靶向泛素信号在肿瘤免疫治疗中的应用

癌症免疫治疗在治疗各种晚期恶性肿瘤方面取得了巨大的成功，已成为一种有吸引力的癌症治疗方法。免疫检查点抑制剂的开发和临床应用是肿瘤免疫治疗中最杰出的成就之一。此外，在了解抗肿瘤免疫的机制和为开发新的治疗方法确定新的靶点方面，正在取得相当大的进展。一个活跃的研究领域是蛋白质泛素化，这是一种蛋白质修饰的翻译后机制，调节多种免疫细胞在抗肿瘤免疫中的作用。越来越多的研究表明，E3泛素连接酶和去泛素酶是增强肿瘤免疫治疗中抗肿瘤免疫的潜在靶点。

靶向治疗和免疫治疗是两种先进的癌症治疗策略。1靶向治疗的策略是建立在肿瘤生长和存活的细胞自主机制的基础上，直接以肿瘤细胞为靶点。虽然这些方法在大多数携带特定基因突变的癌症患者中产生临床反应，但由于肿瘤细胞获得耐药性，这些方法往往缺乏持久性。1免疫治疗不是直接针对肿瘤细胞，而是通过动员患者自身的免疫系统来攻击肿瘤。免疫治疗的一个主要优点是除了相对较小的副作用外，还可能产生长期的抗肿瘤作用。2特别是基于免疫检查点抑制剂(ICIS)、针对T细胞共抑制受体细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA 4)和程序性细胞死亡蛋白1(PD1)的单克隆抗体的治疗，使癌症治疗发生了革命性的变化。2然而，由于许多类型的癌症对单一ICI治疗的反应率仍然很低，人们正在作出广泛的努力来开发联合策略并确定新的治疗靶点，例如T细胞的共刺激受体。此外，靶向细胞内信号分子为提高抗肿瘤免疫提供了额外的机会。

泛素化已经成为一种公认的信号机制，调节免疫系统功能的各个方面。泛素化是涉及蛋白质降解、受体内吞、DNA修复、基因转录、激酶激活、蛋白-蛋白质相互作用和信号复合物组装等多种生物过程的翻译后机制。3泛素化涉及到单核苷酸或多聚泛素链与靶蛋白赖氨酸(K)的共价结合，由泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)的顺序作用催化。4聚泛素链的形成涉及到泛素分子通过不同的K残基或N-末端蛋氨酸(M1)残基连接在一起，从而形成多种功能不同的泛素链。5例如，K48连接的泛素链以蛋白酶体为目标蛋白进行降解，而K63连接的泛素链和M1连接的泛素链(也称为线性)最著名的是介导蛋白质与蛋白质的相互作用和信号转导中的酶激活。泛素化的过程是由泛素酶(DUBS)来抵消的，DUBS是一个大的蛋白酶家族，能切割泛素链。3哺乳动物细胞表达600多个E3连接酶和约100个配体，显示底物的特异性，调节特定的细胞功能。3,5越来越多的E3s和Dubs被认为是免疫应答的重要调节因子，为开发新的肿瘤免疫治疗药物提供了令人兴奋的机会。在这篇综述中，我们将讨论泛素化在调节免疫细胞功能中的作用及其在癌症免疫中的潜在作用。

树突状细胞(Dendriticcells，DC)是介导T细胞活化的专业抗原提呈细胞，在机体对感染和癌症的免疫应答中发挥着重要作用。6在肿瘤微环境中，DC吸收死亡肿瘤细胞释放的抗原并迁移到引流淋巴结，DC将肿瘤抗原呈递到肿瘤特异性T细胞的TCR中，触发T细胞的活化和分化，产生效应T细胞向肿瘤传递，介导肿瘤细胞的破坏。7在不同的DC亚群中，传统的DC(CDCs)在T细胞活化抗原提呈方面具有特异性，CDCs可进一步分为以CD8α和CD11b表达为特征的1型CDC(CDC 1)和2型CDC(CDC 2)。8CDC 1亚群在将肿瘤抗原呈递给CD8 T细胞以介导抗肿瘤免疫方面特别有效。了解调节DC功能的机制对于合理设计癌症疫苗和其他治疗药物以提高肿瘤免疫治疗的疗效至关重要。6,9

抗原的加工和表达是DC功能的重要组成部分，包括内源性蛋白质的加工和外源蛋白内化为小肽，以及主要组织相容性复合体(MHC)分子对肽抗原的表达。10MHCⅠ类(MHC I)通常是通过内源性合成的胞浆蛋白的蛋白酶体降解而产生的肽。然而，在专业的APC，特别是DC中，MHC I也可以通过一个称为交叉表达的过程从内化外源蛋白中表达肽，这对于CD8 T细胞对感染和肿瘤的反应至关重要。11,12在这个过程中，外源蛋白要么从内小体囊泡转移到胞浆中进行蛋白酶体处理，要么直接在内胚层内加工。MHCⅡ(MHCⅡ)是由胞外蛋白溶酶体降解产生的多肽。10MHCⅠ和II的抗原分别被CD8和CD4 T细胞的TCR所识别。作为对感染或肿瘤发生的反应，DC经历了一个成熟的过程，包括共刺激分子和趋化因子受体的上调，这是它们迁移到引流的淋巴器官并在T细胞启动中发挥作用所必需的。10泛素化在调节DC抗原加工和成熟过程中发挥着重要作用，为DC在肿瘤免疫治疗中的操作提供了新的机遇。

泛素化参与MHC I限制性抗原处理的初步发现是，病毒蛋白与泛素的融合增强了CD8 T细胞的抗原呈递能力。13一个更直接的证据来自一项研究，该研究使用了泛素结合中温度敏感缺陷的细胞。14同样，在哺乳动物细胞中缺乏所有赖氨酸残基的显性阴性泛素突变体的过度表达也废除了泛素化，并有效地抑制了内质网(ER)靶向蛋白的MHC I限制性加工。15越来越多的证据表明，MHC I限制的外源蛋白交叉表达过程涉及ER相关降解(ERAD)，16,17,18,19一种介导错误折叠蛋白从ER倒置回细胞质以进行蛋白酶体降解的机制。20Erad还介导参与抗原交叉表达的细胞外蛋白的处理.19因此，促进ER进入蛋白质抗原的途径，如Grp 170伴侣疫苗佐剂系统，提高了交叉呈现和诱导CD8 T细胞应答在癌症免疫治疗中的效率。19,21

泛素化在ERAD依赖的蛋白质加工中具有重要作用.人们认为ERAD底物的泛素化促进了ERAD分子机制的结合，而ERAD分子机制是将ERAD底物转位到细胞质所必需的。22ERAD过程中一种主要的E3泛素连接酶是ER-驻留跨膜蛋白Hrd 1，它与SEL1L、Herp、Derlin-1、OS-9或XTP 3、Bip等多种伴蛋白形成复合物，介导ERAD底物的泛素化。15,22Hrd 1在ERAD中的E3作用被USP 25抵消，USP 25解聚特定ERAD底物中的泛素链，以防止其反转易位和蛋白酶体降解。23,24另一个调节Hrd 1的机制是通过泛素依赖的蛋白酶体降解来控制其稳态水平，这一过程受到USP 19的保护。25虽然Hrd 1参与了ERAD和MHC I限制性抗原处理的调控，但最近的一项基因靶向研究表明，Hrd 1在促进CD4 T细胞的MHCⅡ限制性抗原表达方面也发挥着重要作用。26在此功能中，Hrd 1通过一种机制促进MHCⅡ基因的转录表达，该机制涉及B淋巴细胞诱导的成熟蛋白1(BLIMP 1)的泛素依赖性降解，BLIMP 1是已知的抑制MHCⅡ类反式激活物(CIITA)表达的转录抑制剂。26这些研究表明，操纵Hrd 1的表达和ERAD事件可能是改善肿瘤免疫治疗中抗原提呈和T细胞反应的一种方法。

