EB病毒感染诱导鼻咽癌生长抑素受体2表达对预后、影像学及治疗的影响

东南亚流行的鼻咽癌缺乏有效的诊断和治疗策略。即使在高收入国家，第四阶段鼻咽癌的5年生存率也不到40%。我们报告生长抑素受体2(SSTR 2)在包括402个原发性、局部复发和转移性NPC在内的多个临床队列中的高表达。结果表明，EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP 1)通过NF-κB途径诱导SSTR 2表达。利用细胞模型和临床前啮齿动物模型，我们证明了SSTR 2的治疗潜力使用细胞毒性药物结合物PEN-221，发现它优于FDA批准的SSTR 2结合细胞抑制剂。此外，我们还揭示了sstr表达与存活率的显著相关，并报道了sstr 2结合蛋白在体内的摄取情况。68鼻咽癌患者PET-CT扫描中GA-DOTA肽放射共轭物的临床研究(NCT 03670342)。这些发现揭示了EBV相关鼻咽癌SSTR 2在感染、影像学、靶向治疗和生存中的关键作用。

鼻咽癌是一种恶性上皮性肿瘤，呈鳞状分化。1。它最常见于咽隐窝(Rosenmuller窝)，这是一个很难通过手术进入的区域，这是因为在建立开放的手术切除通道时受到解剖学的限制(见图)。1A)。鼻咽癌被世界卫生组织(WHO I-III)分为三种组织学亚型。非角质型鼻咽癌亚型(WHO II-III)与EBV感染密切相关，EBV感染是鼻咽癌的一个已知危险因素.其他易感基因和环境因素导致了鼻咽癌的惊人的地理分布。2。疾病早期的治疗包括放射治疗，更少的是外科手术，这两种治疗都会导致相当大的发病率。3。以白金为基础的全身治疗只适用于中位生存期为12至24个月的复发和转移患者。4.

SSTR是一种G蛋白偶联的细胞表面受体，细胞外配体的激活导致细胞增殖的抑制。在神经内分泌肿瘤(Nets)中，SSTR 2的表达被用68Ga-DOTA-肽放射性结合物及其治疗性研究177鲁-或90Y-DOTA-肽放射偶联物和SSTR 2激动剂，如奥曲肽八肽5,6。在网状网中，SSTR 2受体的激活与增殖减少有关，SSTR 2激动剂是细胞静止的，能有效地控制生长，但仅在增殖率低于10%的肿瘤中。7。5例原发性EBV阳性鼻咽癌的临床研究8显示摄取增加68Ga-dota-toc，两例病例报告同时发表，表明sstr表达在鼻咽癌功能成像中的候选性。9,10。在对12个NPC的研究中，组织样品的SSTR放射自显影证实了这些意外的成像结果。11。SSTR 2激动剂控制鼻咽癌生长的能力尚不清楚。有零星报道暗示SSTR 2与NPC之间的关系，其作为生物标志物的潜力，以及缺乏对SSTR 2在鼻咽癌中表达的分子解释，促使我们对这种受体的作用进行了更广泛的研究。

SSTR 2的表达是鼻咽癌诊断和预后的一个生物标志物，是由EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP 1)通过NF-κB通路诱导的。此外，我们还展示了SSTR 2在成像和靶向治疗中的关键作用。

Sstr 2在大多数鼻咽癌组织中呈EBV连锁表达。

为了验证以往研究的结果，我们对402例鼻咽癌原发、复发和转移癌标本进行了SSTR 2免疫组化染色(详见方法，补充表)。1)来自欧洲和亚洲中心以及一个美国中心。311人中252人(81%；补充表)2原发肿瘤组织中SSTR 2表达，定位于质膜(图1为典型的原发病例)。1A).

