症的一个基本特征。1。大多数(约85%)的人类肿瘤，包括LGOG，使用TERT表达来维持端粒。2,3,4,5，而~15%的肿瘤，包括LGA，使用ALT途径。8,9,10。由于其与肿瘤增殖的内在联系，影像学TERT表达或ALT途径有可能鉴别肿瘤与正常脑组织及脑胶质瘤、水肿、坏死等解剖相似的病变，并区分治疗反应与假性进展或假反应。TERT的表达和ALT途径也是治疗的靶点。2,9,63非侵入性的TERT或ALT状态显像方法有助于TERT或ALT抑制剂的发展和未来的临床翻译。然而，目前缺乏无创成像TERT或ALT状态的方法.在这项研究中，我们首次利用了对TERT表达的代谢后果和ALT途径的了解来识别1差示超极化的H-MRS生物标记物[1--]13C]-丙氨酸代谢，可无侵入性地告知TMM在体内的状态。

以前的研究已经确定了TERT在NF-κB和wnt/β-catenin信号传递、凋亡抗性和代谢重编程中的非规范作用。16。我们的发现加强了TERT和代谢重新编程之间的联系。具体来说，我们在患者来源的lgog模型和lgog患者活检中发现的gsh升高，加强了先前在基因工程模型系统中将TERT与gsh和ndph升高联系起来的研究。17,18,19。我们的研究还发现了新的代谢改变，如天冬氨酸和NAD的增加。+，NADH以前没有与TERT的表达相关，有可能作为代谢显像或治疗靶点。重要的是，我们的研究是第一次将ALT途径与癌症中的代谢重组联系起来。

弥漫性胶质瘤历来按组织学分级分类。然而，组织病理学上相似的胶质瘤具有不同的致癌突变，导致肿瘤的发生和维持。64。因此，世界卫生组织2016年分类方案包括分子特征，以指导临床决策。64。在定义低级别胶质瘤的分子特征中，相互排斥的突变TERT启动子和ATRX，分别定义了LGOG和LGAs。4,10,64，因为它们都会导致TMMS。然而，缺乏无创检测TMM状态的方法.目前，TMM状态的检测是基于对肿瘤活检的分析。2,8,37,38。然而，活检取样具有侵入性，难度大，限制了对治疗或肿瘤复发时TMM状态的纵向分析。22,23。PET或光学成像检测TERT表达的方法已有报道。65,66，它们需要使用抗体。65或反义寡核苷酸66由于BBB穿透性有限，限制了在胶质瘤中的应用。此外，PET成像是放射性的，这限制了对TMM状态的纵向评估，这是因为考虑到辐射照射，而光学成像在胶质瘤中的应用受到深度穿透的限制。67。相反，1H和超极化13本文报道的C-MRS生物标记物在疾病进展和治疗反应中提供无创的、临床上可翻译的TMM状态成像方法。重要的是，我们的生物标志物提供了一种方法，将我们对胶质瘤遗传学的理解与影响临床病人管理的非侵入性成像方式结合起来。

多种证据表明，我们的代谢生物标记物最终与TMM状态有关。首先，不同的TMMs，即TERT的表达和ALT途径有不同的代谢特征，提示代谢的改变并不仅仅是端粒维持介导的肿瘤增殖的结果。观察到传统的肿瘤增殖标志物如磷胆碱，进一步强调了这一点。52，则不与TMM状态相关联。第二，沉默TERT表达或ALT通路使它们的关联正常化。1H-MRS-可检测的生物标记物和超极化的[1--]13丙氨酸代谢，指出TMMS与这些生物标志物之间的因果联系。同样，外生TERT等基因ALT+模型中的表达调控1H-MRS-可检测到的TERT−和ALT连接代谢物的水平以及超极化[1-[1-]13丙氨酸代谢。此外，ATRX-缺乏NHAS，不表达IDHmut之前已经证明缺乏ALT途径13不要显示与ALT表型相关的代谢改变，进一步指出MRS生物标志物的特异性。第三，我们已经确定NAMPT、GLS1和丙氨酸转运蛋白ASCT 2和LAT 2是TERT表达与ALT通路及其相关的机制联系。1H和超极化13可检测到的代谢生物标记物。最后，我们发现超极化[1--]13丙氨酸能够在大量的基因工程和患者衍生的lgog和lga模型中对TMM状态进行非侵入性监测。这种一致性突出了超极化[1-]的鲁棒性。13C]-丙氨酸代谢对TMM显像的影响，提示虽然我们不能完全排除其他分子因素影响我们代谢生物标志物的可能性，但TERT表达和ALT途径是主要因素。

