以辛尼丁为基础的水凝胶对人皮肤损伤表现出抗炎和蛋白酶抑制作用

二盐酸奥替尼丁(OCT)是一种广泛应用的抗菌分子，在促进皮肤创伤愈合的同时，也改善了手术后瘢痕的质量。然而，OCT促进组织再生的机制尚不完全清楚。在本研究中，我们采用了一种体外皮肤剥离的浅表伤口模型。分别用液相色谱-质谱(LC-MS)法和酶联免疫吸附法(ELISA)分析含OCT水凝胶和释放的分泌体处理的创伤皮肤活组织的蛋白质谱。对OCT处理的皮肤创伤的蛋白质组学分析显示，与对照组相比，创伤后组织重塑和再上皮化的关键因子如促炎细胞因子(IL-8，IL-6)和基质金属蛋白酶(MMP 1，MMP 2，MMP 3，MMP 9)水平明显降低。此外，在OCT处理的样品中，几种释放到培养上清液中的MMPs酶活性明显降低。我们的数据提供了关于OCT积极影响伤口愈合的作用模式的见解，并确定了OCT的抗炎和蛋白酶抑制活性。

人体皮肤具有多种重要功能，如作为屏障保护人体免受物理化学攻击、病原体入侵和过度失水等。皮肤是环境的主要免疫屏障，有多种免疫细胞参与天然免疫和适应性免疫反应。1,2。由于皮肤经常受到潜在的伤害，伤口愈合是所有高等生物体生存的基本过程。急性伤口愈合代表了伤口愈合的生理模式，包括炎症、凝血、细胞增殖和细胞外基质(ECM)重塑。3,4。相比之下，慢性伤口并没有遵循这样一个明确的级联，而是被困在炎症状态。5。此外，这种持续的局部炎症导致过度的伤口愈合，导致瘢痕疙瘩或增生性瘢痕的形成。促炎细胞因子在伤口愈合的第一阶段起着重要作用.白细胞介素(IL)-6增强炎症反应，诱导血管内皮生长因子(VEGF)和白细胞介素-8(IL-8)进行组织修复。6。此外，IL-6对T细胞和B细胞有刺激作用，有利于从急性炎症向慢性炎症过渡。7。在重塑阶段，各种蛋白水解酶，如基质金属蛋白酶(MMPs)，都是活性的。它们能够降解ECM，从而在伤口愈合和组织新形态发生中发挥重要作用。MMP活性主要通过组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)调节。8。在经常出现延迟愈合的慢性伤口或伤口中，观察到TIMPs和MMPs之间的不平衡。9,10。MMPs活性的提高可能导致ECM降解增加，细胞因子的改变和生长因子的降解，最终导致延迟或缺席的伤口愈合。11.

二盐酸奥替尼定(Oct)是一种广泛应用的抗菌、抗真菌和部分抗病毒的抗菌分子。12,13。由于oct活性的pH范围很宽，因此非常适合用于伤口护理。14。此外，OCT还具有清除慢性创面细菌生物膜的能力。15。最近的研究显示，OCT在促进皮肤伤口愈合的同时，也改善了手术后的疤痕质量。16。进一步研究表明，OCT局部应用于表面损伤的离体人体皮肤，既不改变皮肤细胞结构，也不促进细胞凋亡。此外，oct还能阻止表皮Langerhans细胞的迁移，并抑制多种细胞因子(IL-8、IL-33、IL-10)的分泌，提示其具有抗炎作用。17.