另一个E3泛素连接酶调节ERAD是ER常驻无名指蛋白RNF 5。27RNF 5和E2 UBC 13介导JNK相关膜蛋白(JAMP)的泛素化，JAMP是一种ER膜蛋白，促进ERAD依赖的未折叠蛋白的降解。27,28RNF5介导的JAMP泛素化抑制JAMP与ERAD分子组分的结合，从而限制ERAD介导的蛋白质降解。27因此，与Hrd 1的积极作用不同，RNF5负调控ERAD，尽管RNF5介导的ERAD调节在调节抗原处理和T细胞活化方面是否起作用还有待进一步研究。然而，RNF 5在调节抗肿瘤免疫方面的作用与RNF 5在调节另一种ER-保护过程中的作用有关，即未折叠蛋白反应。29普遍定期审议是一种机制，恢复ER的正常功能，以应对ER应激，并已与免疫和炎症的重要功能联系在一起。30RNF5缺乏症可减轻肠上皮细胞的普遍定期反应，降低肠上皮细胞中抗菌肽的表达，进而改变肠道微生物组成，从而促进DC对T细胞的活化。29因此，缺乏RNF 5的小鼠以微生物依赖的方式表现出更强的抗肿瘤免疫力.RNF 5的另一种免疫调节功能是介导干扰素基因刺激因子泛素依赖的降解，并负调控抗病毒天然免疫应答。31值得注意的是，SING是介导肿瘤微环境中DC激活的一种核心DNA传感元件，在肿瘤免疫治疗中得到了积极的应用。32,33DC中RNF5缺失是否促进DC活化和T细胞启动在抗肿瘤免疫中的作用还有待研究。

泛素化还调节MHC分子的表面表达和循环。早期研究表明，一些病毒编码的蛋白质，如HIV，KSHV，通过诱导细胞内吞和降解而下调表面MHC I。34,35泛素为MHC I掺入多囊体腔内小泡(MVBS)提供了信号，MVBS是晚期内小体与溶酶体融合的一个亚群体。36膜相关的环-CH(三月)E3泛素连接酶的成员已经被证明可以介导内胚体的贩运和免疫受体的降解，包括MHC分子。373月4日和MARCH 9介导MHC I泛素化促进MHCⅡ内吞和溶酶体降解，MARCH 1和MARCH 8介导MHCⅡ泛素依赖性降解。38,39对缺乏MHCⅡ的DC的研究表明，虽然March 1介导的MHCⅡ泛素化不影响MHCⅡ的内吞作用，但它阻止了内化的MHCⅡ/肽复合物的循环，并促进了它们的降解。40,41因此，缺乏mhc 1的DC使细胞表面的MHCⅡ/肽复合物水平急剧升高。有趣的是，脂多糖(LPS)诱导的DC成熟与MHCⅡ泛素化的减弱和March 1表达的下调以及MHCⅡ表面稳定性的增强有关。41,42相反，免疫抑制性细胞因子IL-10诱导MARCH 1的表达，从而下调MHCⅡ的表面表达，从而促进IL-10介导的对抗原呈递的抑制。43,44,45泛素化在MHC调控中的作用也通过对dubs的研究得到证实。泛素C-末端水解酶-L1(UCH-L1)被证明对MHC I循环和抗原交叉表达有积极的调节作用，但目前尚不清楚UCH-L1是否直接去泛素化MHC I。46另一个DUB，USP 14，促进MHC I限制的直接抗原提呈，特别是从有缺陷的核糖体产物(DIPs)中提取的肽。47这些发现表明，针对E3泛素连接酶和Dubs是一种在疫苗开发和其他癌症免疫治疗方法中调节MHC表达和抗原表达的潜在策略。

DCS在外周组织中通常处于不成熟状态，其T细胞启动功能需要以MHCⅡ、CD 80(又称B7-1)和CD 86(又称B7-2)等共刺激分子和趋化因子受体上调为特征的成熟过程。48DC成熟由来自不同免疫受体的信号刺激，包括对病原体相关分子模式(PAMPs)或宿主源性损伤相关分子模式(DAMP)作出反应的模式识别受体(PRRs)。5,48DC暴露于PRR配体还能激活DC分泌细胞因子，调节活化T细胞的分化，产生特定的效应T细胞亚群。DCS和其他天然免疫细胞表达多个PRRs家族，包括Toll样受体(TLRs)、胞浆DNA传感器、RLRs、NOD样受体(NLRs)和C型凝集素受体(CLRs)。49PRR信号通过触发一系列信号事件(包括MAP激酶(MAP激酶)、IKB激酶(IKK)和IKK相关激酶TBK 1)起作用，它们分别介导转录因子AP1、NF-κB和IRF 3的激活。5MAPK和IKK通路在PRR刺激的DC激活和促炎症细胞因子的产生中起关键作用，而TBK 1通路介导I型干扰素(IFNs)的诱导。除了调节抗病毒天然免疫外，Ⅰ型IFNs在诱导DC成熟和抗肿瘤免疫方面具有重要作用。50,51缺乏Ⅰ型干扰素受体1(IFNAR 1)的DCS在体内多I：C刺激的成熟过程中存在缺陷，表现为共刺激分子和MHCⅡ的诱导受损。50另一方面，DC不需要产生Ⅰ型干扰素，因为非造血细胞是I型干扰素的主要来源。50事实上，由于TBK 1在调节IFNAR 1信号转导中的负性作用，DC-条件TBK 1缺乏症促进DC成熟和抗肿瘤T细胞反应。52TBK 1通过磷酸化和促进STAT 3的功能发挥作用，STAT 3是IFNAR 1信号的负调节因子。因此，PRR刺激的信号通路在调节DC的成熟和激活参与抗肿瘤免疫方面发挥着重要的作用。

泛素化调控PRR信号的上游公共信号步骤和下游特定通路。5几种E3泛素连接酶，包括cIAP 1、cIAP 2、Peli1、TRAF 6、TRIM 31和TRIM 56，被证明与各种PRR信号适配体(如RIP 1、RIP 2、TRAF 6、Mavs)结合，从而促进下游激酶的合成和激活。5,53,54,55K63泛素化在调控下游信号事件，尤其是IKK激活方面也具有更为直接的作用。早期的研究表明，IKK的调节亚单位NF-κB的泛素化是DC成熟和激活所必需的。56免疫缺陷外胚层发育不良(EDI)患者的DC在Nemo(C417R)的C-末端锌指结构域存在点突变，在CD 40刺激的Nemo泛素化和NF-κB成员c-rel的激活中存在缺陷，与协同刺激分子的弱诱导和关键的免疫刺激细胞因子IL-12以及T细胞启动功能有关。56A20是一种调节IKK/NF-κB信号和肿瘤坏死因子诱导的细胞死亡的家族成员，57,58已证明对树突状细胞的成熟、促炎细胞因子的产生和免疫刺激功能具有负调节作用。59,60(无花果)1)。小鼠和人DC中的A20基因敲除增强了TLR 3和TLR 4配体对共刺激分子和促炎细胞因子的诱导作用，使DC在启动T细胞反应中异常活跃。1)。与这些研究相一致，基因靶向研究表明A20在DC激活和存活中起着检查点的作用，包括抑制LPS刺激的IKK和MAPK信号通路。61,62A20缺陷的DC在稳态条件下发生自发成熟，其特征是共刺激分子的异常表达。DC-条件A20基因敲除小鼠外周淋巴器官的效应/记忆样T细胞频率增加，提示在稳定条件下自发T细胞活化。61,62除TLR 3外，TLR 3的信号转导依赖于一种常见的信号适配器MyD 88，而TLR 3信号则通过另一种适配蛋白TRIF来传递。5在DC-条件A20基因敲除小鼠中缺失MyD 88并不能阻止DC的自发成熟或T细胞的异常激活，提示A20在稳态条件下抑制MyD 88非依赖性信号来阻止DC的自发成熟和异常T细胞的激活。62然而，MyD 88缺失阻止缺乏A20的DC高分泌细胞因子(包括IL-6和TNF)，从而促进T细胞的增殖。因此，A20抑制DC中依赖MyD 88的信号抑制IL-6和TNF的产生，从而防止T细胞的异常扩增。62A20基因敲除研究表明，DC中A20的下调削弱了其刺激调节性T(Treg)细胞的功能，从而进一步增强了效应T细胞的反应59(无花果)1)。靶向A20的潜在治疗价值已通过小鼠DC基癌症治疗模型得到证实。59当过继转移到荷瘤小鼠体内时，A20沉默的树突状细胞在抑制已建立的肿瘤生长方面比野生型DC强得多，伴随着效应T细胞的浸润增加，增强了对Treg介导的抑制的抵抗力。59(无花果)1)。这些研究表明，A20在T细胞启动和效应功能以及Treg调节中控制DC功能，提示A20靶向是提高肿瘤免疫治疗效果的一种潜在途径，尤其是DC基治疗(图1)。1).