我们的研究指出了1核磁共振成像TMM状态。已有研究报道胶质瘤患者体内GSH的检测。68,69。我们还在lgog患者活检中检测到gsh前体cystathionine的水平升高，这与先前的一项研究相一致，该研究报告称cstathionine是lgogs的体内生物标记物。61。在LGA中也可以检测到谷氨酸升高。1体内H-MRS68。重要的是，代替单一的代谢生物标记物，我们建议使用不同的一组1H-MRS-可检测的生物标记物，结合微分超极化[1-13丙氨酸代谢，具有提供低级别胶质瘤TMM状态无创“指纹”的潜力。

乳酸脱氢酶A在低级别胶质瘤中的低表达是启动子甲基化的结果70。然而，在我们的LGOG和LGA模型中可以检测到乳酸脱氢酶活性和丙酮酸通量，这可能是由于残留乳酸脱氢酶A的表达低于免疫印迹检测限值，以及乳酸脱氢酶A启动子甲基化的变化所致。71或乳酸脱氢酶B表达72...重要的是，当比较LGOG和LGA模型时，从超极化产生乳酸的差异[1--]13丙氨酸是由于NAMPT降低NAMPT产生NADH而引起的NAGG中NADH升高所致，抑制了乳酸的产生并导致丙酮酸的积累。

理论上，超极化13C]-丙酮酸向乳酸的代谢也应有助于监测lgogs中NADH的TERT相关增加。40。然而，先前的一项研究表明，超极化[1--]13在BT142LGA模型中，与对侧正常脑相比，丙酮酸在肿瘤组织中的乳酸产量没有显著提高。73。我们的结果表明丙氨酸产生的丙酮酸较高，但由于其ALT状态，BT 142模型的乳酸产量有限，这与先前的研究一致，有助于突出超极化的用途[1--]。13丙氨酸Ruiz-Rodado等人71还表明超极化产生的乳酸[1--]13在TS 603和NCH 1681模型中，BT 142肿瘤组织中丙酮酸含量明显高于对侧正常脑组织。他们将这些差异与肿瘤侵袭性和不同水平的乳酸脱氢酶A沉默联系起来，表明丙酮酸产生的超极化乳酸是低级别胶质瘤侵袭性的生物标志。71。我们的结果提示低级别胶质瘤模型的TMM状态可能是另一个因素.另外，超极化丙氨酸和丙酮酸在用途上的差异也可能源于它们各自转运蛋白表达的差异。转运体表达对超极化效应的影响13最近的一项研究表明，丙酮酸转运蛋白MCT 1和MCT 4的表达对超极化有限速作用。13体内丙酮酸通量对乳酸的影响74。在此背景下，需要注意的是，mct 1和mct 4在低级别胶质瘤中的表达被沉默，这可能是idhmut介导的启动子甲基化的结果。70,75。相反，我们的结果表明，TERT的表达和ALT途径与丙氨酸转运蛋白ASCT 2和LAT 2的高表达以及在患者源性lgog和lga模型及患者活检中的高丙氨酸进口有关，这与先前的研究一致，表明asct 2和lat 2在低级别胶质瘤中高表达。57,58,59。这些结果有助于突出超极化的潜在用途[1-13丙氨酸用于LGOG和LGAs的代谢显像。

据我们所知，这是第一次证明使用超极化[1-13丙氨酸用于体内肿瘤显像。超极化13丙氨酸已被用来探测大鼠体内和肝脏中的NADH。42,43，但不是癌症。在平移势方面，超极化[1--]13丙氨酸是中性的，BBB是可渗透的。57,76，具有足够长的T1(~44s)在临床相关场强，并且在我们的研究中使用的剂量是无毒的。重要的是，如上所述，丙氨酸转运蛋白ASCT 2和LAT 2在lgogs和lgas中高表达。57,58,59。超极化的另一个优点[1-13丙氨酸是测定两种代谢产物，即丙酮酸和乳酸的能力。42,43。我们的超极化研究[1--]13C]-丙氨酸在TERT-神经球中的表达沉默表明TERT的表达抑制了超极化乳酸的产生，并导致超极化丙酮酸的积累。相反，TERT在ALT+模型中的表达导致超极化丙氨酸产生乳酸的增加，并导致超极化丙酮酸的相应下降。因此，能够想象丙氨酸代谢到两种产品，即丙酮酸或乳酸，可以被认为是一种优势。