虽然动物模型具有代表整个有机体的优势，但它们在解剖和生理上有很大的差异，因此与人类系统的比较往往很困难。18。尤其是伤口愈合显示出啮齿动物和人类之间的主要区别，强调了替代伤口愈合模式的必要性。离体人体皮肤模型具有很高的相关性，因为它们提供的实验室模型在生物复杂性和对人体生理的保真度方面可能最接近于体内环境。尽管我们意识到使用离体人体皮肤模型有一些局限性(例如依赖生物材料，由于供体多变性在标准化方面的局限性，缺乏生物化学物质(循环中的补充蛋白)和其他免疫细胞(自然杀伤细胞、中性粒细胞、T细胞)的流入，适应性反应不能被测试，没有神经支配，有限的培养周期)，但它们允许对一个区域的整个皮肤间隔和细胞与细胞间的相互作用进行比较评估。19。此外，体外皮肤模型在伦理上是有利的，因为它们允许在人体组织中进行实验，否则在活的个体中是不可能的。他们是一个简单，快速，成本效益的工具，以减少大规模和昂贵的动物试验.由于欧洲越来越多地限制使用动物来测试化合物的性质，并且符合3Rs(动物模型的减少、细化和替换)，所以体外模型是一个理想的临床前平台。因此，我们采用了最近建立的体外人体创伤模型。17,20以及一种基于蛋白质组学和酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法来确定经OCT治疗的受伤皮肤的蛋白质谱，目的是进一步揭示OCT可能有助于组织再生和改善伤口愈合的未知机制。

道德声明

在整形手术过程中，从匿名健康成年女性供体获得腹部皮肤。这项研究得到维也纳医科大学道德委员会的批准，并按照“赫尔辛基宣言”的原则进行。与会者提供了书面知情同意。

带剥离体人皮肤浅表创面模型的建立

新鲜分离的皮肤(手术后1-2小时)用柯丹福(奥地利Schülke&Mayr GmbH)和剥离带(TS)消毒，基本上如前所述。20。简单地，50种不同的D 102标准自粘片(CuDerm，美国)被相同的操作人员在相同区域的切除皮肤上施加10s(秒)的恒压。随后，用皮部(0.6毫米；Acculan 3Ti；美国埃斯库拉普公司)切割TS皮肤，并进行穿刺活检(∅8毫米；凯欧洲有限公司，德国)是从TS和非TS(NTS)皮肤。有效移除角质层常规苏木精和伊红(H&E)染色证实TS和NTS穿孔活检。

若要定义角质层在TS区域的所有位置上具有可比性，或显示出差异，根据潜在的不均匀施加的压力和供体的变异性，三个供体的腹部皮肤是TS，活检是从TS区域的五个确定的区域进行的(见图)。沙一)。H&E染色显示TS在内区(=2)较外区(=1，3，4，5)更有效(图1，3，4，5)。沙一)。为了尽可能地规范进一步的实验，本研究仅采用了内区的活组织检查。

OCT局部应用及培养条件

在培养前，应用OCT(辛烯素伤口凝胶，0.05%OCT，Schülke&Mayr GmbH，德国)或对照凝胶(无OCT水凝胶，Schülke&Mayr GmbH，德国)局部应用于TS皮肤活检(50微升/活组织)。未经治疗和治疗的TS皮肤活组织在Dulbecco改良鹰培养基(DMEM；500升/井；吉布科，美国热裂变器)存在下，在12孔培养板中培养，添加10%胎牛血清(FBS；吉布科，热裂变剂)和1%青霉素-链霉素(吉布co，热裂变剂)在37°C和5%CO条件下培养48h。2(Heracell 150i；热裂变，美国)。第2天，取活组织标本和培养上清液分别保存在−80℃，进行液相色谱-质谱(LC-MS)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。

皮肤隔间的分离

在某些实验中，处理和未处理的TS皮肤活组织切片在培养48小时后在PBS中清洗。为了将表皮与真皮分离开来，在4°C下用1.2U/ml DispaseⅡ(Roche诊断公司)对样品进行酶学处理。第二天，用钳子从真皮上剥去表皮。分离后的隔间立即冷冻在液氮中，不固定，保存在−80°C上进行LC-MS分析。

H&E染色

固定(7.5%多聚甲醛)TS和未经处理的皮肤标本用石蜡包埋(奥地利Sanova制药有限公司)，切割(5μm)用微电脑(微米HM335E；GMI，美国)，并按照标准化协议用H&E溶液染色。