如果有关于EBV状况的数据(n=402个样本中的385个，317/385个(82.3%)(补充表)3)患者队列中发现EBV阳性，并表达EBV编码的小RNA(EBERS)(一个典型的例子如图所示)。1A)。有趣的是，EBV阳性鼻咽癌中SSTR 2的表达显著增强(OR=12.7；p < 0.001; Fig. 1B非角化组织学亚型(OR=27.0)；p < 0.001) and significantly associated with other clinicopathological factors (Fig. 1C和补编。表4)。此外，SSTR 2在局部复发和转移性疾病中仍有表达。n共402份标本中，91份)，表达水平在病例间无显着性差异(图1)。1C-E).

EBV通过LMP 1和SSTR 2诱导SSTR 2表达NF-ĸB信号

进一步探讨EBV感染与SSTR 2表达的关系。体外培养的正常呼吸上皮原代细胞经EBV感染后，SSTR 2的表达明显上调(图1)。2A，b和补充图。1)。Nf-κB信号的异常激活，无论是通过表达EB病毒的lmp 1(潜在膜蛋白1)癌蛋白，还是通过nf-κB负调节因子的体细胞突变(如TRAF 3、cdd、nfkbia、nlrc 5)，都被证明在鼻咽癌的发生发展中起着推动作用。12,13,14。LMP 1在鼻咽永生化上皮细胞系NP 69中的瞬时表达SSTR 2转录(图1.2C，补充图。2A表明EBV可能通过NF-κB信号途径上调SSTR 2的表达。这种SSTR 2的表达被NF-κB负调节因子TRAF 3的共同表达所抑制。二维空间)或用NF-κB抑制剂BAY 11-7085治疗。2E)。此外，具有突变型CTAR 1和CTAR 2结构域的LMP 1蛋白对LMP 1激活NF-κB至关重要(参考文献1)。15；补充图。2与转染野生型LMP 1的NPC相比，SSTR 2的表达明显降低。2F，g)。LMP 1的CTAR 1结构域除了参与NF-κB信号转导外，还能激活AKT和MEK/ERK通路。这些途径的药物抑制剂表明，LMP 1激活的SSTR 2的表达是由MEK诱导的，而不是AKT(见图)。2E，补充图。2B)。作为在NP 69细胞中转染LMP 1的补充途径，我们使用了c66-1鼻咽癌细胞株，其中NF-κB信号是通过其负调节因子TRAF 3、CYLD和TNFAIP 3的体细胞突变而内源性激活的。12,13。NF-κB抑制剂BAY 11-7085和MEK抑制剂U 0126可抑制C66-1细胞SSTR 2的表达。2H或在siRNA驱动下下调活化NF-ĸB信号复合物(NFKB 1(p 105/p50)、NFKB 2(P 100/p52)或RELB)和c-jun(图1)的亚基。2I，补充图。2C，d)13。这些结果提示EBV感染可通过潜在癌蛋白LMP 1的表达及NF-κB和MEK信号通路的激活来诱导鼻咽上皮细胞SSTR 2的表达(补充图)。3)。这一观察进一步证实了其他EBV诱发的癌症(补充图)。4).

EBV驱动的信号通路参与SSTR 2的表达

为了验证sstr 2的表达与EBV感染之间的联系，我们分析了一个独立的NPC队列，其中113个样本有基因表达数据。16。基于基因表达的非监督层次聚类和主成分分析(PCA)揭示了该数据集中的两组样本(图)。2J，左面板)。差异基因表达分析显示SSTR 2在1组肿瘤中过表达。2J、中间面板)。此外，基因集富集分析(GSEA)显示，与另一组相比，1组标本中与病毒感染相关的通路增加(图1)。2J，右面板)。此外，对另一个数据集进行监督分析，其中两个EBV基因都在其中表达(见图)。2K(左面板)和微阵列人类基因的表达17病毒LMP 1的表达与肿瘤SSTR 2的表达呈正相关(图一)。2K肿瘤NFκB1和SSTR 2的表达(补充图)。5与不表达LMP 1的标本相比，LMP 1表达的标本中病毒的生物发生途径有明显的上调(图一)。2K，右面板)。

