小剂量环磷酰胺联合外周血干细胞与脐带间充质干细胞联合移植治疗SAA的可行性

移植后环磷酰胺(PTCy)作为移植物抗宿主病(GVHD)的预防措施，是一种有效的抗宿主病(GVHD)策略，适用于同胞造血干细胞移植(MSD-HSCT)和半相合HSCT(HAPLO-HSCT)。我们在+3、+4联合外周血干细胞(PBSCs)和脐血间充质干细胞(UC-MSCs)联合移植治疗重度再生障碍性贫血(SAA)的基础上，评价了环磷酰胺20 mg/kg治疗13例MSD-HSCT队列患者和22例HSCT患者的疗效和安全性。MSD-PTCy组中性粒细胞和血小板植入时间明显短于对照组(P<0.05)。日+100天急性GVHD(AGVHD)累积发病率(15.4%)低于MSD对照组(P=0.050)。无一例发生慢性GVHD(CGVHD)。1年总生存率(OS)和无事件生存率(EFS)分别为100%和92.3%.在Hplo-PTCy队列中，中性粒细胞和血小板植入的时间明显短于对照组(P<0.05)。AGVHD在日+100和1年cGVHD的累积发生率分别为31.8%和18.2%，1年OS和EFS发生率分别为81.8%和66.9%。减少剂量的PTCy和联合移植PBSCs和UC-MSCs是SAA患者可以接受的替代方案.

严重再生障碍性贫血(SAA)是一种危及生命的疾病，可以通过基于人类白细胞抗原(HLA)的异基因造血干细胞移植(allo-hsct)来治愈。1。然而，接受hsct治疗的患者总是会出现相关并发症，包括移植物抗宿主病(Gvhd)、移植物排斥反应和感染，尤其是那些缺乏常规HLA-相同供体的患者。2。因此，单倍型造血干细胞移植(haplo-hsct)的使用受到移植物失败和gvhd发生率的限制。3。移植物来源通常是骨髓(BM)和外周血干细胞(PBSCs)。由于获得细胞容易，干细胞数量高，PBSCs越来越多地被使用。然而，PBSCs的使用与急性GVHD(AGVHD)和慢性GVHD(CGVHD)的发病率比使用BM高。4.

间充质干细胞具有潜在的自我更新能力、多系分化能力和免疫功能调节能力。因此，MSCs可以降低aGVHD和cGVHD的风险。5。研究表明，骨髓间充质干细胞不仅能促进中性粒细胞和血小板的植入，而且还能促进供体嵌合体的形成。6。此外，人脐带源性骨髓间充质干细胞(uc-msc)较bm-msc具有更高的增殖和分化能力。7。因此，UC-MSCs在ALLO-HSCT在SAA患者的临床应用中发挥着重要作用.

目前，降低GVHD的策略包括抗胸腺细胞球蛋白(ATG)和移植后环磷酰胺(PTCy)在haplo-HSCT中的应用。然而，ATG成本高是常规应用的主要障碍。近年来，Ptc作为一种单倍相合的T细胞消耗方案，已成为非恶性血液病患者在单纯性hsct环境下的一种有效的替代策略。8,9。PTCy作为GVHD的预防在不匹配的无关供者(MMUD)HSCT中显示出比ATG更好的效果。10。几项研究在评价PTCy 50 mg/kg在haplo-hsct环境下的疗效后，取得了令人鼓舞的结果。11,12,13。Biju G等人认为50 mg/kg的PTCy作为唯一的GVHD预防在SAA患者中是可行的。14。然后，一项研究显示，较低剂量的40毫克/千克可作为mmudd-hsct的一种替代atg的预防gvhd的方法，而且是安全的。15。尽管如此，由于环磷酰胺(CY)在预处理方案和PTCy中的重复不良反应，在异源HSCT环境下SAA患者通常面临更大的心脏毒性风险，并且缺乏对低PTCy剂量的评估。在此，我们评估了小剂量PTCy方案联合PBSCs和UC-MSCs联合移植治疗SAA患者的有效性和安全性。

