肿瘤细胞间相互作用促进前列腺癌生长和降低放射敏感性

肿瘤内异质性(ITH)是前列腺癌放疗后局部复发的原因之一。最近的研究还表明，异质肿瘤细胞群体之间的生态相互作用会导致化疗中的耐药性。在这里，我们评估了不同人群之间的相互作用是否会影响前列腺癌的生长和放疗反应。利用两株前列腺癌细胞系亲本和耐辐射群体的三维混合培养和捕食-食饵数学模型，研究了不同类型的生态相互作用，表明不同种群间的交互作用促进了整体生长，降低了辐射敏感性。相互作用的类型影响辐射后的再生时间，在种群水平上，改变每个种群的生存和细胞周期，而不消除这两个群体。这些相互作用可以产生于氧气约束和改变肿瘤微环境的细胞相声。这些发现表明，生态类型的相互作用在辐射反应中是重要的，并且可以成为减少局部复发的靶点。

局部复发仍然是前列腺癌外照射治疗中的一个难题。1。肿瘤内异质性(ITH)是可能导致复发的因素之一。这种异质性在一定程度上源于遗传变异：原发病变包含多个遗传和克隆上不同的病灶，这些病灶通常在复发和转移的前列腺肿瘤中保持。2,3,4,5。表型变异，如新陈代谢的变化，也会影响前列腺癌克隆的治疗反应。1,6,7,8,9。考虑到这种基因型和表型的多样性，一种以群体为基础的放疗靶向治疗ITH的方法可能有助于减少局部复发。

最近针对ITH的一项策略是将肿瘤建模和治疗为复杂的生态系统，在这种生态系统中，治疗敏感和耐药的细胞种群相互作用。10,11。类似于其他生态系统中物种间的相互作用12，肿瘤细胞群体之间的竞争、对抗(即掠食者)或互惠(即合作)取决于微环境压力或细胞群体之间的通信。11。这些相互作用可能改变每个肿瘤细胞群体的生存，从而改变整个肿瘤对治疗的反应。13,14,15,16,17。通过绘制敏感和耐药人群在不同治疗方案下的相互作用和存活情况，可以确定减少局部复发的替代治疗方案。15,18.

虽然在化疗方面已经进行了大量的研究，但是对于生态相互作用是否会导致前列腺癌复发和放射治疗，人们知之甚少。传统的放疗结果模拟方法在两种重要的方法上忽略了ITH。首先，用于预测肿瘤控制概率的线性二次模型包含辐射敏感性参数(即，α和β，分别为线性和二次相的细胞杀伤常数)19。然而，对肿瘤对放射治疗的反应的模拟显示，调节辐射剂量以考虑不同辐射敏感性的人群可以减少硅的复发。20。其次，细胞杀伤事件被建模为泊松过程，随后的事件相互独立地发生。19,21。虽然在肿瘤中发现的生态型相互作用表明，细胞杀伤事件可能不是独立发生的，但缺乏证明这些相互作用对辐射反应的影响的模拟和实验证据。

具有不同放射敏感性的肿瘤群体之间生态类型相互作用的特征可能导致在放射治疗计划阶段解释ITH的新方法。在这里，我们评估这种相互作用是否发生在不同辐射敏感性的肿瘤细胞群体之间，以及这些相互作用是否影响肿瘤的生长动力学和辐射反应。因为前列腺肿瘤通过多种遗传机制产生抗药性，并且通常含有多个克隆。22我们利用来自两个前列腺细胞系的多克隆肿瘤群体来更好地模拟放射性复发的临床情景。鉴于生态相互作用的复杂性，我们发展了一种跨学科方法：(1)量化肿瘤生长(辐射前后)因肿瘤细胞群体之间的生态相互作用而引起的变化；(2)确定相互作用的类型(例如竞争还是合作)；(3)确定微环境压力和/或细胞-细胞通讯是否介导了这些相互作用。我们的结果表明，不同类型的生态相互作用促进了未经治疗的肿瘤在辐射前后的生长，这些相互作用可能在一定程度上是由微环境压力和细胞相声引起的。