抗SSTR 2药物结合物PEN-221的抗肿瘤作用

我们推测SSTR 2在患者中的表达可能使鼻咽癌对SSTR 2靶向的细胞抑制剂或细胞毒性药物敏感。为了研究这一问题，我们使用了特征良好的EBV阳性鼻咽癌细胞株c66-1。18、NPC 4319，以及C1720。C 666-1和NPC 43在体外培养或体内移植时，Eber、SSTR 2和Ki-67增殖抗原高表达，而C17呈SSTR 2阴性。3A)。接下来，我们测试了顺铂(一种用于治疗鼻咽癌患者的化疗药物)和一系列sstr 2激动剂对这些细胞系的体外增殖/存活的影响，其中包括fda批准的lanreotid和octreotide和pen-221，这是在英国和美国对net患者进行的第1/2a期临床试验。21。PEN-221是由一种多肽组成的药物结合物，对与微管蛋白聚合抑制剂DM1结合的sstr 2具有很高的选择性，在临床前模型中显示出了有效性。22。与网状结构不同的是，兰利肽和奥曲肽在体外不影响C 666-1和NPC 43的增殖，与PEN-221形成鲜明对比(图1)。3B和补充图。3)。我们接下来皮下移植C 666-1细胞到无胸腺裸鼠体内，用奥曲肽(奥曲肽)治疗已建立的肿瘤。n=9)，笔-221(n=8)或车辆管制(n=9)。经PEN-221处理的小鼠总体存活率显著提高(p=0.0368；原木级曼特尔-考克斯检验)(图.3C，d)，进一步表明PEN-221的抗肿瘤效果优于奥曲肽。

PEN-221体外细胞毒有效载荷的分子效应

接下来，我们用RNA-seq来探讨SSTR 2靶向药物对C 66-1细胞的分子效应.兰利肽和奥曲肽不影响SSTR 2的表达，但可诱导与生长抑素相关的信号通路如白细胞介素信号通路的上调。23以及24h后细胞衰老途径的上调(图一)。3E未显示奥曲肽的数据)，但细胞死亡/凋亡途径无变化。相反，用PEN-221处理72h后，SSTR 2的表达明显下调(如图所示)。3F)以及与凋亡信号和有丝分裂纺锤体形成失调相关的通路的上调，后者符合PEN-221细胞毒性有效载荷的机制。24.

SSTR 2作为鼻咽癌诊断标志物的临床应用

在鼻咽癌患者的临床试验(NCT 03670342)中，我们展示了SSTR 2作为鼻咽癌潜在无创生物标志物的应用，并将SSTR 2蛋白表达数据与6812例GADOTA肽显像资料。我们发现SSTR 2的表达水平与体内摄取的SSTR 2有显著的相关性。68Ga-DOTA-肽(图1.4A，b)，表明这种显像方式作为监测SSTR 2表达的无创标记物和SSTR 2受体靶向放射性核素治疗的靶点(Lutety-177，Ytrium-90)的潜力。

SSTR 2的表达是鼻咽癌预后的生物标志物

对来自欧洲中心(治疗标准相似的)患者的研究人群的总体生存率分析显示，SSTR 2阳性的鼻咽癌患者的生存率有所提高(p < 0.001) (Fig. 4C)。结合EBV和SSTR 2的分类，EBV阴性和SSTR 2阴性的患者预后最差(补充图)。7)。此外，在多因素Cox回归分析与SSTR 2状态，EBV状态，病人年龄，T，N，M分期，所有有这些信息的所有患者(nSSTR 2阳性率仍可预测患者预后的改善(HR=0.41)。4D)。重要的是，在此分析中，EBV状态与SSTR 2状态无关。

综上所述，对402例原发、局部复发和转移的鼻咽癌患者标本中SSTR 2的表达进行了综合分析，发现SSTR 2与EBV感染有极显著的相关性，提示SSTR 2在本病中的重要作用(80%以上阳性)。通过整合SSTR 2的表达机制、临床前研究和影像学结果，我们提出了一种新的鼻咽癌发生模式，并与潜在的诊断、预后、监测和治疗策略并行(图1)。4E参考文献中有相关文献。25,26,27,28).