NF-κB信号在DC中的作用在表观遗传学水平上也受到泛素依赖的调控，这一点通过对一个与之相关的亚型TRABID(也称为Zranb 1)的研究证明了这一点。63TLR刺激的两种促炎细胞因子IL-12和IL-23的表达是必需的，而IL-12和IL-23又是CD4效应T细胞产生Th1和Th17亚群的关键。虽然毒性对诱导NF-κB核易位是不可缺少的，但要招募NF-κB成员，特别是c-rel和p50的启动子，则需要TRABID。IL12a, IL12b，和IL23a基因。泛素化作用的目标是在p50和c-rel结合所需的IL 12/IL 23启动子上介导组蛋白修饰的组蛋白甲基化酶Jmjd2d的降解，而泛素依赖性的Jmjd2d降解则被Trabid介导的去泛素化所抵消。63损伤介导的DC调节在自身免疫反应中起着重要作用。由于IL-12家族细胞因子在调节抗肿瘤T细胞和自然杀伤(NK)细胞反应中起着重要的作用，64这是很重要的，以检查是否也发挥作用，以调节抗肿瘤免疫。

T细胞是对抗感染和癌症的适应性免疫反应的核心组成部分。T细胞活化发生在淋巴组织中，这些淋巴组织排出感染或肿瘤的部位，在这些组织中，天真的CD4和CD8 T细胞分别遇到在MHC II和MHC I上显示抗原的APC。在抗原/MHC复合物的作用下，TCR提供了T细胞活化的主要信号。T细胞的激活还需要共刺激信号，在幼稚T细胞中，共刺激信号主要是通过其配体CD 80或CD 86在APC上连接共刺激受体CD 28来介导的。65T细胞还表达TNF受体(TNFR)超家族的共刺激受体，其中许多受体是随着T细胞的激活而诱导的，是T细胞长期应答和效应及记忆T细胞产生所必需的。66此外，细胞因子和生长因子刺激的信号参与T细胞的激活和分化。TCR和共刺激信号被来自多种抑制受体的信号所反对，其中最显著的是PD1家族的共抑制受体成员。67泛素化调节参与T细胞活化和功能的信号事件的不同方面。

在抗原的作用下，TCR启动受体-近端信号事件，包括激活蛋白酪氨酸激酶Lck和磷酸化TCR复合物的CD3和ζ链中的免疫受体酪氨酸基激活基序(ITAMs)。ITAM的磷酸化导致ITAM结合蛋白酪氨酸激酶ZAP 70的合成和激活，ZAP 70通过磷酸化支架蛋白(包括LAT和SLP 76)来增强TCR信号。68这些磷酸化支架蛋白介导针对不同下游信号级联的关键信号元件的合成和激活，导致NFAT、AP1和NF-κB家族转录因子的激活，协同诱导T细胞活化、存活、增殖和分化相关基因的表达。2).

TCR-近端信号事件受泛素化控制，介导TCR信号通路关键成分CD3ζ、ZAP 70、磷脂酶Cγ1(γ1)、PI3激酶(PI3K)和蛋白激酶Cθ的降解或功能失活。5Cbl-b是一种与tcr信号调节有关的功能良好的E3连接酶，它主要作用于PI3K和鸟嘌呤核苷酸交换因子VAV，对维持T细胞耐受性和防止自身免疫至关重要。69,70(无花果)2)。CBL-b缺乏降低了T细胞的激活阈值，使T细胞对TCR刺激的反应过度，即使在CD 28结扎的情况下也是如此，从而导致小鼠自身免疫性疾病的发生。71,72Cbl-b缺乏的CD8 T细胞在排斥移植性和自发性肿瘤方面表现出明显的增强活性.73,74CBL-b缺乏症也使T细胞对Treg细胞和免疫检查点PD-L1的抑制产生抗药性。75,76,77由于Cbl-b缺乏T细胞的活化和抗肿瘤反应增强，Cbl-b已成为临床前研究和临床试验中研究肿瘤免疫机制和肿瘤免疫治疗靶点的研究热点。78,79另一个E3泛素连接酶圣杯(RNF 128)已被证明是负调控T细胞活化和维持T细胞的无能和耐受性。80,81Grail通过靶向CD3ζ抑制TCR近端信号传导，从而抑制CD3ζ的泛素依赖性降解，而圣杯缺乏则能降低T细胞耐受，使小鼠对自身免疫性疾病敏感。82(无花果)2)。在CD8 T细胞中，Grail还介导IL-21受体(IL-21R)的泛素依赖性降解(IL-21R)，而缺乏IL-21R的CD8 T细胞表现出更强的抗肿瘤反应性和功能，包括增强IL-21R的表达和信号传递。83

ZAP 70的非降解泛素化是一种负调控其活化和tcr信号的机制。84,85(无花果)2)。E3泛素连接酶Nrdp 1将K33连接的多泛素链连接到ZAP 70，这有助于合成泛素结合的酪氨酸磷酸酶Sts 1(UBASH3B)和Sts 2(Ubash3a)，84已知的去磷和不活跃的ZAP 70。86Adub，OTUD7B，去泛素化ZAP 70，以防止其与Sts 1和Sts 2的联系，从而积极调节TCR信号。85Nrdp 1缺乏可选择性地促进CD8 T细胞活化和细胞因子的产生。84由于CD8 T细胞在肿瘤免疫中起着重要的作用，因此研究靶向Nrdp 1是否能促进抗肿瘤免疫，并作为肿瘤免疫治疗的一种途径，将是非常重要的。

泛素化还调节参与激活单个下游通路的信号传导步骤。5在这方面，NF-κB信号通路在泛素依赖性调控方面得到了广泛的研究.非降解泛素化，尤其是K63泛素化，正调控TCR刺激IKK及其下游转录因子NF-κB.tcR激活PKCθ，触发中间信号复合物的组装，该复合物由支架蛋白CARMA 1(CARD 11)、适配器Bcl 10和对合酶MALT 1组成；这种所谓的CBM复合物激活一个E3泛素连接酶，它与二聚体E2酶UBC 13/Uev1A共同作用，催化K63连接的多聚泛素链连接到Bcl 10、MALT1以及IKK及其激活激酶TAK 1的组分上。5,87,88连接到Bcl 10和MALT 1的泛素链是促进TAK 1和IKK的招募和激活的平台。5Ikk/nf-κB信号的泛素依赖性激活受到包括CYLD和A20在内的dub的严格调控。89,90,91(无花果)2)。CYLD缺乏症可引起自发性IKK/NF-κB活化，与T细胞异常活化和肠道炎症的发展有关。89T细胞条件性缺失A20可使CD8 T细胞敏感，而A20缺失的CD8 T细胞可增加效应细胞因子的产生，增强抗肿瘤活性。92,93除了控制NF-κB信号外，A20还具有独立的功能，防止肿瘤坏死因子诱导细胞死亡。57

NF-κB信号也受到K48泛素化的负调控.在TCR/CD 28共刺激作用下，E3泛素连接酶Peli1催化NF-κB成员c-rel的K 48泛素化和蛋白酶体降解，从而控制T细胞活化，防止自身免疫。94(无花果)2)。Peli1缺乏的CD4和CD8 T细胞对TCR/CD 28刺激产生IL-2和IFNγ的反应强烈，对Treg细胞和β抑制的敏感性降低。94与野生型对照小鼠相比，Peli1缺陷小鼠具有更强的抑瘤能力，与CD8效应T细胞增强肿瘤浸润有关(未公布数据)。另一种E3连接酶MDM 2通过靶向NFATc 2(NFAT 1)来负调控TCR刺激的NFAT激活，从而促进泛素依赖的降解。95MDM 2缺失或药物抑制促进T细胞NFATc 2的活化和干扰素γ的产生。有趣的是，MDM 2本身也是由活化的T细胞中泛素依赖性降解介导的，这个过程是由MDM 2结合的dub USP 15反调控的。通过去泛素化和稳定mdm 2，usp 15促进mdm 2在NFATc 2调控中的作用。95(无花果)2)。因此，USP 15缺乏症可促进NFATc 2的活化，引起T细胞反应增加，并在抗肿瘤免疫中发挥作用。95其他几个E3泛素连接酶和配体已被证明可以调节TCR信号。5,96