全TS皮肤活检标本制备及LC-MS猎枪分析

用OCT、对照凝胶和未处理的培养TS组织(女性38~45岁，年龄38~45岁，n=5)，在10 0μl(7.5摩尔(M)尿素，1.5M硫脲，0.1M二硫苏糖醇，4%μ0.0 5%十二烷基硫酸钠)缓冲液中进行超声匀浆。蛋白质浓度用Bradford法预先测定。对于每一个样本，20微克蛋白质被用于根据不同的变化进行的溶液中的消化。21FASP协议的22。干燥的样品如先前所述被重新组合23,24含4种合成标准肽的5μm~(-1)甲酸(FA)，用40μm~(-1)流动相A(97.9%H)稀释。2O，2%ACN，0.1%FA)。在此溶液中，5μl被注入Dionex终极3000纳米高效液相色谱(HPLC)系统(Thermo Fisher Science)。用流动相A(流动相A)在柱前(2cm×75mC18 Pepmap100；Thermo Fisher Science)上浓缩多肽，流动相A为流动相A，用流动相B(80%ACN，20%H)洗脱到分析柱(50 cm×75 m Pepmap100；Thermo Fisher Science)，流速为300 nL/min，梯度为8%~40%流动相B(80%ACN，20%H)。2O，0.1%FA)，样品分析超过190 min。MS分析是在QExactive经典轨道饶舌质谱仪上进行的，该质谱仪配有纳米祈祷离子源(Thermo Fisher Science)，并与纳米高效液相色谱法(HPLC)联用。对于检测，MS扫描在m/z 400-1400范围内进行，分辨率为70.000(m/z=200)。MS/MS扫描选择前8位方法。在标准碰撞能量为30%的条件下，在轨道上以17.500的分辨率(m/z=2 0 0)对HCD碎片进行了分析。

全TS皮肤活检的LC-MS数据分析与解释

对LC-MS数据的分析和解释基本上按所述方式进行。21使用开放源码软件MaxQuant(版本1.6.3.4)25,26包括仙女座搜索引擎和英仙座统计分析软件包25,26。在SwissProt数据库中实现了对智人的蛋白质推理，将定义的参数(质量耐受、缺失切割、固定/可变修改、最小肽识别)设置为21。无标签定量(Lfq)显示每种蛋白质的值，这些数值是用Perseus统计分析软件包对蛋白质调节进行定量评估的。27。三个处理间差异表达的蛋白质通过Perseus进行评估，用每组蛋白质的LFQ值进行未配对t检验。含a的蛋白质p-值低于0.05，差低于−1或大于+1，对应于日志2折叠变化至少2，被认为是重要的命中，并作了进一步的分析。利用uniprot数据库确定蛋白质功能28以及用于基因本体注释的david生物信息学资源。29,30 .

表皮和真皮隔间的样品制备及LC-MS分析

采用OCT、对照凝胶和未处理的方法，将培养的TS组织(女性、腹部、年龄36~45岁，n=3)分别酶切成真皮和表皮，用超声分别在100μl裂解缓冲液(8M尿素，50 mm Teab，5%SDS)中分别进行匀浆。对于酶消化，采用了一种使用S-陷阱技术的方法。31。总之，用64 mM的DTT和48 mM的IAA分别还原和烷基化了20μg的增溶蛋白量。加入捕集缓冲液(90%vol/vol甲醇，0.1M三乙基碳酸氢铵)后，将样品装入S阱柱上，用胰蛋白酶/Lys-C混合液在47°C下彻底洗涤，消化1h。肽经洗脱、干燥后在−20°C保存至LC-MS分析.干燥样品在含4种合成标准肽的30%FA的5%中进行重组，用40μl的负载溶剂(97.9%H)稀释。2O，2%ACN，0.05%三氟乙酸)。在此溶液中，5μl被注射到Dionex终极3000纳米高效液相色谱系统(ThermoFisher Science)中。用流动相A(97.9%H)在柱前(2cm×75mPepmap100；Thermo Fisher Science)上浓缩多肽，流速为10μl/min。2O，2%ACN，0.1%FA)。然后由预柱洗脱至分析柱(50 cm×75 m Pepmap100；Thermo Fisher Science)，流速400 nL/min，流动相B(80%acn，20%H)梯度8%~40%。2O，0.1%FA)超过95分钟，导致包括洗涤和平衡步骤在内的总LC运行时间为135分钟。质谱分析采用配有1600 V的捕集喷雾离子源的TimesTOFPro质谱仪(Bruker)，并以并行累加-串联破碎(PASEF)模式工作。1/k0扫描范围为0.60~1.60V，实现了囚禁离子迁移率分离。.S/cm2坡道时间为166 ms。每周期10次PASEF MS/MS扫描，总循环时间为1.88s，用扫描范围(m/z)从100~1700记录ms和MS/MS光谱。此外，碰撞能随离子迁移率从20 eV增加到52 eV而增加，当m/z<700时，四极隔离宽度设为2Th，m/z>700时为3Th。