我们还展示了SSTR 2在预后和应用中的潜力。68GA-DOTA肽扫描，类似于这种成像技术在胃肠道网、前列腺、乳腺癌和结直肠癌中的应用。7,29,30。SSTR 2表达水平与大鼠体内摄取的相关性68GA-DOTA肽提示该显像方法可作为选择PEN-221治疗患者的无创标志物，监测其反应，并可能监测鼻咽癌、手术和放射性核素治疗计划，并可通过功能成像数据的整合应用于术中导航系统。

根据开放标签第三阶段多国试验的最新数据31吉西他滨联合顺铂是目前治疗复发或转移性鼻咽癌的标准。在鉴定了SSTR 2在大多数NPC中的表达和SSTR靶向治疗的临床前疗效后，我们的数据支持将NPC纳入正在进行的第1/2a期PEN-221在网状网中的临床试验。

总之，我们的研究建立了SSTR 2作为EBV诱导的原发、复发和转移NPC的可药物靶点，以及靶向治疗的临床前疗效。我们展示了EBV感染与SSTR 2表达的机制联系，为鼻咽癌患者SSTR 2的常规检测提供了理论依据，为预测鼻咽癌预后、探讨68 Ga-DOTA肽PET-CT显像在鼻咽癌诊断、监测和手术计划中的价值以及为晚期和复发性鼻咽癌的热疗提供了理论依据。

材料

402份福尔马林固定石蜡包埋的鼻咽癌标本来自三家欧洲机构(英国伦敦大学学院/伦敦大学学院医院；奥地利因斯布鲁克医科大学；荷兰乌得勒支大学医学中心)、一家美国机构(美国帕洛阿尔托斯坦福大学)和4家亚洲机构(印度日惹加贾马达大学/萨尔吉托博士医院、香港中文大学、香港特别行政区、济南大学、深圳大学和新加坡国家癌症中心)。所有机构(印度尼西亚日惹：Ke/FK/0198/EC/2017；新加坡：2015/2482；中国香港：CREC-2013-229；中国深圳：LL-KY-2019143；英国伦敦：UCL 04/0099；REC 04/Q0505/59；美国斯坦福大学：IRB-43567；奥地利因斯布鲁克：AN2014-0241,340/4.20；荷兰Utrecht：TCBio 14/510)获得了所有机构的伦理批准，并得到了伦敦大学学院研究伦理委员会(UCL REC No.9609/002)的进一步伦理批准。组织学特征和样本选择/队列由两名头颈部病理学家(SWI；SS)进行。将诊断日期定义为组织提取时间，用于组织学诊断。操作系统的结束日期是死亡日期。

组织芯片构建

组织微阵列(TMA)是从荷兰乌得勒支大学医学中心的93份标本中构建的。TMA大师乐器(3D HISTECH，布达佩斯，匈牙利)使用各自的FFPE块建造TMA。肿瘤区域由病理学家(SWI)和病理住院医师(MoO)在NPCs的组织学评估中进行标记。三个核心(0.6mm)从标记的肿瘤区被打孔并排列成一个受体TMA供体块。32.