虽然tcr为T细胞的激活提供了主要的抗原特异性信号，但T细胞的初始激活和回忆反应也需要共刺激信号。CD 28是T细胞激活的主要共刺激受体，它增强了TCR信号，降低了T细胞激活的阈值。65CD 28有两种配体CD 80(B7-1)和CD 86(B7-2)，分别在活化的APC，尤其是DC上表达。CD 28和B7是一大类具有共刺激或共抑制功能的结构相关蛋白家族。97CTLA 4和PD1是CD 28家族的成员，作为主要的辅助抑制受体，也被称为免疫检查点。2癌症免疫治疗的主要突破来自于成功治疗晚期癌症患者的ICIS抗CTLA 4和抗PD-1。67最近的研究也为调节这些免疫抑制受体的命运和功能的机制提供了新的见解。尤其是E3泛素连接酶Fbxo 38被报道与PD1相互作用，介导其K48泛素化和随后的蛋白酶体降解。98T细胞条件敲除Fbxo 38可增加T细胞表面PD1的表达，降低抗肿瘤免疫，促进肿瘤的快速生长。98(无花果)2)。另一种E3连接酶c-Cbl与PD1的胞浆尾部相互作用，介导泛素依赖的PD1在肿瘤微环境中的降解。99泛素化和去泛素化还调节了PD1配体1(PD-L1)在肿瘤细胞中的稳定性，这有助于调节T细胞功能和抗肿瘤免疫。100,101

另一个T细胞共刺激/共抑制受体家族包括TNFR超家族成员，其中许多是随着T细胞的激活而诱导的，在调节效应和记忆T细胞反应方面发挥着特别重要的作用。102,103,104TNFR超家族的共刺激受体有OX 40(TNFRSF 4)、4-1BB(CD 137、TNFRSF 9)、GITR(CD 357、TNFRSF 18)、CD 27(TNFRSF 7)和TNFRSF 2(TNFRSF 2)。TNF超家族的配体与这些受体的结合增强了效应T细胞的生成和功能，促进了记忆的发展和记忆反应。大多数(如果不是全部)共刺激受体家族也会触发非典型NF-κB通路的激活，这是效应和记忆T细胞反应所不可或缺的。105这些受体的激动性单克隆抗体，特别是OX 40和4-1BB，可以单独或与其他癌症免疫治疗策略(如免疫检查点阻断、细胞因子治疗和放射治疗)一起促进抗肿瘤T细胞反应。106,107除了广泛的临床前研究外，一些早期癌症免疫治疗的临床试验正在进行，以测试抗OX 40和抗4-1BB在联合治疗中的疗效。106,107

TNFR共刺激受体的信号转导涉及TNFR相关因子(Trafs)的合成，而TNFR相关因子则是NF-κB和MAPK通路激活的靶点。103TRAF介导的信号传递的一个特点是蛋白质泛素化的关键参与，特别是非降解的K63和线性泛素化.108两种功能冗余的E3泛素连接酶cIAP 1和cIAP 2催化TNFR信号复合物中K63泛素化，与线性泛素连接酶LUBAC协同介导NF-κB的激活，防止细胞死亡。57K63泛素化在TNFRs介导T细胞共刺激中的作用在4-1BB通路中得到了很好的证实。与4-1BB激动剂抗体共同刺激T细胞触发4-1BB相关TRAF 2的K63泛素化，这对NF-κB活化和诱导抗肿瘤免疫至关重要。109相反，4-1BB信号被CYLD和A20两种化合物负调控，它们与4-1BB/TRAF 2复合物有物理联系。110CYLD或A20的过表达可抑制4-1BB激动剂抗体对NF-κB的激活，而沉默可增强4-1BB共刺激介导的人CD8 T细胞NF-κB激活。110K63泛素化在4-1BB介导的CD8 T细胞共刺激中的作用进一步得到了进一步的支持，即CD8效应和记忆T细胞表达e3连接酶cIAP 2(CIAP 2)的显性阴性突变体(CIAP 2)。H570A)已减弱4-1BB信号和受损的存活率，证明使用病毒感染模型。111

TNFRs的表达或信号功能也受到降解泛素化的负调控。E3连接酶NEDD 4介导GITR的泛素化和降解，并负调控T细胞介导的抗肿瘤免疫。112Roquin 1(Rc3h1)及其类似物Roquin 2(Rc3h2)、E3泛素连接酶和RNA结合蛋白通过促进其mRNA的降解而抑制OX 40和CD 28家族共刺激受体ICOS的表达。113,114,115Roquins在调节Tfh细胞的分化及自身免疫性和炎症性疾病的发病机制中起着至关重要的作用，但它们是否也在调节抗肿瘤免疫方面的作用尚不清楚。116泛素化也负调控非规范NF-κB通路。CIAP(cIAP 1或cIAP 2)通过催化非规范NF-κB诱导激酶NiK的泛素化和降解作用，对非规范NF-κB通路起负调控作用，与其K63特有的E3功能不同。105CIAP的这一职能还需要TRAF 2和TRAF 3，它们在CIAP-TRAF2-TRAF3复合体的组装和Nik的招聘中起着重要作用。TNFR刺激的非典型NF-κB激活参与了TRAF 3或TRAF 2的泛素依赖性降解。105重要的是，药物抑制cIAP或基因消融TRAF 2或TRAF 3导致非典型NF-κB的本构激活。117CIAP的小分子抑制剂(或SMAC类似物)一直促进T细胞活化和效应功能，增强抗肿瘤免疫。118,119,120这些研究表明CIAP抑制剂是一种新型的联合肿瘤免疫治疗药物。

非典型NF-κB通过T细胞共刺激在CD4 T细胞分化中发挥作用，OX 40共刺激诱导Th9细胞。121Th9细胞形成CD4效应细胞的子集，其特征是产生细胞因子IL-9。虽然Th9细胞因其参与自身免疫和炎症而被广泛研究，但最近的证据表明，它们也是介导抗肿瘤免疫的CD4效应T细胞的主要子集。122,123,124,125OX 40能有效诱导TRAF 6的表达，这是非典型NF-κB活化和Th9细胞生成所必需的。121由于TRAF 6是一种K63特异性E3连接酶，TRAF 6可能通过K 63泛素化来激活CIP，从而介导TRAF 2或TRAF 3的K48多泛素化和降解，从而导致NiK稳定和非规范NF-κB活化。泛素化还通过自噬调节抗肿瘤Th9细胞的分化，这是一种分解代谢机制，可以去除不必要和功能失调的细胞成分。126PU.1是一种重要的转录因子，参与Th9细胞的分化，通过选择性自噬进行K63的泛素化和降解。选择性自噬使用特定的货物适配器，目标蛋白，蛋白质复合物，或细胞器降解。127选择性自噬的一个主要的货物适配器是p62(也称为SQSTM 1)，它针对泛素化的货物进行自噬降解。127P62的沉默或CD4 T细胞主要自噬成分的基因缺失增强了PU.1的表达，促进了不同小鼠肿瘤模型的Th9分化和抗肿瘤免疫。126