病人

33例患者接受MSD-HSCT治疗，37例患者接受HSCT治疗。MSD-PTCy组13例，MSD-对照组20例，MSD-PTCy组22例，MSD-对照组15例.描述患者临床过程的流程图如图所示。1。表中总结了MSD-HSCT和haplo-hsct患者的临床特点。1和2。除干细胞来源外，PTCy组与对照组在基线人口学上差异无显着性(P>0.05)。8例(40%)MSD对照组和所有对照组患者均接受PBSCs和BM治疗，PTCy组患者均接受PBSCs和UC-MSCs治疗，2例原发性移植物失败患者接受另一次供体骨髓移植。MSD-PTCy组6例(46.2%)，Hplo-PTCy组13例(59.1%)，中位年龄分别为20岁(9~35岁)和14岁(3~31岁)。对1例PTCy患者进行抗人淋巴细胞免疫球蛋白预移植治疗.其余患者曾接受环孢霉素(CsA)和/或类固醇治疗。另外，有2例(9.1%)肺部感染患者入院前需要治疗，其中1例合并真菌窦感染。幸运的是，这两名病人的感染在植入后得到了控制。

植入

在MSD-PTCy队列中，所有患者均成功移植.MNC：16.36(12.57~23.91)×10，MNC：16.36(12.57~23.91)×10。8/kg vs 14.04(范围6.33至24.95)×108CD 34+细胞：7.39(范围4.35至18.4)×106/kg vs 5.39(范围1.02至13.37)×106(公斤)。然而，我们观察到，在MSD-PTCy队列中，中性粒细胞和血小板植入的时间比对照组短[11天(10~14天)比13天(10至23天)和12天(9至15天)比14天(10至45天)]。MSD-PTCy组与对照组移植排斥反应无显着性差异(7.7%vs 15.0%)。MSD-PTCy组和对照组第30天嵌合体率分别为100%和90%，差异无显着性(P>0.05)。

在HSCT组中，输注MNC和CD 34+细胞的中位数比较(MNC：18.73(8.41~32.35)×10)。8/kg vs 23.43(2.02-31.72)×108CD 34+细胞：7.60(4.21-19.45)×106/kg vs 8.95(1.76-22.53)×106(公斤)。2例原发性移植物失败患者在接受单倍相合供体移植后成功植入。在单纯性组中，1例在移植后1.5个月出现继发性移植失败，该患者在接受MMUD-HSCT治疗后持续植入。PTCy组中性粒细胞和血小板植入时间明显短于对照组[12天(9~15天)vs 13天(11~19天)和11.5天(9~17天)vs 14天(11~62天)]。每组一名患者发生移植物排斥反应。

急慢性GVHD

在MSD-PTCy队列中，日+100天的aGVHD累积发病率为15.4%(95%CI 2.2~39.9)，对照组为50.0%(95%CI 26.3~69.8)。P=0.050)(图1。2a)。MSD-PTCy组II~Ⅳ级aGVHD的累积发生率低于对照组，7.7%(95%CI 0.4~30.3)比30.0%(95%CI 11.8-50.7)，但差异无统计学意义(P>0.05)。P=0.122)(表3)。无一例患者在MSD-PTCy队列中出现cGVHD。对照组1年累积cGVHD发生率为15.0%(95%CI 3.5~34.1)。2b)。

在日+100天，haplo-ptcy队列中aGVHD的累积发病率低于对照组(表)。4)，分别为31.8%(95%CI 13.8~51.6)和60.0%(95%CI 29.9~80.6)，但无显着性差异(P>0.05)。P=0.165)(图1。2c)。Ⅱ-Ⅳ级aGVHD的累积发生率为27.3%(95%CI 10.8-46.9)，对照组为53.3%(95%CI 24.8~75.3)。P=0.170)。值得注意的是，1例Ⅳ级肝aGVHD患者有颅内aGVHD，1例aGVHD患者在单纯性PTCy队列中发展为皮肤cGVHD。HSCT组间1年累积cGVHD发生率无显着性差异(P>0.05)。P分别为18.2%(95%CI 5.5-36.8)和26.7%(95%CI 7.7-50.7)。2d)。Hplo-PTCy组无广泛的cGVHD，对照组1例发生广泛的cGVHD。