SSTR 2、Ki-67色粒蛋白A和突触素表达的免疫组织化学分析

免疫组织化学在不同的机构进行，几乎全部使用Ventana自动染色仪器(Ventana医疗系统，Tuscon，AZ，美国)。为了这些目的，新加坡团队使用了LeicaBond-Max(Leica生物系统，湿地，日耳曼尼)自动着色器。为检测嗜铬粒蛋白A(LK2H10；Ventana)、突触素(SP 11；Ventana)和Ki-67(克隆MIB-1，DAKO，Glostrup，丹麦)，采用常规染色方法。为检测SSTR 2，采用兔单克隆抗体UMB 1(ABCAM，剑桥，英国)。更详细的染色协议列于辅助材料。在Utrecht中使用了一种抗SSTR 2抗体(兔多克隆，编码SS-8000-RM，稀释后的1：5，BioTrend，德国科隆)，并进一步验证了上述抗体(补充图)。7)。在头颈部病理学家(SWI，SS)的指导下对幻灯片进行评价。评估免疫组化染色者的临床结果或EBV状态，并对肿瘤细胞膜染色进行评估(图二)。1)。根据染色程度和强度分为阳性或阴性两组。在0~100%范围内连续评分。强度分为三类(1：弱染色不容易通过低功率目标可见；2：中等染色仍可在低功率目标上看到；3：强染色易通过低功率目标可见)。

EBV状态

EBV状态用EB病毒编码的早期RNA(Eber)原位杂交(ISH)检测。Ventana基准自动染色仪器(Ventana医疗系统，Tuscon，AZ，美国)被用于样本的ISH或TMA，使用EBV特异性探针(InstallEber探针；Ventana医疗系统)和ISISIView蓝色检测试剂盒(Ventana医疗系统公司)。在Innsbruck，Utrecht，Hong Kong，Stanford和London使用制造商的说明进行染色。深圳采用电子探针(中山市金泉生物技术有限公司；北京)和自动着色器(文塔纳医疗系统有限公司)表演ISH。新加坡用债券TM准备使用的ISEBER探针和一个Leica Bond-Max自动染色器(所有莱卡生物系统，德国韦茨拉)用于这一目的.采用EBV特异性探针(InstingEber探针；Ventana医疗系统)和ISIView蓝色检测试剂盒(Ventana Medical System，Inc.)对异种移植物和细胞颗粒进行原位杂交。使用制造商的指示。

原发上皮细胞EBV感染

原代上皮细胞在无血清角质形成细胞生长培养基(KGM-SFM，Thermo Fisher Science，US)的玻璃玻片上培养，温度为37℃，CO浓度为5%。2。细胞暴露于5×107M81病毒作用72h后，用1×PBS清洗细胞，去除病毒。用4%PFA固定15 min，1×PBS/0.1%Triton-X 100渗透10 min。阻断30 min后，将细胞置于37°C的1%BSA/PBS中4 min，与抗人SSTR 2的兔抗体(克隆11 HCLC，Thermo Fisher，稀释1：200，1%BSA/PBS)在4°C下稀释12h，在37℃下冲洗并与EBNA 1(德国慕尼黑R.Feederle提供的克隆1H4)大鼠抗体孵育，37℃下稀释1：10(1%BSA/PBS)2h。经三步洗涤后，将细胞与亚Alexa 488偶联的山羊抗兔抗体(A 11008，Invitrogen；稀释1：300)和与Cy3(112~165~143，Dianova；稀释1：900)的次级抗鼠抗体在37°C下孵育30 min，用DAPI(40 ng/ml)对细胞核进行染色。用装有CCD摄像机的Leica表观荧光显微镜对幻灯片进行了分析。QPCR：经DNase处理后，采用随机引物组合，用AMV-逆转录酶(ROCHE)对三唑纯化的RNA进行反向转录。用特异性引物(EBER 1 fd5‘-acgccccctagttttg-3’，EBER 1 rev 5‘-gcagagagagttggga-3’)和探针(EBER 1探针5‘FAM-aggacggtctgtgtgt-3’Tamra)在ABI一级加序列检测系统(应用生物系统)上用通用热循环法检测Eber转录本。所有RT-PCRS均包括未经逆转录酶处理的阴性对照样品.所有样本一式两份，并附有专为人类设计的引物。GAPDH使基因正常，以适应cDNA恢复过程中的变异。用特异性引物(SSTR 2 fdGAATCAATCATAGCGTTTTTTTGCATGTC，SSTR 2 rev CATAGCGGAGGATGATAAATGAC)扩增SSTR 2转录本，共40个周期。未感染的原代上皮细胞作为阴性对照。所有使用过的引物都列在补充表中。6.