具有不同辐射敏感性的多克隆肿瘤种群的特征

以PC3和DU 145两种前列腺细胞株的亲本(即敏感)和耐辐射群体为材料，研究了生态型相互作用对辐射反应的影响。这两个细胞系的多克隆辐射抗性群体先前的特征是：增加了克隆性存活，增加了侵袭潜能，降低了G。2M通过不同的遗传机制在辐射后停止。23,24。在这里，在验证未标记的抗辐射人群在形态上是不同的(补充图)。1A)并具有较高的2D克隆形成存活率(附图)。1B)在本研究中，我们用荧光蛋白标记细胞群体，以跟踪每个群体在不同条件下的动态，并检查是否保持表型差异。在这两个荧光标记的细胞系中，2Gy(PC3)后，耐辐射群体的2D克隆性存活率提高了40%(≥)。P=0.003；DU 145，P < 0.001) than that of the parental population (Fig. 1A)。经2Gy(PC3)照射后，≥的增殖率也提高了27%。P[医]=0.026，第3天；DU 145，P[医]=0.003，第3天)和6 Gy辐射后(第3天，P[医]=0.005，第9天；DU 145，P[医]=0.022，第2天；图1。1B)。耐辐射人群对dna损伤剂顺铂(pc3，亲本IC)引起的死亡也有更强的抵抗力。50=6.5[95%CI：4.9-7.9]，抗辐射IC50=13.0[95%CI：10.9-15.1]，P < 0.0001; DU145, parental IC50=1.8[95%CI：1.6-2.0]，抗辐射IC50=6.6[95%CI：5.9-7.3]P < 0.0001; Fig. 1C)。总之，这些数据证实，多克隆，标记的辐射抗性群体具有本质上较低的辐射敏感性比他们的亲本同行，使他们适合代表复发的疾病在我们的研究。因此，“抗辐射”一词被用来描述比亲本低辐射敏感性的细胞群体。

在没有辐射的情况下，肿瘤种群的混合培养促进了生长，改变了生存。

为了评估混合培养是否改变了生长特性，我们测量了未经辐照的三维肿瘤球体的生长情况，该球体由亲本和耐辐射群体的同质培养或混合培养(种子1：1)组成。这个体外模型之所以被选择，是因为它模拟了实体瘤的重要特征。25例如低氧，使肿瘤对辐射的抵抗力提高2-3倍。与均质亲本球体相比，PC3和DU 145球体的体积增加了30%以上。P[医] < 0.001, day 10) and by >22% (P[医] < 0.001, day 15, Fig. 2A)分别。由于生长的变化可能是由于抗辐射种群的数量超过亲本种群，我们用流式细胞术定量了混合球体中分离出的每个种群的比例(附图)。2)。生长第15天，从混合的PC3球体中分离出的耐辐射细胞占细胞总数的60.9±9.6%，而从混合的DU 145球体中分离出的细胞占细胞总数的22.7±12.2%(见图)。2B).

对每个群体生存情况的分析表明，在这两个细胞株中起着不同的作用。在混合的PC3球体中，≥可使细胞死亡降低14%(亲本)，P[医]=0.038；RRP[医]=0.045)在第15天，这两个种群(图1)。2C)。然而，在混合DU 145球体中，第5天耐辐射人群的细胞死亡增加了26%。P[医]=0.01，图1。2C)，这可能会给父母群体带来早期生存优势。因此，尽管这两种细胞株之间的种群动态差异很大，但这些结果表明，在未辐照的肿瘤和混合群体中，肿瘤的总体生长和亲本群体的生存尤其会增强。

未经辐照的混合肿瘤的生长增加是由生态型相互作用引起的。

我们用数学模型来确定混合球体的生长是否是由于增殖能力的变化或两个种群间细胞间的相互作用所致。通过拟合Logistic增长模型，计算各种群的基线特征。26用均匀球体的数据估计生长速率r，承载能力K，以及初始体积V0(无花果)3A)。在pc_3球体中，抗辐射种群的值较高。r和K在DU 145球体中，它比亲本种群低。r更高K价值V0细胞株间无差异(表)1)。在随后的硅实验中，将生长速率和承载能力固定在这些值上。

为了描述混合球体种群之间的生长动态和生态相互作用类型，我们将Lotka-Volterra(或捕食者-食饵)模型与混合球体的数据进行拟合(图1)。3A)。在这个模型中，相互作用参数，λP和λRR，描述亲代细胞对抗辐射细胞的影响，反之亦然；相互作用可能是竞争性的(λP>0和λRR>0)，互惠(λP < 0 and λRR < 0) or antagonistic (λP < 0 < λRR或λRR < 0 < λP)11。为了证实我们有能力可靠地推断实验数据中的相互作用参数，我们在硅研究中使用Lotka-Volterra模型生成了具有已知相互作用参数的混合球体的合成生长曲线。λP=0.5和λRR=0.5)和三个水平的实验噪声(5，10和20%)。仅将总体积测量结果拟合到Lotka-Volterra模型估计的相互作用参数会产生很大的不确定性，而用体积测量与混合种群比率的测量相补充的相互作用参数则降低了参数估计中的不确定性(补充图)。3)。因此，使用体积测量和细胞比例从我们的实验数据(图)。2A，B)，我们预测了PC3球体中的竞争相互作用(λP>0和λRR>0)和DU 145球体中的拮抗相互作用(λP>0>λRR；图1.3B).