除了TCR和共刺激信号外，细胞因子在调节T细胞反应的性质、数量和持续性方面发挥着重要作用。特别是公共伽马链(γ)c或CD 132)细胞因子家族，尤其是IL-2、IL-7、IL-15和IL-21，在提高肿瘤免疫治疗效果方面得到了积极的探索。128这些细胞因子的受体共享γc亚基，形成二聚体或三聚体受体复合物，介导促进T细胞存活、增殖、效应/记忆生成和维持的信号。128,129在γc家族细胞因子中，IL-15是独特的，它需要一种转运机制来激活其受体来刺激信号。130IL-15R受体(IL-15Rα、IL-15Rβ(又称IL-2Rβ或CD 122)和γc)由单核细胞和树突状细胞等支持细胞产生，在细胞表面与IL-15Rα形成复合物，并呈现于靶细胞上的IL-15Rβγ二聚体，特别是CD8 T细胞和NK细胞上，触发信号传递。130IL-15刺激的主要信号事件包括转录因子STAT 5的激活和PI3K/AKT存活通路的激活。131外源性给药IL-15对TCR抗原刺激敏感，促进CD8 T细胞增殖和效应功能，并在肿瘤免疫治疗中挽救耐受的CD8 T细胞。132,133,134重组IL-15，特别是IL-15超激动剂(IL-15/IL-15Rα复合物)，在肿瘤免疫治疗的临床前实验和临床试验中，与其他药物(如ICIS)联合使用，已显示出很好的应用前景。135

泛素化在γc细胞因子刺激的信号转导中的作用研究甚少。然而，最近的一项研究显示，泛素依赖的机制，介导IL-15刺激激活的AKT信号和CD8 T细胞反应的抗肿瘤免疫。136已知AKT的激活是由PI3K介导的，PI3K催化膜磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP 2)转化为磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸(PIP 3)，后者通过上游激酶PDK 1和mTORC2激活AKT到膜室。PI3K/AKT通路整合TCR/CD 28和IL-15R信号，并由Dub Otub 1负调控。2)。IL-15不仅激活PI3K，而且诱导AKT的K63泛素化，泛素化使AKT与PIP 3结合，实现膜的易位和活化。136(无花果)3A)。值得注意的是，AKT的泛素化发生在它的pleckstrin同源(PH)结构域，已知它介导PIP 3的结合。由于不活跃的AKT存在于一个封闭的构象中，它的激酶结构域与PH结构域之间存在分子内相互作用，137泛素化很可能导致AKT构象的改变，导致PIP 3结合PH结构域的暴露(如图所示)。3A)。IL-15刺激的AKT激活受到Otub 1的负调控，Otub 1与AKT相互作用，防止AKT的K63泛素化和膜移位。136有趣的是，在IL-15暴露的细胞中，Otub 1被转移到膜室，这一机制使Otub 1能够抑制IL-15和TCR信号诱导的AKT泛素化和激活(如图1所示)。3B)。Otub 1缺乏可显著增强抗原特异性CD8 T细胞的应答，促进其代谢再编程和抗肿瘤免疫的效应功能。136这些研究表明，IL-15是CD8 T细胞的抗原特异性应答，这是由一个检查点，Otub 1(图1)控制。3B)。Otub 1在肿瘤免疫治疗中的潜在作用是通过释放CD8 T细胞和NK细胞的活性，在荷瘤小鼠体内诱导删除Otub 1，从而大大增强肿瘤排斥反应。136此外，通过对皮肤黑色素瘤数据库的分析，发现Otub 1的表达水平与CD8效应T细胞基因的丰富程度和患者的生存密切相关。136

Treg细胞是CD4 T细胞的一个子集，表达谱系转录因子Foxp 3，具有强大的免疫抑制功能。138大多数Treg细胞是在胸腺(胸腺源性Treg或tTreg)中形成的，但Treg细胞也可以在周围(PTreg)产生，也可以从单纯CD4 T细胞(ITreg)体外诱导。138Treg细胞在维持外周免疫耐受以阻止自身免疫的同时，也是抑制肿瘤微环境中抗肿瘤免疫的主要细胞群。139在临床前的研究中，Treg耗竭已经被证明可以促进抗肿瘤免疫反应，另外的Treg靶向方法已经被积极的探索，以提高癌症免疫治疗的效果。139在了解Treg调节的分子基础方面也取得了迅速的进展，为进一步改进治疗方法提供了见解。泛素化是调节Treg细胞发育和免疫抑制功能的重要机制。5,96

非降解泛素化在调节Treg发育中的作用最初是通过发现缺乏CYLD(一种切割K63和线性泛素链)的小鼠，显著增加胸腺和外周Treg细胞的频率。140,141表达无功能CYLD剪接变异体CYLD(EX7/8)的小鼠也获得了类似的结果。142CYLD的这一功能部分包括抑制泛素依赖的NF-κB信号传导，140它能促进tTreg的发展。143此外，CYLD还调节IL-2R和转化生长因子βR的信号传导，这些信号在Treg的产生中起着至关重要的作用。140,141另一种通过抑制K 63泛素化而控制NF-κB信号转导的化合物A20，也调控胸腺细胞的胸腺发育。144非降解泛素化还调节转录因子在诱导Foxp 3表达中的作用。一个例子是转化生长因子β诱导的早期基因1(TIEG 1)泛素化，TIEG 1是一种参与iTreg细胞发育的Foxp 3反式激活因子。145在Foxp 3基因诱导中，瘙痒介导的TIEG 1单体化似乎促进了TIEG 1的转录活性。

K63泛素化在介导已建立的tTreg细胞的稳定性和免疫抑制功能中起着关键作用。Treg特异性缺失的K63特异性E2泛素结合酶UBC 13损伤Treg细胞的体内免疫抑制功能，引起T细胞活化异常和自身免疫症状。146在淋巴细胞减少和炎症条件下，UBC 13缺失的Treg细胞被致敏以获得Th1和Th17样炎症T细胞表型。UBC 13在Treg细胞中的作用是通过IKK的泛素依赖性激活而实现的，涉及到SOCS 1的诱导，SOCS 1是促炎细胞因子受体信号的关键抑制因子。146TRAF 3是一种潜在的K63泛素连接酶，也参与调节Treg功能。Treg特异性TRAF 3缺失在一定程度上损害了Treg细胞的免疫抑制功能，导致Th1样效应T细胞在稳态条件下的频率增加。TRAF 3对于抗原刺激产生滤泡性Treg细胞也很重要，这是Treg细胞的一个子集，它在生发中心发挥作用，抑制Tfh和B细胞，从而抑制抗体反应。147TRAF 3是ERK MAPK激活所必需的，但这一功能是否与其K63 E3连接酶活性有关尚不清楚。另一个TRAF家族成员TRAF 6在调节Treg功能方面也起着重要的作用。148TRAF 6与Foxp 3连接K63泛素链，介导Foxp 3的正确定位，从而促进其在Treg细胞中的转录功能。148重要的是，Treg-条件TRAF 6基因敲除小鼠显示出更高的抗肿瘤免疫能力，尽管在Treg细胞中缺失UBC 13或TRAF 3是否也能促进抗肿瘤免疫仍有待进一步研究。

除K63泛素化外，线性泛素化还通过非降解机制调节信号转导。149线性泛素化是由线性泛素链组装复合物(LUBAC)催化的，它是由HOIL-1L(又称RBCK 1)、HOIP(又称RNF 31)和Sharpin组成的多亚基E3。一项利用Treg条件RNF 31基因敲除小鼠的研究表明线性泛素化在调节Treg功能中的作用。150Treg特异性缺失RNF 31可导致Treg细胞大量丢失，并发展为严重的自身免疫性和炎症性病理。尽管LUBAC对TNF诱导的细胞凋亡和坏死有明显的预防作用，149RNF 31基因敲除小鼠体内大量丢失的Treg细胞不能被抗体介导的TNF中和所挽救，提示RNF 31介导的Treg维持机制尚未明确。150最近的一项研究表明，RNF 31也是维持人Treg细胞稳定性和功能所必需的。151RNF 31基因敲除的Treg细胞具有Th1样表型，其特征是产生γ。RNF 31与Foxp 3相互作用，稳定Foxp 3，催化多单体化链与Foxp 3结合，表明RNF 31具有非典型的功能。151单链化如何稳定Foxp 3，以及LUBAC介导的线性泛素化如何调节Treg细胞的存活和功能，仍有待研究。