细胞培养

C 666-1细胞在RPMI-1640中培养，加10%热灭活FCS(吉布科、Carlsbad、CA)、2mm L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素(吉布CO)和0.1mg/ml链霉素(吉布CO)。细胞保持在37°C，5%CO2每隔7天，以1：2的比例使用漆酶进行传递(Sigma，St.Louis，MO，USA)。每2~3天用新鲜培养基代替75%的培养基.NPC 43和C17细胞在RPMI-1640和25 mm Hepes(德国柏林隆扎)中培养，加10%热灭活FCS(吉布科、Carlsbad、CA)、2mm L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素(吉布科)和0.1mg/ml链霉素(吉布科)和4M Y 27632(Promocell，Heidelberg，德国)。细胞保持在37°C，5%CO2并以1：4比1：4的比例传递5天(Sigma，St.Louis，MO，USA)。每2~3天用新鲜培养基代替培养基。

细胞颗粒中SSTR 2的免疫组织化学分析

常规培养的细胞系(2-4×106)经离心收集后，用琼脂糖包埋(参考文献)。33，修改如下34)：用290×离心法分离细胞。g在4°C下放置10 min，用10毫升中性缓冲液4%甲醛溶液固定(Flintsbach Am Intel，德国)。固定后用400×离心法分离细胞。g室温下持续10分钟。细胞颗粒再悬浮于300μl PBS中，转移至Eppendorf管(1.5ml)，冷冻保存。以PBS为3%溶液，采用微波加热法制备低熔点琼脂糖(凝胶点34~37℃)，并将其在65℃~65℃的温度范围内平衡30 min以上。300 lPBS-细胞悬液在65°C下平衡不超过10 min。将600μl熔融平衡琼脂糖注入细胞悬浮液，然后在2000×时纺丝。g室温下持续5分钟。在此之后，将试管放置在冰上，细胞颗粒被修剪并放置在盒式盒式盒中。用含0.05%-0.1%叠氮化钠的PBS包埋盒内的细胞颗粒，直至石蜡包埋。(奥地利Neudorf)石蜡包埋系统，遵照制造商的指示。包埋后取组织切片进行原位杂交和免疫组织化学检测。用HM355S微体(Microm，Walldorf，德国)连续切片5m厚的嵌入标本，并贴在SuperFrostTM Plus幻灯片上(Menzel，Braunschweg，德国)。安装后的标本在室温下干燥一夜，然后在60°C下孵育1小时，使切片标本牢固地附着在玻璃表面上。免疫组化检测SSTR 2的表达。

药物

兰雷肽和醋酸奥曲肽是从阿卡姆(英国剑桥)获得的。Belinostat(PXD 101)是从Selleckchem(美国休斯敦)、顺铂‘Ebewe’从Sandoz(德国Holzkirchen)和Pen-221获得的。35由Tarveda治疗学公司(美国马萨诸塞州沃特敦)提供。

MTT法细胞活性测定

在添加试验化合物前两天，NPC细胞在2×10的密度下被镀。4细胞/井在96井板。化合物按生产厂家的建议配制，在介质中稀释半对数，从10 M(顺铂30 M)开始，一次加到井中。去除含有PEN-211的培养基2 h后，用PBS洗涤细胞，加入新鲜培养基。盘子在腐化室中孵育7天，每隔一天用新鲜药物稀释液交换50%的培养基。加入3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]−2，5二苯基四氮唑溴化试剂(20l/5mg/ml溶液)(Sigma-Aldrich)，用100 mg/ml的0.1mg/mlSDS/0.01MHCl溶液溶解4h。在微平板阅读器(Epoch BioTek，BioTek仪器，Bad Friedrich，德国)中，以550 nm为测量波长，655 nm为参比滤光片，测量5h后的双吸光度。在减去背景吸光度后，将存活细胞的分数归一化为未处理样品的平均值。