实验数据支持了这一数学预测，通过从均匀球体中分离出的每个群体的细胞周期持续时间的变化来衡量，与从混合球体中分离出来的群体相比(补充图)。4)。在混合的PC3球体中，摄取核苷类似物5-乙炔-2脱氧尿苷(Edu)。+)在第5天的亲本和耐辐射人群中，减少了25%(父母，P[医]=0.019；RRP[医]=0.007；图1。1A)；亲代细胞仍然减少了EDU+第10天摄取(P[医] < 0.001; Fig. 3C)。虽然在增长过程中的这种竞争导致每个人口的增殖减少，但也导致每个种群的死亡减少(图一)。2C)，从而提高总体可行性。相比之下，在DU 145混合球体中，亲本种群增加了50%。+第10天摄取(P[医]，而抵抗辐射的人口减少了80%。+第15天摄取(P[医] < 0.001; Fig. 3C)。因此，DU 145球体中的种群表现为相反的行为：亲本获得生长优势，而抗辐射能力受到不利影响。虽然不同细胞株之间的相互作用机制(即竞争性和拮抗性相互作用)不同，但这些结果支持了在没有辐射的情况下，异质肿瘤种群之间的生态型相互作用促进肿瘤生长的前提。

肿瘤细胞的混合培养降低了辐射敏感性。

为了确定混合培养是否改变了放疗的反应，我们随后在一定剂量范围内照射均匀和混合的PC3球体，并测量到终点的生长时间，用辐射诱导的生长延迟来评估。在每一剂量辐射下，四个球体组(亲本、亲本：RR、亲本：RR、RR：RR)的生长延迟曲线(整体尺度)差异显著。我们随后测试了10%抗辐射细胞是否能减少生长延迟。与含100%亲本细胞的PC3球体相比，混合球体(种子9：1亲本：RR)在7.5Gy照射后生长延迟明显缩短(P<0.01)。P[医]=0.005；图1。4A)和10 Gy(P[医]=0.02；图1。4A)。在单独的实验中，仅用6Gy的辐射，在混合的PC3球体(种子1：1)中，辐射后的生长延迟减小；P[医] < 0.001; Fig. 4B)，虽然在第10天和第15天，抗辐射细胞很可能促进再生，因为它们分别占混合球体细胞的61±5.6%和79±5.6%(图1)。4C)。与同质球体分离的亲本细胞相比，第10天和第15天从混合球体中分离出的细胞死亡率>22%。P[医]=0.045；图1。4D)。然而，埃杜+摄取量下降46%，G细胞比例下降2M/EDU−增加(P[医] < 0.001; Supplementary Fig. 5)，暗示在这些细胞周期阶段被阻滞。

混合DU 145球体也得到了类似的结果。在6和10 Gy照射后，混合球体的生长延迟比亲本球体(6Gy)减小。P[医]=0.001；10 Gy，P[医] < 0.001; Fig. 4E)。6Gy的再生并不是由于抗辐射种群占优势，因为亲本群体占混合球体的60%以上(图1)。4F)。此外，与同质球体中的亲本群体相比，混合球体中的亲本种群在第10天的细胞死亡率下降了40%。P[医]=0.045；图1。4G)但是细胞周期阻滞(如19%的EDU减少所证明的那样)+摄取和G的增加2M/EDU−阶段(P[医]=0.045；附图。5)。相反，与同质球体的耐辐射群体相比，混合球体的细胞死亡率在第15天增加了37%。P[医]=0.038；图1。4G)，但EDU没有显著变化。+摄取或G2M/EDU−比例(附图)5)。这些数据表明，抗辐射种群不仅减少了辐照后的生长延迟，而且提高了辐照混合球体中亲本种群的存活率。