LC-MS数据分析和解释表皮和真皮隔间

对于离子迁移质谱(IMMS)数据，软件管道框架管道(13.0版)采用搜索算法MSFragger(3.0版)32结合IonQuant(1.3.0版)进行肽和蛋白质鉴定统计。MS1和MS2的容忍度分别为50 ppm和20 ppm。一个漏掉的卵裂是允许的。固定/可变修饰和肽识别设置如上所述。对于蛋白质的定量，选择了MaxLFQ法和离子定量法。“运行间匹配”(Mbr)参数设置为保留时间窗口1分钟，离子迁移率窗口为0.05 1/k。0。在离子、肽和蛋白质水平上，MBR错误发现率为0.01。结果的统计分析是用Perseus统计分析软件包(1.6.14.0版)进行的，如前所述。含a的蛋白质p-值低于0.01，差低于−1或大于+1，对应于日志2折叠变化至少2，被认为是重要的命中，并作了进一步的分析。利用UniProt数据库和David生物信息学资源进行基因本体注释，确定蛋白质功能。

数据可用性

MS蛋白质组学数据已通过“骄傲”存入ProteomeXChangConsortium33具有DataSet标识符PXD 007592和Https://doi.org/10.6019/pxd007592.

ELISA法

培养板(NUNC免疫96孔平底培养板；Merck KGaA)在4℃或室温下，在4℃或室温下，隔夜涂布适当的捕获人抗体，如IL-8(Thermo Fisher Science，#M 108)、IL-6、MMPs或TIMP-1(R&D系统)。第二天，用洗涤缓冲液(PBS中为0.05%吐温)和封闭缓冲液(4%BSA，0.5%吐温在PBS中)或试剂稀释剂(1%BSA在PBS中)对平板进行清洗。另一个洗涤步骤，标准和样品以适当的稀释在盘子上，并在室温下孵育2h。在此基础上，提取平板，分别应用检测抗体(Thermo Fisher Science，#M802B；R&D系统)，室温下再孵育2h。接着，再清洗盘子，并应用链霉亲和素-马萝卜过氧化物酶(ThermoFisher Science#34028，R&D系统).培养20~30 min后，再用3，3‘，5，5’-四甲基联苯胺底物试剂A+B(BD生物科学，美国)孵育20 min。随后，停止解(2NH)2所以4加入50μl/孔，用光度计在450 nm处立即测量荧光(Multiskan FC微板光度计；美国热荧光仪)。

酶活性测定

用美国AATBioquest通用荧光法测定培养上清液中基质金属蛋白酶(mmp1/2/3/7/8/9/10/12/13)的活性。上清液用4-氨基苯基乙酸汞(2mm)隔夜活化。将活化的上清液和对照组分别加入100 L/孔、96孔白色聚苯乙烯微板、Merck KGaA和MMP绿色底物(50μl/孔，AAT Bioquest)。用平板阅读器(BMG FLUOstar Optima Microplate Reader；BMG LabTech Inc.)在Ex/Em=490/525 nm处监测荧光强度。

