肿瘤与细胞系转录谱的比对 为了说明直接比较细胞株和肿瘤表达谱所涉及的分析挑战，我们首先结合几个大型的RNA-Seq基因表达数据集进行了联合降维分析。具体来说，我们分析了1249个CCLE细胞系的转录数据。 1 ，9,806例TCGA肿瘤标本，784例来自靶标的小儿肿瘤标本，1,646例来自Treehouse的儿童肿瘤样本 33 。虽然一个一致的计算管道被用来处理所有的数据集，这一分析揭示了一个明确的分离细胞株和肿瘤样本(图1)。 1A )，如预期。这种分离不是通过应用简单的规范化或批处理校正方法(如战斗)来解决的。 32 ,34 (补充图。 1 )。这种细胞株和肿瘤样本的全球分离排除了对不同类型样本的相似性进行更详细的评估。
图1：Cellierer对齐方法概述。 a 联合、未校正的细胞株和肿瘤表达数据的UMAP二维投影( n =1 249个细胞系， n =12236个肿瘤。 b 方法：以细胞株和肿瘤基因表达数据为输入，用对比主成分分析法(CPCA)对肿瘤细胞进行多聚类内方差分析。然后Cellier识别并对相似的肿瘤细胞系对进行比对，得到校正后的基因表达数据，利用相互最近邻(MNN)批量校正，从而改进肿瘤与细胞系的比较。 c 按等级排序的CPC特征值( n =19,188个特征值)。 d 肿瘤标本投射到cPC 2上的Pearson相关性及其估计纯度(用一致测量肿瘤纯度的方法) 28 n =7,832个肿瘤。 e CPC 1基因集富集分析(GSEA)的前五条途径。P值是基于基因置换试验，并采用本雅明-霍奇贝格程序(方法，“基因集富集分析”)进行调整。
这一问题的几个特点使得细胞株和肿瘤表达谱的排列具有挑战性。首先，肿瘤的纯度在不同的肿瘤样本中是高度不同的。 27 ,28 ，而污染正常细胞的转录效应并不是通过肿瘤样本和类型共享的单一特征来捕捉的。 35 。其次，数据集在疾病(亚)类型组成上的差异会极大地扰乱在全球范围内调整肿瘤分布和细胞表达谱的尝试。最后，即使没有正常细胞污染的干扰作用，体内和体外条件的差异以及技术伪影也可能导致癌细胞基因表达谱的系统性差异。 36
为了应对这些挑战，我们开发了一个多步比对程序(图)。 1B ；方法)。首先，为了识别肿瘤样本中正常细胞污染复发模式的基因表达特征，我们使用了对比主成分分析(CPCA)，这是PCA的一个推广，它揭示了相对于另一个数据集丰富的相关变异模式。 37 。重要的是，为了避免由于两个数据集之间的差异疾病组合而造成的偏差，我们首先对每个数据集进行了无监督的聚类(补充图)。 1 ；方法；补充数据 1 )，用CPCA对比细胞株与肿瘤数据的簇内协方差结构。这一分析确定了几个基因表达特征，与细胞株相比，肿瘤样本之间的差异非常大(如图所示)。 1C )。基因集富集分析(GSEA) 38 这些肿瘤特异性特征显示了免疫途径的明显富集(图一)。 1E ；补充图。 2 )，提示CPCA可以识别不同的免疫细胞群。此外，第二种肿瘤特异性CPC的表达呈显著相关( R =−0.77， p -数值<2.2e-16， n =7,832个肿瘤)-根据对肿瘤纯度的一致测量，对肿瘤纯度的独立估计 28 说明这种分析能够识别污染细胞的多个独立特征(图1)。 1D )。作为对齐的第一阶段，我们从这两个数据集(方法)中删除了前四个肿瘤特异性特征。
虽然CPCA去除了系统肿瘤/细胞株差异的主要来源，但其本身并不能完全对齐数据集(补充图)。 3 )因为它没有考虑到特定疾病(亚)类型的肿瘤和细胞系之间的一致差异。作为对齐的第二阶段，我们使用了一种基于相互最近邻(MNN)的批处理效应校正算法来消除数据集之间的系统差异。为了消除单细胞RNA-Seq数据中的批处理效应，提出了一种MNN批量校正方法.它通过识别数据集之间的样本对，其中每个样本包含在另一个数据集中彼此的最近邻集合中，并利用这些MNN对来学习数据集的灵活而健壮的非线性对齐。关键的是，mnn对数据集之间的子类型组合的差异具有很强的鲁棒性，假设数据集仅包含相应样本的子集。 39
MNN在肿瘤和细胞系表达谱中的应用确定了一组校正载体(匹配肿瘤/细胞系对之间表达谱的差异)，与MNN匹配的细胞系相比，平均显示免疫相关基因的表达增加，细胞周期基因的表达减少(补充图)。 3 )。虽然这些肿瘤/细胞株的差异在样本间基本一致，但校正载体也显示出不同疾病类型的模式(补充图)。 3 )，强调了使用MNN等灵活的非线性校正方法来消除这种系统差异的重要性。值得注意的是，尽管MNN本身提供了大致相似的数据对齐，但在MNN之前应用CPCA增加了所识别的MNN对的数量，并有助于减少对MNN对中高纯度肿瘤样本匹配细胞系的偏见(补充图1)。 3 ).