生态相互作用的类型决定了辐射后的再生时间。

然后，我们研究了生态相互作用的类型是否会影响放射治疗后的再生时间。利用Lotka-Volterra模型，我们模拟了混合球体(硅种子1：1)在6Gy照射下的再生过程，得到了一定范围的相互作用参数。λP和λRR。如预期的那样，竞争性细胞群体(λP < 0 and λRR < 0) have the slowest regrowth times (50–200 days), while those with mutualistic interactions (λP>0和λRR>0)有最快的再生次数(14-32天)。5A-D)。有趣的是，在特定的交互类型中，价值相互作用参数λP和λRR影响了再生时间。例如，对于竞争性的交互作用，λP和λRR在0.5至0.75天之间−1毫米级−1在100至200天内产生再生(尖峰)，而在0到0.5天之间−1毫米级−1在大约50天内产生再生(如图所示)。5B)。此外，对于对抗的交互作用，当λP < 0 < λRR再生比当λP>0>λRR几乎是2倍(如图所示)。5A，D)。这些结果表明，生态相互作用的类型影响放疗后的再生时间，并可能导致放疗后肿瘤反应的变异性。

氧约束和细胞通讯介导了PC3球体的增强生长和辐射敏感性的降低。

在发现生态相互作用促进混合肿瘤种群的生长和降低辐射敏感性后，我们随后试图确定微环境压力和/或细胞-细胞通讯是否可以介导观察到的表型。我们首先关注的是混合的PC3球体，尽管它们之间有竞争的相互作用，但它显示了更高的存活率和降低的辐射敏感性。因为微环境压力，例如空间限制，会影响化疗中细胞间的相互作用。13我们用显微镜观察了各种群在均匀球体和混合球体中的空间分布。与第5天分离的不同，在第11天分离的混合PC3球体切片显示，亲本细胞主要位于中心，这一区域与缺氧染色重叠，但不用于增殖。由混合细胞和抗辐射细胞组成的球状体在视觉上不太致密(图中所示)。6A)比由亲本细胞组成的细胞。双亲细胞在混合球体中的定位，在70%的球体中检测到(附图)。6)，同时也伴随着辐射敏感性的降低。从未处理的混合球体中分离出的亲本群体在第11天的克隆成活率比未处理的混合球体高25%。P[医]=0.04，而从同质球体中分离出的亲本，在第5天分离的种群中未见此效应(图5)。6B).

根据这些结果，我们推测空间结构可能是由于氧气的竞争或两个细胞群体间耗氧率的差异所致。为了检验这一假设，我们建立了一个细胞自动机(CA)模型，描述了二维横截面的大小和结构通过三维肿瘤球体发生的变化，其中来自亲代和耐辐射群体的细胞因局部氧气浓度而分裂和死亡。我们的流式细胞仪数据得出了细胞增殖的参数值；对辐射抗性的OCR值比对亲本细胞的OCR值低17%。P=0.001，图1。6C)。该模型是根据V的估计值，在第0天播种相同数量的亲本细胞和抗辐射细胞来初始化的。P(0)和VRR(0)Logistic模型。在我们模拟的第10天，抗辐射细胞位于靠近球体边缘的地方，而亲本细胞则位于靠近中心的地方(如图所示)。6d)。然后用CA模型确定混合球体的生长曲线是否可以用氧的竞争来解释。虽然CA模型预测了均匀球体的生长曲线，但在两个细胞群竞争氧气的假设下，该模型没有准确地捕捉混合球体的生长曲线。6E)。因此，虽然对氧的竞争可以解释细胞群体的空间结构和混合球体辐射敏感性的降低，但仅靠OCR差异并不足以解释它们的生长表型。

我们随后在缺氧中寻找亲代细胞与抗辐射细胞之间的细胞通讯的证据，因为缺氧似乎是提高存活率的一个重要因素。细胞用Transwell插入物在缺氧中共培养120 h，在此系统中，细胞可以共享因子(如外小体、微RNA和蛋白质)，但不能直接接触。与耐辐射细胞共培养的亲本细胞数比低氧同质培养的细胞数高出48%，而常氧培养组则无明显差异(P>0.05)。P[医] < 0.001; Fig. 6f)。总之，我们的结果表明，微环境压力(通过氧约束)和细胞-细胞通讯(通过因子的转移)介导了细胞种群之间的生态相互作用，从而导致混合PC3球体的生长增强和辐射敏感性降低。

我们评估了不同辐射敏感性的肿瘤细胞群体之间的生态相互作用是否会影响肿瘤的生长动力学和辐射反应。通过生物实验和生态学数学模型，我们发现由混合肿瘤细胞组成的前列腺癌球体增强了生长，降低了辐射敏感性。数值模拟预测，这些表型变化是球体中细胞种群间竞争和拮抗相互作用的结果，并且在辐射后会发生可变的再生次数。通过证明生态类型的相互作用影响生长和辐射反应，我们的研究提出了一个新的方面，可以考虑在放射生物学模型，以针对ITH和减少前列腺癌局部复发。