养生毒性

MSD-PTCy组肺部感染发生率明显低于对照组(P<0.05)。P=0.022)，分别为7.7%和50.0%。同样，MSD-PTCy队列中巨细胞病毒(CMV)和EB病毒(EBV)再激活率显著低于对照组(CMV：23.1%vs 65.0%；EBV：0 vs 60.0%)，差异有显着性(P<0.05)。P分别为0.032和0.001)。MSD-PTCy组出血性膀胱炎发生率(7.7%)低于PTCy组(35.0%)，但差异无显着性(P>0.05)。P=0.108)。1例患者ABO兼容HSCT后发生纯红细胞再生障碍性贫血(PRCA)，移植后18个月造血功能恢复。12例EBV患者中，4例发生移植后淋巴增生性疾病(PTLD)，3例采用免疫抑制剂戒断、利妥昔单抗和供者淋巴细胞输注(DLI)联合治疗。另一例因颅内EBV感染而发生癫痫发作。此外，有2例患者发生不明原因的癫痫发作，经预期治疗后缓解。心脏毒性和血栓形成微血管病变(TMA)各在一例。无静脉闭塞性疾病(VOD)。

Hplo-PTCy组肺部感染发生率低于对照组(40.1%vs60.0%)，而hsct组CMV再活化率高于对照组(81.8%vs53.3%)，但差异无统计学意义(P>0.05)。P：0.325，0.080)。HSCT组和对照组CMV感染的中位时间分别为+37天(29~46天)和+35天(25~53天)。HSCT组18例CMV感染者中有2例发生巨细胞病毒视网膜炎，对照组8例CMV感染组中有1例发生巨细胞病毒视网膜炎。HSCT组EBV激活率(22.7%)明显低于对照组(80.0%)，差异有显着性(P<0.05)。P=0.001)。在Hplo-PTCy队列中没有PTLD，但3例患者根据其在对照组中的EBV阳性状态而发展为PTLD。BKV血清阳性的出血性膀胱炎发生率分别为31.8%和26.7%，与对照组比较差异有显着性(P<0.05)。在Hplo-PTCy组中，7例BKV阳性患者中有1例进展为BKV脑炎，并伴有颅内真菌感染。另外，1例患者在+50天出现TMA。另外，后部可逆性脑病综合征(PRES)在单纯性PTCy组4例，对照组2例。两组患者均未发生VOD。

生存

MSD-PTCy队列的中位随访时间与对照组相似，22个月(10~36)个月，21.5个月(2~36)个月。HSCT组和对照组的中位随访时间分别为11.5个月(3~27)个月和12个月(1.5~36)个月。

所有13名(100%)的MSD-PTCy患者现在都有正常的造血。有趣的是，一位女性现在已经怀孕三个月了。MSD-PTCy队列的1年总生存率(OS)为100%，而MSD对照组为75.0%(95%CI为50.0~88.7)。P=0.057)(图1。3a)。MSD-PTCy队列的1年无事件生存期(EFS)为92.3%(95%CI 56.6~98.9)，而MSD对照队列(95%CI 40.3~81.5)为65.0%(95%CI 40.3~81.5)。P=0.071)(图1。3b)。对照组2、3、5个月死于严重肺部感染3例，+70天死于颅内EBV感染1例，4个月死于TMA 1例。在MSD-PTCy队列中，13名患者中有12名在撰写本报告时有超过12个月的随访期。所有患者在6个月开始减少免疫抑制治疗，除PRCA患者外，其余药物均在9个月前停药。