Treg细胞的发育和功能也受到泛素化降解类型的调节。泛素化是调节Treg细胞转录因子Foxp 3稳定性的主要机制。152,153当Treg细胞暴露于促炎细胞因子、TLR 4配体LPS或热休克应激条件下，诱导Foxp 3向E3泛素连接酶Stub 1中募集Foxp 3以进行K 48泛素化反应时，引起Foxp 3的降解。154Stub 1基因敲除使Foxp 3稳定，增强Treg细胞的抑制功能，Stub 1的过度表达则使Treg细胞的体外和体内抑制功能减弱。154Stub 1和Cbl-b还介导胸腺Treg前体细胞中Foxp 3的泛素依赖性降解，从而对tTreg细胞的发育产生负调控作用。155CBL-b缺陷可部分缓解CD 28基因敲除小鼠tTreg发育缺陷.认为在TCR/CD 28刺激下，Stub 1启动Foxp 3泛素化，Foxp 3泛素链通过其泛素结合域(UBA)促进Cbl-b的生成，从而增强Foxp 3泛素化。155与其在tTreg调节中的负性作用相比，Cbl-b似乎对iTreg细胞的发育有积极的调节作用。156CBL-b缺乏通过TCR/CD 28和转化生长因子β信号减弱Foxp 3的诱导作用，使CD4 T细胞产生iTreg细胞。156CBL-b通过促进Foxp 3诱导转录因子Foxo 3a和Foxo 1的激活而促进Foxp 3基因的诱导，Cbl-b的这一功能包括抑制TCR/CD 28-刺激的AKT的激活，AKT是Foxo 3a和Foxo 1的关键负调节因子。156另一种E3连接酶GRAIL在Treg细胞中表达上调，参与调节Treg功能。82,157圣杯缺乏不影响tTreg或iTreg细胞的产生，但损害其抑制功能。82

肿瘤抑制因子vonHippel-Lindau(VHL)是E3泛素连接酶复合物的底物识别亚基，介导缺氧诱导因子(HIFs)的泛素依赖性降解，包括HIF1α和HIF2α。158除缺氧外，还可诱导免疫细胞中HIFs的表达，如细胞因子和TCR信号等。159HIFs在介导传统T细胞的发育、代谢活动和功能方面发挥着重要作用。160特别是HIF1a在抗肿瘤免疫中具有促进CD8 T细胞迁移和效应功能的作用。161,162VHL缺陷可引起CD8 T细胞HIF1a的积累，增强其抗病毒和抗肿瘤免疫的效应作用。161有趣的是，HIF1a在VHL缺乏的Treg细胞中的积累会损害其抑制功能，并导致Treg细胞转化为Th1样炎症T细胞，这与小鼠自身免疫和炎症症状的发展有关。163HIF1a还被证明通过将Foxp 3靶向到VHL E3连接酶复合物来抑制Treg的发育，从而促进泛素依赖的降解。152这些结果提示，靶向VHL可能通过刺激效应T细胞功能和减弱Treg功能而促进抗肿瘤免疫。

与降解泛素化在Treg调节中的作用相一致，反对降解泛素化的化合物被证明可以调节Treg的发育或功能。转化生长因子β诱导的Dub，USP 44从Foxp 3中解聚K 48泛素链，稳定Foxp 3，这对于维持TERG功能是非常重要的。164USP 44与USP 7有物理联系，并在功能上与之合作，164另一个配音已知的去泛素和稳定Foxp 3。165具有Treg特异性USP 44缺陷的小鼠具有较强的抗肿瘤免疫能力，提示USP 44是肿瘤免疫治疗的潜在靶点。164另一个维持Treg稳定和抑制功能所需的配音是USP 21。166小鼠USP 21的Treg特异性缺失降低了Foxp 3的水平，干扰了Treg标志基因的表达，导致T细胞活化异常和自身免疫症状。USP 21缺失的Treg细胞具有Th1样效应T细胞表型，能够产生促炎细胞因子IFNγ。目前还不清楚USP 21是作为Foxp 3的配音还是通过间接机制调节Foxp 3的水平。在人Treg细胞中，USP 21能稳定GATA 3，167一种转录因子，介导Foxp 3的表达，是Treg细胞稳定和抑制功能所必需的。168然而，USP 21在小鼠Treg细胞中的缺失对GATA 3蛋白的稳定性和表达水平没有明显的影响，表明在小鼠系统中存在功能冗余。166

与CD8 T细胞一样，NK细胞作为细胞毒性效应细胞，介导病原体感染细胞和肿瘤细胞的破坏。169NK细胞是一种先天淋巴细胞，通过与TCR无关的机制识别靶细胞，而不受MHC的限制，是对CD8细胞毒性T细胞功能的补充。NK细胞表达一系列的刺激受体和抑制受体，NK细胞是否杀伤靶细胞取决于刺激受体和抑制受体配体在靶细胞上的相对表达水平。NK细胞也是调节细胞，调节树突状细胞功能和促进T细胞反应。170在肿瘤微环境中，NK细胞产生趋化因子CCL 5和XCL 1，这两种趋化因子促进cDC 1向肿瘤部位募集，cDC 1细胞携带肿瘤抗原并与肿瘤特异性CD8 T细胞交叉表达，促进抗肿瘤T细胞应答。171

泛素化在NK细胞调控中起着重要作用。4)。E3泛素连接酶Cbl-b在肿瘤免疫中是NK细胞功能的一个强有力的负调节因子。基因消融Cbl-b或靶向灭活其E3连接酶活性并不影响NK细胞的发育，但使NK细胞对活化反应过度，并能自发排斥转移性肿瘤。172Cbl-b在受体酪氨酸激酶TAM家族(包括Tyro 3、Axl和Mer)通路中具有抑制NK细胞功能的作用。在配体刺激下，Cbl-b使TAM受体泛素化，从而调节TAM受体的内化，但泛素化如何调节TAM功能尚不清楚。172最近的一项研究表明Cbl-b是介导NK细胞抑制的下游因子.173在它们的配体激活后，TAM受体介导酪氨酸磷酸化和cbl-b的激活，而cbl-b则通过介导NK细胞激活受体下游的关键信号适配器LAT 1的降解而抑制NK细胞的活化。173(无花果)4)。这些结果提示，靶向TAM/Cbl-b抑制途径为NK细胞的功能释放和促进抗肿瘤免疫提供了一种新的途径。

与Cbl-b一样，c-Cbl在调节NK细胞活化中起着重要作用.特别是c-cbl对nkg2d和2b4两种刺激受体共同作用后的NK细胞活化具有负调节作用。174(无花果)4)。C-Cbl的这一功能涉及Vav1的泛素化，Vav1是NKG2D和2B4介导NK细胞协同刺激的关键信号因子。C-Cbl介导磷酸化(激活)Vav1的非降解泛素化，抑制Vav1信号功能。174C-Cbl作用的另一个机制是促进其配体MHC I类相关链A(MICA)刺激的NKG2D细胞内吞和降解。175有趣的是，当NK细胞受到NKG2D的另一个配体UL16-bindingprotein 2(ULBP 2)的刺激时，c-Cbl的这种功能就看不到了。MICA促进c-Cbl磷酸化，而不是ULBP 2，提示c-Cbl的配体特异性功能.由于NKG2D具有适配器DAP 10的功能，所以还不清楚c-Cbl是否泛素于NKG2D或DAP 10。175然而，另一项研究表明，DAP 10的泛素化有助于NKG2D在人NK细胞中的内吞和降解。176本研究还提示，虽然DAP 10泛素化可以促进NKG2D细胞内吞和溶酶体降解，但受体内吞作用也是激活ERK信号和NK细胞效应功能所必需的，这表明它具有自相矛盾的作用。176

在其他已知的调节NK细胞功能的E3s中，NK溶解相关分子(NKLAM)是一种无名指蛋白，参与NK细胞的杀伤功能。177,178NKLAM缺乏症不影响NK细胞的发育和成熟，但能抑制NK细胞的细胞毒活性和细胞因子的产生，降低小鼠控制黑色素瘤转移的能力。179NKLAM如何调节NK细胞的细胞毒性尚不清楚。虽然尿苷激酶样-1的泛素化已被证实，但其功能意义尚不清楚。178TRIM 29是一个TRIM 29家族，通过细胞因子IL-12和IL-18诱导NK细胞活化，并负调控NK细胞的活化。180NK细胞特异性缺失TRIM 29可促进NK细胞产生干扰素γ，促进抗病毒免疫。180TRIM 29介导泛素依赖性的TAB 2降解，TAB 2是蛋白激酶TAK 1的调节亚单位，是IL-12和IL-18诱导干扰素γ所必需的。