我们应用这种两阶段比对方法(我们称为Cellierer)来生成一个完整的细胞株和肿瘤基因表达谱数据集，这些数据集已经被纠正为系统数据集特定差异的多个来源。实际上，创建一个二维均匀流形近似和投影(UMAP) 40 与Cellier对齐数据集绘制的图表显示了一张肿瘤转录图谱，其中细胞株和肿瘤样本很大程度上混杂在一起，但仍保留着不同已知肿瘤类型之间的明显差异(图一)。 2 ).
图2：肿瘤和细胞系标本的Cellier排列。 细胞定向肿瘤UMAP 2D投影和细胞表达数据被注释的癌症谱系着色。排列包括12236个肿瘤样本和1249个细胞系，涉及37个癌症类型。
对齐保留有意义的子类型关系。 为了评估Cellierer，我们首先测试了它是否产生了肿瘤和细胞系数据中已知的疾病类型和亚型的排列。如图所示。 2 该技术去除了肿瘤与细胞株表达谱之间的许多系统差异，形成了完整的肿瘤表达空间图谱，清晰地由细胞株和肿瘤样本组成。尽管Cellierer完全不受监督(即不依赖任何样本注释，如疾病类型)，但排列的肿瘤和细胞系的表达谱很大程度上是按疾病类型聚在一起的。我们根据肿瘤样本中最接近的肿瘤类型，对每个细胞株的最相似的肿瘤类型进行分类，从而对其进行量化。我们发现，对于这两组数据中发现的疾病类型，这些推断出的肿瘤类型在57%的时间内与注释的细胞系疾病类型相匹配(图1)。 3A 方法)，在未校正数据中，推断出的肿瘤类型在49%的时间内符合注释细胞株疾病类型(补充图)。 4 )。Cellier校正也增加了肿瘤和同一类型细胞的表达谱的相似性(图)。 3B ；补充图。 4 ).
图3：按肿瘤类型分类的细胞系。 a 细胞株比例( n =1,150)，用Cellier对齐数据分类为每一种肿瘤类型。 b 细胞间相关性的分布( n =1 135)和肿瘤( n =11,413)相同(子)类型后，凯勒-对齐。
Cellierer的一个主要优点是，它并不认为数据集中的所有细胞系样本都一定与任何肿瘤样本相似，反之亦然。因此，我们可以利用Cellier排列的表达数据来确定哪些肿瘤类型在细胞株和原发肿瘤之间有很好的一致性，哪些不一致。虽然有很高比例的细胞株与同一类型的肿瘤聚集在一起，但并不是所有的细胞系都与肿瘤样本很好地一致。例如，虽然许多软组织、皮肤癌和乳腺癌细胞株与相应的肿瘤样本相似，但我们发现中枢神经系统(CNS)和甲状腺细胞株与肿瘤样本的排列不一致(图一)。 3A，b )。这一观察与文献中先前的报道一致，即体外培养基条件可以改变CNS细胞株的表型，并引起原瘤中不存在的基因组变化。 41 ,42
然而，这些分析表明，总的来说，Cellierer倾向于将同一疾病类型的细胞株和肿瘤分组。接下来，我们试图确定对齐数据是否也揭示了更细粒度的子类型之间有意义的关系。为此，我们为细胞系和肿瘤数据集聚合了现有的亚型注释(补充数据)。 1 )1 ,10 ,43 ,44 ,45 ，并发现Cellierer也倾向于排列同一亚型的肿瘤和细胞系样本(图1)。 4A )。例如，乳腺癌肿瘤和细胞株按亚型聚集在一起(如图所示)。 4B )。类似地，白血病样本形成了与急性髓系白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)现有注释相对应的簇，大多数白血病细胞系与同一亚型肿瘤相一致(图1)。 4C，d ).