其中2例在3个月和9个月死于难治性肺部感染，1例于3个月死于脑出血，1例死于肠道GVHD，死亡时间为7个月。对照组4、6个月死于肺部感染2例，重度肠GVHD死亡1例，死亡时间为12个月。1年OS的累积发生率为81.8%(95%CI 58.5~92.8)，而对照组为77.1%(95%CI 44.2~92.1)。3c)。对照组1年EFS为66.9%(95%CI 39.1~84.2)，对照组为40.8%(95%CI 20.5~71.2)。3d)。两组间1年OS或EFS差异无显着性(P>0.05).在Hplo-PTCy队列中，18例存活患者中有11例在编写本报告时有超过12个月的随访期，这些患者在HSCT后9个月开始减少免疫抑制治疗。

对SAA患者的有效治疗通常包括免疫抑制治疗(IST)、allo-HSCT和Etrombopag.IST的应用受到后遗症和ATG成本高的限制。16。虽然其有效率为20%~40%，但主要问题是复发和继发克隆性疾病。17。异源HSCT的关键挑战在于将并发症减少到最低程度，并最大限度地提高生存率。近年来，PTCy因其在异源hsct治疗中的良好预后，逐渐成为世界范围内的首选治疗方法。18,19。然而，高剂量的PTCy伴随着心脏毒性。因此，一些研究报道了小剂量PTCy治疗恶性和非恶性血液病的结果。15,20。此外，uc-msct在alo-hsct中也很受欢迎，因为它有几种有益的效果，包括促进植入和降低gvhd。21,22。目前，对接受PBSCs与UC-MSCs联合移植的SAA患者的PTCy的评价较少。因此，本前瞻性研究的目的是探讨小剂量PTCy对UC-MSCs和PBSCs联合移植SAA患者的早期预后的影响。

GVHD是SAA患者进行异种HSCT治疗的主要障碍.PTCy是一种很有吸引力的选择，它可以消除早期增殖的异基因反应T细胞，以减少受损的免疫重建。23,24。然而，高剂量的PTCy伴随着心脏毒性。然后，将PTCy的剂量从传统的50 mg/kg的MSD-HSCT和haplo-HSCT分别降至20 mg/kg和25 mg/kg。结果表明，在msd-ptcy队列中，日+100天aGVHD的累积发病率明显低于对照组(P<0.05)。P=0.050)。此外，MSD-PTCy组II~Ⅳ级aGVHD的累积发生率低于对照组，7.7%(95%CI 0.4~30.3)对30.0%(95%CI 11.8-50.7)无显着性差异。在MSD-PTCy队列中没有病人出现cGVHD.George等人报道30例SAA患者接受大剂量PTCy作为PBSC、MSD-HSCT唯一的GVHD预防。Ⅱ~Ⅳ级aGVHD和cGVHD发生率分别为22.0%和22.7%。14。在恶性血液病的msd-hsct中，高剂量ptc与II-IV级aGVHD(17%~45%)和cgvhd(7%至14%)的发生有关。25,26,27。一项多中心研究表明，在haplo-hsct环境下接受bm和PBSCs的SAA患者1岁时II-IV级aGVHD和cGVHD的累积发生率分别为33.7%和22.4%。28。在本研究中，日+100天和1年累积发病率分别为27.3%(95%CI 10.8-46.9)和18.2%(95%CI5.5~36.8)。虽然aGVHD和Ⅱ-Ⅳ级aGVHD的累积发生率或cGVHD的1年累积发病率均无显着性差异，但减少剂量的PTCy和PBSCs与UC-MSCs的联合移植可能克服了PBSCs引起的aGVHD和cGVHD的高发生率。令人鼓舞的是，MSD-PTCy队列中的1年操作系统是100%.我们观察到在1年的OS和EFS值在haplo-ptc和haplo-对照队列之间没有差异，但我们认为与常规PBSCs和BM相比，PBSCs和UC-MSCs的联合使用可以减少供体疼痛和提高捐赠率。