无论相互作用类型如何，肿瘤细胞群体之间的生态相互作用似乎对癌症具有进化优势。我们发现竞争性和拮抗性的相互作用都能促进肿瘤的生长和对辐射的抵抗力。我们的结果与以前的研究结果是一致的，之前的研究调查了生态相互作用在化疗中的影响：尽管类型在相互作用(例如竞争和互惠)中，生态相互作用似乎增加了对癌症治疗的抵抗力。14,17,27,28,29。此外，在我们的研究中，相互作用增加了生长和辐射后生存的亲本群体在混合球体在这两个细胞系。这种相互作用也没有导致这两种人群的消失，从而重现了在人类前列腺癌中观察到的多克隆性。3,4,22,30,31。因此，如果肿瘤细胞群体之间的相互作用在维持ITH的同时降低肿瘤对辐射的总体敏感性，目前用于针对更多“耐药”人群的放射治疗方法，例如剂量增加，可能不足以针对ITH。未来的研究可以测试在放射生物学模型中解释这些相互作用是否能改善肿瘤对辐射的反应。

我们还发现，氧约束介导的相互作用改变了混合PC3球体中前列腺细胞群体的空间分布。我们的生物学和空间显式数学模型都显示了周围的抗辐射细胞和低氧区的亲代细胞。这些发现与以前的报告一致，表明耐药癌细胞的代谢需求会影响其空间定位。7。在我们的研究中所观察到的空间异质性是很重要的，因为位于周围的抗辐射细胞可能会转移。16，而低氧的亲代细胞则会降低对辐射的敏感性。由于放疗的疗效也可能取决于肿瘤种群的空间分布，这些结果表明，可能需要空间显式的数学模型来进一步优化放射治疗。例如，以前列腺癌抗原的空间表达为基础的非均匀剂量的辐射，已被证明可以提高前列腺癌的肿瘤控制概率。32.

由于研究生态相互作用的实验方法可能是复杂的、耗时的和/或数据有限的，因此处理肿瘤作为进化生态系统的跨学科方法可能是针对ITH的必要方法。10减少前列腺癌局部复发。数学模拟，从实验中输入数据，可以帮助评估不同治疗策略的结果和测试生物假设。这一方法的成功最近在一项针对耐药前列腺癌患者的试点临床试验中得到了证明：每个患者的肿瘤种群动态被用于告知Lotka-volterra模型，并优化一个比标准护理方案更能延迟复发的化疗方案。18。在本研究中，我们使用数学模型指导流式细胞术实验的实验设计，并检验氧约束是否能预测混合球体的生长。相反，我们利用实验数据在理论模型中用更紧的置信区间推断参数，从而提高了我们的数学模型预测生态相互作用的能力。我们的方法可用于评估放疗期间和放疗后对其他癌症类型和系统的影响。

虽然比较简单，但我们的建模方法与以前的方法相比有三个优点。首先，与其他用于研究细胞间相互作用的生态模型不同，这些模型只模拟敏感种群和抗性种群之间的竞争。15,18,33,34，我们的Lotka-Volterra模型描述了一系列相互作用，包括竞争、互惠和对抗.第二，虽然该模型没有考虑不同的细胞状态(例如缺氧、增殖和坏死)，也没有考虑细胞与细胞之间相互作用的性质随时间的变化，但它准确地预测了球体内的优势相互作用。第三，通过实验数据，可以方便地对数学模型中的少量参数进行估计和验证。一个限制是，我们的Lotka-Volterra模型没有考虑到细胞间相互作用随时间的变化，这可能是由于肿瘤微环境的变化而发生的。由于肿瘤种群可以随着时间的推移而进化，因此需要今后的研究来研究变化中的相互作用(尤其是治疗后的相互作用)是否会影响再生。虽然我们的空间分辨混合CA模型足以研究微环境(即氧约束)对肿瘤球体二维横截面的影响，但目前形式的模型也不考虑细胞群体之间的直接相互作用。为了做出更现实的预测，该模型可以扩展到三维空间，以及控制细胞行为的规则，这些规则被修改以考虑不同细胞群体之间的相互作用。由于细胞可以通过分泌分子直接或间接地相互作用，我们的模型可以进一步修改，以明确跟踪共存细胞群体释放的因子。这些修改增加了模型的复杂性，使我们能够检验与ITH对肿瘤生长和动力学的影响有关的各种假设。最后，虽然这两种模型都不能解释在体内会发生的血管生成，但这两种模型都可以通过开发现有的血管肿瘤生长模型来解释血管在放疗后肿瘤反应中的作用。35.