由于TMMs的重要作用，它是治疗的靶点。2,6,9,14。我们的结果表明，沉默的TMM使其恢复正常。1H-MRS-可探测生物标记物和超极化物[1-13丙氨酸代谢。重要的是，这种正常化最早发生在72小时，而不伴随着对细胞增殖的影响。这些结果与先前的研究一致，表明在端粒丢失导致细胞死亡之前，TERT或ALT抑制后存在一个滞后期。11,77。因此，我们的代谢生物标记物有可能提供对TMM抑制剂的早期反应，从而帮助他们的临床翻译。我们的研究也表明1H-MRS和超极化13丙氨酸有可能监测对TMM抑制剂的抗药性的发展。以前的研究表明，TERT抑制可能通过ALT途径导致其他癌症的耐药。78,79虽然对胶质瘤缺乏研究。同样，谷丙转氨酶途径的抑制可能通过激活TERT的表达而导致抗药性的发展。63。在此背景下，我们进行了等基因患者衍生模型(MG 119和BT 142)的研究，这些模型被设计成ALT+或TERT+。虽然我们使用多种方法证实了这些模型的TERT+或ALT+表型(TERTTERT状态的mRNA和端粒酶活性以及c-环形成、T-SCE和atrx在ALT状态下的表达的验证，我们不能完全排除TERT和ALT表型共存的可能性，这在以前的研究中已经有报道。48,49,50。然而，我们的结果表明，ALT+神经球可以与TERT+神经球进行鉴别。1H-MRS-可检测到的代谢物水平和超极化[1-13丙氨酸代谢。

目前胶质瘤成像中的一个挑战是解剖MRI无法区分“真实”肿瘤与胶质增生、水肿和坏死的形态相似的区域。25。另一个主要挑战是假性进展，它被定义为通过解剖MRI模拟肿瘤复发的治疗相关效应的发生。24,26。相反，用抗血管生成药物(如贝空素)治疗会产生假性反应，这是因为在肿瘤进展有效的情况下，由于肿瘤通透性降低，造影剂的增强作用明显减弱。24,26。不正确评估的结果是不必要的/延迟治疗，发病率和生存率缩短。在这方面，我们的研究表明1H-MRS生物标记物的TERT表达、NAMPT活性、ASCT 2和LAT 2的表达在LGOG组织中相对于胶质细胞增生较高。1ALT通路的H-MRS生物标记物、GLS活性、ASCT 2和LAT 2在LGA组织中的表达较高。这些结果突出了评估TMM状态在鉴别肿瘤和形态相似的病变如胶质细胞病变方面的潜力。需要进一步的研究，以充分评估成像TMM状态报告假性进展和假反应的能力。

我们的结果1H和超极化13C-MRS-LGOGS和LGAs中TERT表达和ALT通路的代谢生物标志物。我们对NHAS的研究被设计成表达TERT或在没有IDHmut的情况下缺乏ATRX。1在IDHmut表达的低级别胶质瘤中，可以检测到H-MRS生物标记物.然而，我们的方法具有广泛的适用性，因为它显示了成像TMMS的可行性，这是肿瘤增殖的普遍要求。在这方面，重要的是要注意TERT的表达是大多数癌症类型，包括肝细胞癌、转移性黑色素瘤和高级别原发性胶质母细胞瘤的增殖所必需的。2,3,4,5。相比之下，儿童高级别胶质瘤和胰腺神经内分泌肿瘤使用ALT途径作为tmm。4,8,9。我们需要进一步的研究来检查我们的代谢成像方法和生物标志物在这些肿瘤类型中的效用。

总之，我们已经确定并机械地验证了1H和超极化13在胶质瘤细胞模型、原位肿瘤移植和患者活检中可以检测到的TMM状态的可检测的影像学生物标记物。我们的代谢成像生物标记物能够无创、纵向地检测肿瘤增殖的分子特征，并有可能影响低级别胶质瘤和潜在的其他癌症患者的诊断、分层和治疗反应监测。