统计分析

酶联免疫吸附试验(ELISA)数据和酶活性测定结果用GraphPad Prism 5进行分析，用未配对t检验进行比较。这些结果被认为是有意义的。p-数值小于0.05。有关LC-MS分析和解释的统计评估的详细信息可在各自的方法章节中找到。

与对照组相比，经OCT处理的人皮肤有明显的蛋白质组学特征。

为了揭示创伤和OCT处理后人皮肤细胞的蛋白质谱，我们选择了一种蛋白质组学方法.5例供体的腹部TS皮活检用OCT、对照凝胶或未处理，培养48h，用MaxQuant和Perseus软件包进行统计分析，共发现2622种蛋白质(FDR<0.01)。26种蛋白质在OCT和对照凝胶处理样品之间存在差异调节(FDR<0.05)。1A，表沙一)和37个蛋白质在OCT处理和未处理样品之间有差异调节(图1)。1B，表S2)。10种蛋白质在OCT处理和未处理样品之间以及在OCT处理和对照处理样本之间存在差异调节(图1)。1A、B)。另外，16种蛋白质在未处理组和对照组之间有差异调节，说明水凝胶已经在伤口上应用对皮肤细胞的蛋白质剖面有影响(表)。S3)。在这些蛋白质中，三种蛋白在OCT处理的样品和未处理的样品之间也有不同的调节，而在OCT处理的样品和对照凝胶处理的样品之间也有两种蛋白质的差异调节。S2)。值得注意的是，在OCT处理和对照凝胶处理以及OCT处理和未处理样品之间进行差异调节的10种蛋白质中，没有一种属于未处理和对照凝胶处理组之间差异调节的16种蛋白质，因此OCT确实对各自的蛋白质具有调节作用。在重要的命中，几个蛋白质参与免疫反应，以及伤口愈合和组织再生(表)。沙一和S2).

OCT调节与伤口愈合和免疫反应相关的生物过程。

利用David生物信息学资源对OCT处理的皮肤差异调节蛋白进行基因本体(GO)富集分析。29,30。我们发现在OCT处理的TS皮肤中下调的蛋白质与伤口愈合的重要生物学功能有关(图一)。2)。OCT处理的TS皮肤中的血管生成、胶原分解过程、ECM分解和蛋白分解均低于未处理的损伤皮肤(图1)。2)。参与这些功能的蛋白质包括IL-6和MMP家族成员(mmp1，2，3)。正如预期的那样，与炎症免疫反应相关的蛋白质，如特定的防御机制，在十月处理的受伤皮肤样本中也被下调(图一)。2)。据Go说，IL-6是这些功能的重要代表。这些数据表明，OCT可以减少损伤皮肤中的炎症免疫反应和过多的胶原和ECM沉积。OCT治疗后TS皮肤活检中白细胞迁移增加(图1)。2)，说明OCT不仅具有抑制能力。用String软件检测OCT处理的皮肤损伤标本中下调的蛋白质之间的功能联系34。分析显示MMP家族成员(mmp1，2，3)和IL-6(图6)之间有很强的功能交互作用。S3)、整合和扩展研究，证明IL-6对组织基质金属蛋白酶有调节作用。35,36.

OCT显著降低人皮肤损伤后促炎细胞因子的分泌

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对OCT处理的TS皮肤标本和对照组的差异调节蛋白候选蛋白进行了定量评价。除了IL-8(图1)。S4)17,IL-6是已知的另一种促炎细胞因子，在急性炎症中起着关键作用，是及时解决皮肤伤口愈合的关键。37。IL-6信号调节失调会导致纤维化或无法治愈。我们的LC-MS数据符合这一概念，因为我们发现，与未经治疗或对照凝胶治疗的TS皮肤活检相比，10月份治疗的IL-6明显减少(见图)。3)。对同一供体培养上清液的分析证实了这些数据显示，与对照组相比，经OCT处理的皮肤样本中IL-6浓度显著降低，支持并扩展了我们先前的结论，即OCT具有抗炎能力(图1)。3).