RNA-seq分析

C 666-1细胞密度为1×10。6/在复合加成前2天在六井板中打井。PEN-221是按照制造商的建议准备的，5M是加在三份中的.以未处理井和DMSO处理井(中型1：2000)作为对照.24和72 h后-221加注，DNA和RNA提取是从不同的井中进行的快速-DNA加和直接-zol RNA加套件(Zymo Research，欧文，美国)根据制造商的指示。

RNA浓度标准化为100 ng/50 ng/50μl和Illumina文库，使用NEBNext Poly(A)mRNA磁分离模块和NEBNext Ultra II定向RNA库准备工具包(新英格兰生物标记)，根据制造商使用稀释1：50适配器的说明。库用Agilent高灵敏度D 1000 ScreenTAPE系统(Agilent)在2200 Tapestation(Agilent)上定量，在等摩尔浓度下集合，在NextSeq 500(Illumina)上进行变性和测序。

利用无参考量化工具鲑鱼从fastq文件中估算rna序列转录本丰度。36使用GENCODE GRCh37文本注释。用DESeq 2进行差异表达分析。37与处理，时间和批次(如适用)为协变量。利用聚类分析器的GSEA功能进行基因集富集分析。38，使用Reactome数据库39通路对DESeq 2基因的Wald统计和最小和最大通道大小分别为25和500。Q值<0.05的路径被认为是显著丰富的。

对于只有fpkm值可用的公开npc数据集，使用limma包进行差异表达式分析。40通过log2(FPKM+1)值的分层聚类来定义样本组。调整后的p值用eBayes函数计算。GSEA按DESeq 2的结果进行，但以log2倍的变化作为排名分数。

小鼠体内实验

这些实验已由伦敦大学学院动物福利和伦理审查机构(Awerb)根据1986年“动物(科学程序)法”在B.V.项目许可下批准，并在计划的实验准备过程中对参与UCL优化、生长曲线和SSTR 2染色的科学家进行个人许可。2×1066~8周龄雌性无胸腺裸鼠经右侧皮下注射C 666-1细胞100μl(50%Matrigel)，起始体重约20 g，小鼠在内政部范围内(18~22°C，湿度40~60%)。老鼠在早上7点到晚上7点的12小时光暗循环中运行。每组10只，每组10只。根据先前的MTD研究(详见下文)，PEN-221的剂量水平与PEN-221车辆缓冲液和奥曲肽作为阴性对照。中位肿瘤体积>0.1cm时开始药物治疗3每周对小鼠进行两次监测。对小鼠进行健康评分，称重，用卡钳测量肿瘤。当肿瘤达到>1cm时，当达到人道终点时，捕杀小鼠。3肿瘤溃疡，体重减轻>20%。

奥曲肽在0.5%溶质醇/5%甘露醇/5 mm醋酸缓冲液中配制，pH值为4.0，浓度为等摩尔浓度至PEN-221。车辆控制(PEN-221车辆缓冲液)为0.5%溶质醇/5%甘露醇/5mm醋酸缓冲液，pH4.0。PEN-221：PEN-221是在0.5%溶媒/5%甘露醇/5 mm醋酸缓冲液中配制而成，pH4.0，浓度为1.5 mg/kg，即0.30 mg/ml，5ml/kg。

肿瘤正中体积≥0.1cm时开始治疗3。将小鼠分为3组：对照组：每周注射5×周，剂量为5ml/kg；(2)奥曲肽：5×周注射，剂量为5ml/kg，剂量为5ml/kg，摩尔当量为PEN-221；(3)PE-221：5×每周注射，剂量为5ml/kg。C666-1进行异种移植，肿瘤标本用福尔马林固定的石蜡包埋切片进行SSTR 2染色。