图4：亚型对齐。 a UMAP 2D投影的Cellierer-对齐与乳房，肾脏，造血和皮肤样本突出显示红色。 b 在细胞株和肿瘤中，管腔型和基底性乳腺癌亚型聚集在一起( n =56个细胞系， n =1,099个肿瘤。 c 按亚型排列的数据中的白血病肿瘤和细胞系共聚( n =197细胞系， n =1 218个肿瘤。 d 骨髓瘤细胞集落在造血样本附近，但与肿瘤不同( n =96个细胞系， n =109例肿瘤。 e 皮肤癌黑色素细胞，暂时性，神经嵴样和未分化亚型排列在细胞株和肿瘤之间( n =63个细胞系， n =459个肿瘤。 f 肾嗜铬细胞瘤标本不与任何细胞系( n =34个细胞系， n =1019个肿瘤。
我们进一步测试了Cellierer是否保持和调整了具有生物学意义的簇内变异。例如，尽管黑色素瘤肿瘤和细胞株主要形成一个单独的簇，但这个簇内的可变性重新描述了最近描述的黑色素瘤分化状态。 43 ，这些黑色素瘤亚型的注释在细胞株和肿瘤之间排列良好(如图所示)。 4E )。有趣的是，黑色素瘤簇中完全由肿瘤样本组成的区域主要包含来自原发--而不是转移--的暂时性亚型肿瘤。这一结果与许多黑色素瘤细胞系被注释为是从转移样本中提取的事实是一致的。 1 。这些结果共同突出了Cellierer揭示细胞株和肿瘤之间转录相似的更详细模式的能力，而不仅仅是匹配的簇。
一个潜在的关注，寻求全球统一肿瘤和细胞系数据的方法是，它们可能掩盖重要的潜在生物学差异。Cellier在这方面的一个关键特征是它允许只存在于一个数据集或另一个数据集中的子种群。例如，这两个数据集都含有肾癌样本，但被标注为嗜铬细胞癌的样本仅存在于肿瘤数据中。因此，在Cellierer对齐后，嗜铬细胞癌肿瘤样本仍然清晰，不包括任何细胞株(图1)。 4F )。类似地，骨髓瘤样本也存在于细胞系数据中，而在TCGA、靶或Treehouse肿瘤数据中则不存在。经Cellier校正后，骨髓瘤细胞系聚集在其他造血组织附近，但未与任何肿瘤标本明确分组(图1)。 4D )。细胞株数据还包括39个细胞株，注释为成纤维细胞，我们期望在转录上区别于肿瘤或细胞系数据中的任何癌症类型。事实上，我们发现这些成纤维细胞系形成了一个明显的簇，几乎没有肿瘤存在(补充图)。 5 )。这些案例表明，Cellixer并没有人为地强迫所有样本与来自其他数据集的样本对齐，从而使其能够揭示数据集中不存在或表示不足的子类型。
Cellierer实现了改进的肿瘤细胞系相似性估计。 我们还评估了Cellierer的结果，并将其与先前两种旨在测量细胞株和肿瘤转录相似性的方法进行了比较。首先是Yu等人的方法。 20 使用批处理效果校正的组合(使用战斗) 32 )和基于回归的肿瘤纯度校正，以计算细胞株与肿瘤之间调整后的相似性度量。我们还将Cellierer与CancerCellNet的结果进行了比较。 46 一种方法，使用机器学习模型训练的肿瘤转录谱，以预测最有可能的肿瘤类型的每一个细胞株。
总之，我们发现细胞株在转录上多少类似于同一注释类型的肿瘤的估计值与Yu等人的方法高度一致。 20 (补充图。 6 )和CancerCellNet 46 (补充图。 7 ；方法)。我们进一步比较了每一种方法的能力，以准确地分类注释的癌细胞类型，根据其与肿瘤轮廓的相似性。为Cellier和Yu等人。 20 方法根据每个细胞系的近邻(使用Pearson相关关系；方法)对这些分类进行分类，而对于CancerCellNet，则基于这些分类。 46 我们对每个细胞株进行了肿瘤类型概率估计。这一比较表明，与Yu等人提出的分类方法相比，基于Cellier的分类要准确得多。 20 (Cellier：50%同意，Yu等人：38%同意； n =666个细胞系， n =7,656个肿瘤)，并与CancerCellNet的估计数作了比较。 46 配对队列(Cellier：49%，CancerCellNet：37%)； n =657个细胞系， n =8,825个肿瘤； 方法 ).