已经证明有几个二聚体可以调节NK细胞。如上所述，Otub 1是通过控制IL-15R信号和IL-15介导的CD8 T细胞启动来调节CD8 T细胞的动态平衡和抗肿瘤反应。136与IL-15在NK细胞调节中的作用一致，Otub 1对NK细胞的成熟和活化也有重要的调节作用(图一)。4)。利用Creer系统诱导小鼠Otub 1缺失可明显提高成熟NK细胞的表达频率。136细胞因子体外激活后，Otub 1缺陷的NK细胞产生细胞毒性效应分子颗粒酶B和趋化因子CCL 5，后者介导cDC 1的合成。同样，诱导Otub 1消融可显著增强抗肿瘤免疫，其特点是肿瘤浸润性T细胞、NK细胞和cDC 1增多，而Otub 1缺乏的小鼠瘤内cDC 1的增加依赖于NK细胞。136Otub 1通过抑制IL-15刺激的AKT泛素化和活化来调节NK细胞的功能.另一项研究表明，AKT通过促进XBP 1s的去泛素化和稳定而促进颗粒酶B基因的表达，XBP 1s是一种转录因子，与T-bet协同介导颗粒酶B基因的转活化。181这些发现表明Otub 1是一个有趣的靶点，可用于癌症免疫治疗。

另一个叫A20，对于维持NK细胞的生存和稳态至关重要。182NK细胞条件的A20基因敲除小鼠有严重的NK细胞淋巴细胞减少，但脾脏中残留的A20缺乏的NK细胞高度增殖，并表现出较高水平的γ生成。NK-条件A20基因敲除小鼠NK细胞大量丢失的部分原因是A20缺失的NK细胞对TNF刺激的细胞死亡的敏感性增加。此外，A20对NK细胞中mTORC 1的活化具有负调节作用，而mTORC 1活性的升高和TNF敏感性的增强可能是NK-条件A20基因敲除小鼠NK细胞死亡的原因之一。182A20含有一个次级催化结构域和两个泛素结合锌指(Zfs)，新的证据表明泛素结合是介导A20功能的关键机制。57A20的NK调节功能也依赖于其泛素结合ZFs.182鉴于NK细胞在肿瘤免疫中的重要作用，靶向泛素化途径是肿瘤免疫治疗中一种很有吸引力的方法。

巨噬细胞是肿瘤浸润性天然免疫细胞的主要群体，具有调节肿瘤微环境和抗肿瘤免疫的重要作用。183在不同的条件下，巨噬细胞分化为典型的不同状态，广泛分为经典激活(M1)和交替激活(M2)巨噬细胞。而m1巨噬细胞产生多种促炎细胞因子和趋化因子介导炎症反应，而M2巨噬细胞则产生抗炎细胞因子，对消炎和伤口愈合起重要作用。183(无花果)5)。肿瘤相关巨噬细胞通常类似M2巨噬细胞，通过不同的机制抑制抗肿瘤免疫，包括抑制T细胞反应。183这些M2样巨噬细胞也促进肿瘤的进展和对常规治疗和免疫治疗的抵抗，因此成为癌症治疗的重要靶点。针对巨噬细胞的募集、存活、激活和功能的方法已经被积极探索，以改善癌症的免疫治疗。183,184这些治疗努力与在了解巨噬细胞极化和功能的分子机制方面的迅速进展有关。

泛素化在通过PRRs调节巨噬细胞活化中起着至关重要的作用，PRRs对各种PAMPs或阻尼起反应作用。5几种E3泛素连接酶，包括TRAF 6和Peli1，结合K63泛素链所需的信号转导TLRs。如前所述，TLR信号依赖于常见的适配器蛋白。适配器MyD 88传递来自除TLR 3以外的所有TLRs的信号，而另一个常见的适配器TRIF介导来自TLR 3和TLR 4的信号。5TRAF 6作为适配器和E3泛素连接酶，介导来自MyD 88依赖的TLRs的信号转导。5TRAF 6将K63泛素链与靶蛋白以及自身结合，这是招募和激活泛素依赖激酶TAK 1及其下游靶点IKK和MAPK所必需的(图一)。5)。TRAF 6依赖的信号转导和促炎基因的诱导受CYLD和A20等DUBS的控制。3Peli1在外周巨噬细胞和中枢神经系统(CNS)驻留的巨噬细胞(小胶质细胞)中均发挥作用，介导TLR刺激的促炎细胞因子和趋化因子的表达。53,185Peli1通过介导TRIF下游信号适配器RIP 1的K63泛素化来促进TRIF依赖的TLR激活NF-κB。53在小胶质细胞中，Peli1还介导MyD 88 TLR诱导的MAPK的激活，Peli1的这一功能涉及到K63泛素化和CIAP的激活，而CIAP又介导一个负调节因子TRAF 3的K 48泛素化和降解。185Peli1还能介导K63泛素化和转录因子IRF 5的激活，这有助于诱导M1巨噬细胞极化。186最近的一项研究表明，Peli1通过介导IRAK 1的K63泛素化，负调控IL-10诱导的巨噬细胞向M2亚型M2c的极化。IRAK 1泛素化促进转录因子STAT 1的活化，抑制STAT 3在介导IL-10诱导的基因表达和M2c分化中的作用。187髓系细胞条件下Peli1基因敲除小鼠的肿瘤生长明显增强。这些研究表明，Peli1是一种能促进M1和抑制M2巨噬细胞功能的E3(图1)。5).

虽然TRAF家族成员被认为是K63特异性的E3s，但TRAF 2和TRAF 3在调节泛素依赖信号方面具有非典型的功能。188基因靶向研究表明TRAF 2和TRAF 3对巨噬细胞促炎性TLR反应具有负调控作用。189TRAF 2或TRAF 3的髓系细胞特异性缺失可使小鼠对右旋糖酐硫酸钠诱导的结肠炎敏感，而TRAF 3缺乏的小鼠在老年时也会自发地发生器官炎症。189,190缺乏TRAF 2或TRAF 3的巨噬细胞对TLR刺激产生促炎细胞因子(包括肿瘤坏死因子α、IL-1b、IL-6、IL-12和IL-23)反应强烈。189从机械上看，TRAF 2和TRAF 3与CIAP(cIAP 1或cIAP 2)共同形成K48特异性E3泛素连接酶复合物，介导泛素依赖的转录因子(包括c-rel和IRF 5)的降解，参与促炎因子基因的诱导。重要的是，髓系细胞中TRAF 2的缺失促进了肿瘤浸润的巨噬细胞的m1样功能，这与产生γ的CD4和CD8效应T细胞增加肿瘤浸润和改善小鼠模型中的肿瘤抑制和存活有关。189(无花果)5)。这些发现提示TRAF 2、TRAF 3和CIAP在调节巨噬细胞的活化和分化中起着重要作用，并为调控肿瘤相关巨噬细胞功能提供了潜在的治疗靶点，有利于诱导抗肿瘤免疫(如图1所示)。5)。Peli1在促进TLR刺激的TRAF 3降解中的作用与Peli1的促炎作用是一致的。185