PTCy组中性粒细胞和血小板植入的时间短于对照组(P<0.05)。P < 0.05). The time to neutrophil and platelet engraftment in the haplo-PTCy cohort were 12 days (9–15) and 11.5 days (9–17), respectively. Moreover, the times to engraftment in the haplo-HSCT cohort were heterogeneous, with the time to neutrophil engraftment being 12 to 19 days, and the time to platelet engraftment being 13 to 21 days28,29,30,31。因此，植入的时间并没有因为PTCy的剂量减少而延迟.UC-MSCs在本研究中的应用也很特殊。骨髓间充质干细胞在HSCT环境中的各种能力包括促进移植物植入、修复移植物功能障碍和提供GVHD预防。32。一项回顾性研究表明，UC-MSCs有可能降低重型aGVHD的发生，从而影响患者的生活质量和预后。33。另一项研究也得出了同样的结论，证明了联合hsct联合UC-MSCs移植治疗SAA是可行和安全的。34。骨髓间充质干细胞分泌的血小板源性生长因子(PDGF)是一种可能的抗凋亡因子，具有刺激血小板恢复的潜力。35,36。关于骨髓间充质干细胞的植入功能存在争议，但大多数研究表明，骨髓间充质干细胞在allo-hsct中的作用是值得考虑的。33,34,37。但成体骨髓间充质干细胞存在着不同供体的质量差异、增殖能力有限和干细胞衰老等局限性。同样的多能干细胞(PSC)衍生MSCs(PSC-MSCs)是另一种质量控制的方法.Psc-MSCs具有较高的增殖潜能。38。Ⅰ期临床试验显示gmp级psc-MSCs治疗难治性gvhd的潜在能力。39。因此，PSC-MSCs可以提供另一种可能的细胞来源，克服成体BM-MSCs的许多局限性.

病毒感染的发生率是使用PTCY的allo-HSCT协议的另一个问题.在本研究中，md-ptcy组的病毒感染率低于对照组，无论是CMV组还是EBV组(P < 0.05). It is worth noting that no patient underwent EBV reactivation in the MSD-PTCy cohort. Patients with CMV reactivation especially have a risk for developing CMV-related diseases, including CMV pneumonia, retinitis and enteritis. Two patients and one patient with CMV seropositivity in the haplo-PTCy and haplo-control cohorts developed CMV retinitis, respectively. As a result, they developed varying degrees of visual impairment. However, the incidence of CMV reactivation in the haplo-HSCT cohort was higher than that in the haplo-control cohort, although there was no significant difference, which may be due to the additive immunosuppressive effects of ATG and PTCy. How to reduce the incidence of CMV reactivation is an outstanding problem. In the haplo-HSCT cohort, the incidence of EBV reactivation was significantly lower than that in the haplo-control cohort (P < 0.05), which was attributed to the use of rituximab at day + 5. Bacigalupo et al. showed that patients received rituximab at day + 5 after alternative donor HSCT had significantly lower rates of EBV-DNA and lower maximum median EBV copies than the control cohort (P < 0.05). Furthemore, rituximab at day + 5 had no influence on incidences of infections40。肺部感染是危及生命的主要并发症之一。MSD-PTCy组肺部感染发生率明显低于对照组(P<0.05)。P < 0.05). It is worth mentioning that the total dose of ATG was reduced from 10 to 8 mg/kg in the MSD-PTCy cohort. Though no difference, the incidence of pulmonary infection in the haplo-PTCy cohort was lower than that in the haplo-control cohort, 40.1% vs 60.0%.

研究中存在一些局限性。第一，样本规模小，跟踪时间短，是一个薄弱环节.因此，有必要进行大样本的前瞻性研究。此外，还需要进一步的研究来评价小剂量PTCy和UC-MSCs在预防和减轻GVHD、促进植入和改善预后方面的临床作用。尽管有这些限制，该协议并没有增加高发病率的aGVHD和cGVHD由于PBSCs而不损害MSD-HSCT和haplo-HSCT的疗效，也减少了捐献者的困难。结论：SAA患者接受小剂量PTCy及PBSCs与UC-MSCs联合移植是可行的。