OCT下调创伤皮肤蛋白酶释放的研究

基质金属蛋白酶及其抑制剂通过调节ECM的降解和沉积，使组织重塑和细胞迁移，在伤口愈合的各个阶段发挥着至关重要的作用。38。我们发现，与对照组相比，OCT治疗的TS皮肤活检组织和分泌细胞中mmp1和MMP 2蛋白水平明显降低(图2)。4a)。Mmp3的表达和分泌水平仅在OCT处理的创伤皮肤中明显低于未处理的标本(图1)。4a)。值得注意的是，OCT治疗对TS人皮肤没有影响TIMP-1的表达和分泌(图一)。4a)。重要的是，OCT处理的5名供者TS活检上清液的总MMP活性明显低于对照组的上清(图1)。4b)。

OCT主要活跃在真皮室。

由于基质金属蛋白酶和炎性细胞因子是由多种细胞类型产生和分泌的。24接下来，我们研究了蛋白酶抑制和抗炎作用是否优先发生在表皮或真皮。为解决这一问题，采用OCT、对照凝胶或未处理的TS皮肤活组织切片，分别用OCT、对照凝胶或未处理48h，用离子迁移气相分离技术对真皮和真皮间隔进行了物理分离分析。统计分析显示，与对照组相比，OCT处理的TS皮肤组织中的蛋白质表达量明显高于未处理样品。在两组中，真皮(OCT/Ctrl：173；OCT/Untr：38)的蛋白质表达量明显高于表皮(OCT/Ctrl：73；OCT/Untr：34)(图)。5)。值得注意的是，与对照凝胶处理的TS皮肤相比，OCT处理的TS皮肤与对照凝胶处理的TS皮肤之间的差异明显更大(如图所示)。5)。只有少数蛋白质在对照凝胶处理和未处理的样品之间，在表皮(2)和真皮(6)中有不同的调节(表)。S8)。利用UniProt数据库和David生物信息学资源确定蛋白质功能。再一次，在重要的命中，几个蛋白质参与免疫反应以及伤口愈合(图一)。6)。在表皮(如图所示)。6(A)我们发现，与未处理的样本相比，OCT处理的样本中参与防御机制的蛋白质表达下调，与整个TS皮肤活检分析的结果一致(图1)。2)。真皮。6(B)与对照组相比，OCT处理的创面愈合相关功能降低。其中还发现，在整个TS皮肤活检的GO注释结果(胶原分解过程，ECM拆卸，蛋白水解)(图)。2)，主要与MMP家族成员有关。所有蛋白质的功能在oct处理后，在表皮和真皮中都有明显的上调或下调，使用uniprot数据库(表)。S4, S5, S6, S7)。类似于表中的数据沙一和S2，mmp1和MMP 2差异显著(表)S6)OCT处理与对照凝胶处理的TS真皮样品之间。此外，与对照组相比，经OCT处理的TS样本MMP 9明显下调(表)。S6).

在临床实践中，oct被证明能促进慢性伤口的愈合。39,40,41减少腹壁成形术后增生性瘢痕的形成16。然而，OCT促进组织再生和改善伤口愈合的机制尚未得到更详细的研究。我们采用了一种温和的活体人体伤口模型来解决这一问题，并在一个实验装置内根据性别和供体年龄范围进行标准化，使用来自不同体位的皮肤，确定皮肤活检中最佳的TS区域，并评估最佳皮肤厚度以供后续分析。