其他几种E3连接酶已经被证明可以调节巨噬细胞的极化和功能。E3连接酶Praja2泛素化恶性纤维组织细胞瘤扩增序列1(MFHAS 1)，这是一种参与调节TLR 2激活JNK和p38 MAPK通路的蛋白。191Praja 2介导MFHAS 1的非降解泛素化，促进TLR 2刺激的JNK/p38活化，促进巨噬细胞极化至M1型(图1)。5)。TRIM 24家族TRIM 24通过泛素化乙酰转移酶CREB结合蛋白(CBP)抑制M2巨噬细胞分化，从而促进CBP与介导M2相关基因诱导的转录因子STAT 6的关联和抑制。192CBP介导的STAT 6乙酰化减弱了其在M2基因诱导中的转录功能，进而抑制了M2极化。髓系细胞特异性缺失TRIM 24促进肿瘤浸润M2样巨噬细胞，减少CD4和CD8效应T细胞浸润，从而增加小鼠对肿瘤生长的敏感性。192(无花果)5)。与TRIM 24相反，E3连接酶Nrdp 1通过介导K63泛素化和激活CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)，促进IL-4对M2巨噬细胞基因的诱导。193未知E3对巨噬细胞清道夫受体(MSR1)K63泛素化也能促进IL-4激活的巨噬细胞抗炎和促炎作用。194K63泛素化的MSR 1激活了由泛素结合激酶TAK 1及其下游靶点MKK 7和JNK组成的信号复合物，JNK信号轴参与IL-4激活的巨噬细胞的促炎细胞因子诱导和表型转换。194ATP结合盒家族成员ABCF 1在蛋白酪氨酸激酶Syk和TRAF成员TRAF 3上具有E2结合K63泛素化链的功能，促进TLR 4内吞，并从依赖MyD 88向TRIF依赖信号转变，从而使巨噬细胞极化从M1向M2转移。195这些研究表明泛素化在调节巨噬细胞的活化、极化和功能方面起着至关重要的作用，强调了靶向泛素通路在通过调节肿瘤微环境改善肿瘤免疫治疗中的重要意义。5).

泛素化是一种公认的调节肿瘤生长和进展以及肿瘤微环境的机制。196,197此外，越来越多的证据表明泛素化还调节肿瘤对免疫破坏的抵抗力和肿瘤介导的免疫抑制。尤其是泛素化在调节PD-L1的命运中起着重要的作用，PD-L1是一种主要的免疫检查点分子，通过在肿瘤浸润的效应T细胞上连接PD1来抑制T细胞的功能。198一个E3家族成员，cullin3-SPOP，针对pd-L1在肿瘤细胞中的泛素依赖性降解。101这种泛素化事件是由细胞周期蛋白D及其催化伙伴环化蛋白依赖激酶4(CDK 4)调控的，它介导着cclin3-SPOP复合物的底物结合适配器SPOP的磷酸化和降解。101CDK 4或SPOP中功能缺失突变的药物作用抑制PD-L1的泛素化和降解，导致PD-L1在小鼠肿瘤模型和人前列腺癌标本中的表达增加，肿瘤浸润淋巴细胞减少。101CKLF样Marvel跨膜结构域(CMTM 6)也可调节Pd-L1在癌细胞中的表达，从而稳定PD-L1，抑制抗肿瘤T细胞活性。199,200CMTM 6在质膜上与Pd-L1发生物理作用，尽管对CMTM 6如何稳定PD-L1的研究尚不完全清楚。一项研究表明，CMTM 6基因敲除导致PD-L1泛素化增加，这似乎与E3连接酶STUB 1的作用有关。199另一项研究表明，CMTM 6可以防止Pd-L1的溶酶体降解。200

与E3连接酶的作用相反，特异性化合物通过去泛素作用介导PD-L1的稳定。最近的一项研究发现，COP 9信号体5(CSN 5)是介导Pd-L1在癌细胞中去泛素化和稳定的一个分支。100最初展示的是从内切蛋白中去除泛素样修饰剂Nedd 8，201后来发现CSN 5也具有Dub活性。202有趣的是，CSN 5是Pd-L1稳定和免疫抑制所必需的，它是由促炎细胞因子TNFα刺激的。肿瘤坏死因子α通过激活转录因子NF-κBp 65，直接激活CSN 5编码基因的启动子，上调CSN 5的表达。100另一个叫USP 22的化合物也通过去泛素化来稳定肿瘤细胞中的PD-L1，并抑制了小鼠肿瘤模型的抗肿瘤免疫。203,204当USP 22与PD-L1相互作用并抑制PD-L1泛素化时，它与CSN 5结合并稳定，提示其PD-L1调控功能可能与CSN 5的协同作用有关。204

泛素化还调节癌细胞对免疫治疗的抗药性。最近的一项研究表明，一名黑色素瘤患者对PD-1的阻断具有功能缺失突变的E3连接酶FBXW 7。205一直以来，小鼠肿瘤中Fbxw 7的缺失或突变使其对抗PD1的治疗产生了耐药性。Fbxw 7是肿瘤细胞中双链RNA传感和IFN信号传递所必需的，对促进抗肿瘤免疫和免疫治疗具有重要意义。Fbxw 7能稳定细胞质RNA传感器-I和MDA 5，但其机制尚不清楚。205鉴于泛素化在调节肿瘤细胞不同信号通路中的作用，更多的E3s和Dubs可能参与调节肿瘤对免疫破坏的抵抗力。因此，靶向肿瘤细胞中的泛素化途径是促进抗肿瘤免疫和肿瘤免疫治疗的一种有吸引力的方法。

E3泛素连接酶介导底物识别，决定泛素化反应的特异性，是泛素化途径中药物靶向的重要因素。一些E3s的小分子抑制剂已经在癌症免疫治疗或联合治疗的临床前模型中被开发和测试。其中包括e3连接酶IAP家族的拮抗剂，包括cIAP 1、cIAP 2和X-连锁IAP(XIAP)，它们是内源性IAP抑制剂SMAC(亦称暗黑破坏分子)的小分子模拟物。206IAP拮抗剂最初被开发成靶向IAP在癌细胞中的凋亡抑制作用的药物，现在已经被证明可以通过增强天然免疫和适应性免疫反应来有效地刺激抗肿瘤免疫。206在联合治疗中，通过卡介苗杆菌(BCG)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、嵌合抗原受体(CAR)T细胞、NKT细胞诱导剂α-GalCer、肿瘤坏死因子(α)和血小板抑制因子1(PD 1)等免疫抑制剂或细胞，可显著提高肿瘤治疗的疗效。207,208,209,210,211,212这些临床前研究突出了将IAP拮抗剂作为药物用于人类癌症免疫治疗的潜力，目前正在几个早期临床试验中评估这一耐人寻味的可能性。206

另一个正在探索的E3连接酶在肿瘤治疗中的药物靶向作用是MDM 2，它通过介导抑癌基因p53和p53无关功能的泛素依赖性降解来促进肿瘤的生长和进展。213最近的研究表明MDM 2在ICI治疗后，放大与不良的临床结果和加速的癌症进展，也就是所谓的高进展率有关。214,215,216MDM 2的一种小分子抑制剂AMG-232在体外使肿瘤细胞对T细胞介导的杀伤敏感。217另一种MDM 2抑制剂APG-115通过促进M_1巨噬细胞极化和T细胞活化，在小鼠肿瘤免疫治疗模型中与PD1阻断协同作用。218后一项发现与先前报道的MDM 2负调控抗肿瘤T细胞反应一致。95另一种重要的E3连接酶是VHL E3复合物，它介导HIF1α的泛素依赖性降解，控制T细胞的代谢活性和效应功能。160一种小分子抑制剂已被开发以阻断VHL与其底物HIF1α的结合，尽管其在肿瘤免疫治疗中的作用尚未得到测试。219由于VHL介导的HIF1α降解抑制了CD8效应T细胞的迁移和抗肿瘤功能，161,162VHL抑制剂有可能促进肿瘤微环境中CD8 T细胞的功能。

一些化合物的小分子抑制剂也已经开发出来，其中一些已经在动物模型中被证明能抑制肿瘤的生长。220,221,222,223开发药物的最广泛的DIB是USP 7，有大量的小分子抑制剂正在开发中。224它除了在介导MDM 2的去泛素化和稳定方面发挥着众所周知的作用之外，222USP 7稳定Foxp 3和组蛋白乙酰转移酶Tip 60，从而维持Treg细胞在免疫系统中的功能。165,225不同USP 7抑制剂治疗小鼠对Treg细胞的免疫抑制作用明显减弱，增强了抗肿瘤免疫功能。225,226,227最近，一种抗癌化疗药物米托蒽醌已被证明能抑制USP 15，但该化合物对USP 15的抑制作用很低，目前还没有进行体内研究。228鉴于最近在小分子筛选技术和Dub结构生物学方面的进展，预计未来几年将有更多Dubs和E3s的特定抑制剂可供使用。