病人生存分析

采用IBM SPSS统计软件(24版)和R软件对数据进行分析。使用Pearson X计算了群体间单变量独立性的可能性。2对分类变量进行测试(并在适当的情况下进行Fisher的精确检验)。采用Kaplan-Meier法计算生存率，对数秩检验进行生存率比较。对SSTR 2阳性率进行回顾性Logistic回归分析，并结合临床病理特点进行比较。临床病理特点：年龄(65岁截止)，T期(T1/2，T3/4)，N期(N0)。对决N1/2/3)，M期(M0对M1)。双尾p-数值<0.05被认为是有统计学意义的。

采用多因素Cox回归生存分析方法，以中心(欧洲/亚洲二分法)、SSTR 2状态、EBV状况、性别、年龄、T(分别为T1和T3)、N(二分法为N0-1和N2-3)、M分期为协变量进行多因素Cox回归分析。中心和性别被从最终模型中移除，因为它们被发现没有意义(p < 0.05). The proportional hazards assumption was tested using the cox.zph function; none of the covariates in the final model were found to violate the proportional hazards assumption (p < 0.05). Concordance was calculated with Cohen’s Kappa.

68Ga-DOTATE分子成像

前瞻性研究鼻咽癌生长抑素受体显像(ClinicalTrials.gov：NCT 03670342)。获得了所有患者的知情同意，并获得了中央机构审查委员会的批准(IRB协议编号2015/2482)。

肽标记68新加坡综合医院核医学和分子成像科使用自动合成模块(Scintomics GmbH)执行Ga。简而言之，40g DOTA-[Tyr]3]用镓-68洗脱剂对奥曲酸盐前体(Auuspep)进行放射标记。68GE/68Ga发生器(南非iThemba)。用10 ml 0.6M盐酸洗脱68 Ge/68 Ga发生器。用PS-H柱捕获镓-68，用1.7ml 5 M氯化钠溶液洗脱至1.5M HEPES缓冲液3ml。溶液在125°C下加热6 min，用Sep-Pak LightC18盒纯化，最后用50%乙醇(v/v)2ml洗脱，用19 ml磷酸盐缓冲液稀释。用薄层层析法确定放射化学纯度，其纯度均大于90%。

全身68Ga-DOTATE和18F-FDG PET/CT成像是使用专用通用电气PET/CT系统(GE Discovery690 VCT，GE Medical Systems，LLC，Waukesha，USA)进行的。扫描从头骨顶点到大腿中部。CT采用(18F-FDGPET)和非(68Ga-DOTATE PET)静脉对比剂应用，用于衰减校正：100 kV；“GE SmartMa剂量调制”螺旋厚度：3.75mm；桌速：0.984 mm；旋转时间：0.8秒。在三维模式下(每张床位2 min发射时间)对头盖骨至大腿上部进行衰减校正全身(顶点)扫描。根据身体长度，使用了8个床位，视野为50厘米。对于飞行时间(TOF)数据的迭代重建，采用了三次迭代和24个子集，滤波截止值为7.0。PET扫描间隔时间不超过7天。

患者静脉注射111-148 mbq68根据先前描述的成像协议，摄取时间至少60分钟后，Ga-DOTATE和获取开始。多平面重建用于图像解译。图像由一位经验丰富的核医学医生解释。PET评分，定性分类为无，轻度，中度和强。此外，还利用最大标准摄取值(SUVmax)对示踪剂摄取强度进行了半定量测量。利用PET/CT-扫描仪(GE AWS)供应商提供的商用软件，根据SUVmax计算肿瘤病灶(鼻咽肿瘤、淋巴结、软组织、内脏和骨病灶)和参考组织(肝和脾)的感兴趣体积，并手动调整其大小。