最后，我们利用转录数据对细胞株和肿瘤进行比较，并根据基因组特征进行相似性度量。有大量的潜在的基因组特征和表现形式可以用来进行这样的分析。为了简化比较，我们使用了先前发布的一组1,250个二值化癌症功能事件(CFE)。 15 ,47 ，其中包括拷贝数、甲基化和突变特征，这些特征被认为是肿瘤中反复发生的事件(方法)。我们发现，基于Cellier和CFE的相似性估计在根据肿瘤数据对细胞系的肿瘤类型进行分类时具有相似的准确性(Cellier：60%，CFE：61%)； n =2,448个肿瘤， n =459个细胞系；方法)。然而，哪些细胞株与同一类型的肿瘤最相似的排名有很大的不同(补充图)。 8 )，表明转录和基因组相似性可能独立变化。
细胞株与肿瘤数据集之间的信息传递 通过提供无监督的数据集成程序，Cellierer能够对肿瘤和细胞系数据集进行联合分析，从而提供更大的能力来检测转录上不同的亚群体。尤其是在细胞系数据中，与肿瘤相比，样本少了10倍。事实上，对Cellixer校准数据集的聚类分析显示，与单独应用于细胞系数据集的分析相比，细胞株之间有更多更明显的簇(补充图)。 1 )。这种差异在几乎没有代表性细胞系的癌症类型中最为明显。例如，在目前的数据集中，只有一个睾丸细胞株(SUSA)存在，当单独分析细胞株数据时，该细胞系与软组织癌聚在一起最为紧密(补充图)。 9 )。然而，对Cellier定位数据的联合分析表明，该细胞系与生殖细胞肿瘤的子集聚集在一起(补充图)。 9 )，尤其是与非精原细胞瘤睾丸癌样本的近邻(补充图)。 9 ).
接下来，我们将探讨对肿瘤和细胞系数据的综合分析是否也有助于解决缺失，或者潜在的不正确的(子)类型注释。例如，四个未标注为黑色素瘤样本的细胞系仍与黑色素瘤样本聚在一起(补充图)。 9 )。其中一种叫做COL 699的细胞系被注释为从转移性肺癌样本中提取的。 1 ，增加了目前的注释准确地描述活检部位，而不是原始组织的可能性。文献中已有的报道也证实，该细胞系很可能来源于黑色素瘤样本。 11
我们还可以使用组合数据集执行标注从一个数据集到另一个数据集的标签传输。例如，所有的亚型注释(T细胞和B细胞)都适用于所有细胞系，但仅适用于部分肿瘤标本。所有细胞系形成两个不同的簇，与标记的B细胞和T细胞亚型完全匹配。所有肿瘤也主要聚集在一起所有细胞株，所有附加注释的(B-细胞)肿瘤样本聚集在一起的B细胞株。其余的(未加注释的)肿瘤样本可以很容易地被分类为B细胞或T细胞所有(连同一些推测的AML样本)根据它们的集群成员(图1)。 4C )，与基于B细胞ALL和T细胞全标记基因表达的肿瘤标本的聚类结果一致(补充图)。 9 )48 。这些结果进一步突出了执行不依赖现有注释的无监督全局对齐的优势。
一组在转录和功能上不同的细胞系 联合分析Cellier排列的细胞系和肿瘤数据也揭示了与原发肿瘤不同的细胞株的共同结构。如上文所述(如图所示)。 3 )某些癌症类型的细胞系模型，如甲状腺和中枢神经系统，没有再现其各自癌症类型的原发肿瘤所显示的疾病特异性转录模式。更仔细的检查发现，252个没有与同一疾病类型的肿瘤样本分组的细胞系形成了一个单独的簇(图)。 5A ；方法)。虽然大约20%的细胞系属于这一组，但它包含的肿瘤样本(主要是软组织和骨肿瘤)不到2%(补充数据)。 1 )。该簇中的细胞株具有广泛的不同谱系(尤其是82%的CNS，91%的甲状腺细胞系，41%的肝脏细胞系)。 5B ；补充数据 1 )，而且我们没有根据这些细胞系的临床说明来确定任何不同的特征(补充图)。 10 ).