在2622个鉴定的蛋白质中，用LC-MS对创伤和OCT处理的TS皮肤活检和对照的蛋白质谱进行了详细的描述，其中26和37分别在OCT和对照凝胶处理的样品以及OCT处理的和未处理的样本之间进行了差异调节。GO注释揭示了在OCT处理的皮肤中被发现下调的蛋白质之间的几个参与伤口愈合的生物学过程，包括ECM分解、胶原分解过程、蛋白质分解以及血管生成。根据David生物信息学资源，与上述过程相关的蛋白质包括IL-6和MMP家族成员。IL-6在免疫应激反应的急性期反应中起着关键作用.与成人皮肤相比，胎儿皮肤产生的促炎症细胞因子(IL-6，IL-8)水平较低，可能与未成熟的免疫状态有关，但其再生能力较高。此外，有报道称(1)外源性IL-6可导致人胚胎移植皮肤瘢痕的形成。42(2)在缓慢愈合的人烧伤创面中，IL-8水平显著升高；(3)IL-8在体外降低角质形成细胞分化。43(4)瘢痕疙瘩成纤维细胞的IL-8水平较正常人成纤维细胞增高。44。这可能支持IL-6和IL-8在病理性瘢痕形成中的作用。我们在这项研究中的数据显示，与对照组相比，经10月份治疗的活检组织中IL-6水平明显降低，扩大了我们先前报道的关于其抗炎能力的发现。17。在OCT治疗的TS皮肤活检中抑制IL-6和IL-8是OCT在体内促进创面愈合和防止增生性瘢痕形成的可能原因之一。基质金属蛋白酶是其他的候选物质，因为它们能够溶解基底膜和周围组织的溶解，从而促进整个急性伤口愈合过程中的增殖和细胞迁移。MMP水平失调可能导致ECM降解增加，细胞因子谱改变，生长因子降解，最终导致延迟的伤口愈合。11。与这一假设相一致的是，与来自同一患者的正常组织相比，不同类型的人瘢痕组织中MMP 2的mRNA表达显著增加。9。我们的数据显示，与对照组相比，OCT处理的人皮肤中mmp1和MMP 2水平明显降低。根据这一观察，我们注意到与未经治疗的TS活检相比，OCT治疗的TS活检组织的MMP3显著减少，但对照凝胶处理的TS活检组织则没有，这表明水凝胶在伤口上的应用已经导致MMP3分泌减少。我们进一步发现，与对照组相比，经OCT处理的样品MMP活性显著降低，表明OCT确实对蛋白酶抑制剂有调节作用。皮肤成纤维细胞除了分泌多种趋化因子、基质金属蛋白酶和蛋白酶抑制剂外，还能分泌IL-6和IL-8。45。真皮富含成纤维细胞，提示这些细胞可能是OCT治疗后最相关的细胞类型。OCT抑制组织基质金属蛋白酶(MMPs)的释放，可能是OCT在体内预防和促进创面愈合的病理机制之一。TIMP-1是主要的MMP抑制剂之一，通常在慢性或缓慢愈合的伤口中明显下调。10。由于OCT对TIMP-1没有调节，LC-MS和ELISA分析表明，OCT抑制TIMP-1的确切机制尚不清楚，有待进一步研究。

为探讨OCT局部应用于TS人皮肤时对皮肤间隔的影响，不仅对表皮和真皮进行了单独分析，而且采用了一种更为敏感的方法。在OCT处理的TS表皮组织中发现差异调节的蛋白质较少，而OCT介导的蛋白调节主要发生在真皮。与我们的研究结果相一致的是，与对照凝胶处理的真皮TS活检相比，OCT显著降低了mmp1和MMP 2。在经OCT处理的TS真皮样品中MMP 9显著降低的发现进一步支持了我们先前的发现，即OCT具有抑制蛋白酶的能力。

今天，湿润伤口愈合已被广泛接受为最先进的专业伤口护理.水凝胶的水分含量高，主要通过支持潮湿的伤口环境和促进自溶清创来促进皮肤愈合。46。我们在这里的所有实验表明，水凝胶与防腐剂OCT的结合提供了额外的免疫调节特性相比，应用非常相同的水凝胶没有任何生物活性。用含有OCT的水凝胶处理TS皮肤样品，观察到的局部抗炎环境可以与凝胶中的防腐剂本身的存在完美地联系在一起，而不仅仅是单纯的湿润伤口愈合的结果。

最后，我们的数据提供了关于OCT在临床环境下促进伤口愈合的作用模式的新见解，因为我们报告了OCT在受伤的人类皮肤中的抗炎和蛋白酶抑制活性(见图)。7)并确定真皮蛋白质组为其主要靶点。