图5：一组细胞系显示了EMT签名和与整合素相关的依赖性. a 一组252个未分化的细胞系在全球Cellixer-排列中。 b 群集内细胞株的组成( n =252个细胞系)。 c 集群内的皮肤细胞系不表达，也不依赖Sox 10。 d 肝细胞株中HNF4a的表达较低，对HNF4a的依赖性较弱。 e 差异表达分析显示上调的间充质轮廓和 f EMT途径在细胞簇中的富集作用。 P -数值是以基因置换试验为基础，并使用本雅明-霍奇贝格程序(方法，“基因集富集分析”)进行调整。 g 差异药物易损性分析显示，对EGFR抑制剂的敏感性降低，对微管蛋白聚合抑制剂的敏感性提高。 h 差异依赖分析显示，在簇内的细胞株具有更强的与整合素相关的依赖性.
在本研究分析的原发性肿瘤数据中，该簇中的细胞系缺乏谱系特异性表达特征，这表明它们来自未分化肿瘤或已进入更未分化的状态。事实上，在这个由tsoi等人注释的12个皮肤癌样本中，所有3个皮肤细胞株和9个皮肤肿瘤中的7个都被标注为一个未分化的亚型。 43 。大多数甲状腺细胞株(11/12)被观察到比甲状腺肿瘤的分化程度更高。 36 ,49 ,50 ，也属于这个集群。为了进一步评估这些细胞模型与与肿瘤共同聚类的同系细胞模型的区别，我们还观察了一组特定于谱系的转录因子。例如，Sox 10在黑色素瘤细胞中有选择性表达，由crispr基因敲除的sox 10基因在黑色素瘤细胞中具有选择性杀伤作用。 3 。与这一细胞株特异性簇的解释一致，它代表了一种更去分化的状态，在该簇内的皮肤癌细胞系表现出对sox 10的表达和依赖性要弱得多(如图10所示)。 5C )43 。同样，未分化簇内的肝癌细胞株对肝细胞转录因子HNF4a的表达也较低，对HNF4a的依赖程度也较低(如图所示)。 5D ).
为了进一步了解区分这组未分化细胞系的生物学特征，我们进行了基因组范围的差异表达分析，控制可归因于注释谱系的差异。这一分析揭示了上皮间充质转化(EMT)相关基因的显著富集。 5E，f )，反映了这些未分化细胞系间充质表达的较强模式。这个集群中相对较小的一组肿瘤样本( n 主要来源于具有间充质细胞系的肿瘤类型。 51 GSEA显示EMT通路基因表达增加(归一化富集评分=3.33，调整p值=6.2e-05)。然而，值得注意的是，有少数来自集群中其他血统的肿瘤样本(补充数据)。 1 )，包括所有被标注为未分化亚型的黑色素瘤肿瘤(如图所示)。 4E )43
我们还测试了表达这种间充质/未分化表达模式的细胞系是否具有独特的化学和遗传脆弱性。为此，我们使用全基因组crispr基因敲除屏幕的阿基里斯数据集来询问689个细胞系的基因重要性。 52 ，以及最近在578个细胞系中筛选出的临床化合物数据集。 5 。这些分析表明，未分化细胞系对微管蛋白聚合抑制剂的敏感性有所提高。 5G )，以及对整合素基因的更大依赖，特别是ITGAV和ITGB 5。 5H )，与其上调EMT相关基因一致。 53 ,54 。未分化的细胞系也比其他细胞系对几种化合物更有抵抗力，最显著的是许多EGFR抑制剂(图一)。 5G )。这也与未分化细胞系中EGFR依赖性明显降低相一致(图一)。 5H ).
