多态恶性疟原虫尼日利亚儿童二氢翼状胬肉合成酶和二氢叶酸还原酶基因的高分辨率熔融研究

2005年，尼日利亚联邦卫生部修订了简单疟疾的治疗政策，采用了基于青蒿素的综合疗法(ACTS)。这项政策改变不鼓励使用磺胺嘧啶(SP)作为治疗简单恶性疟的二线疗法。然而，SP被用作妊娠期疟疾(IPTp)和季节疟疾化学预防(SMC)的间歇性预防治疗，用于3-59个月的儿童。越来越多的报道表明，尤其是在尼日利亚的非妊娠人群中，需要通过估计二氢翼状胬肉合成酶的多态性来持续监测SP作为IPTp和SMC的疗效。DHPs)和二氢叶酸还原酶(DHFR)与SP抗性相关的基因。采用高分辨熔融法(HRM)研究了5 1、59、108和164密码子的多态性。DHFR的基因和密码子437,540,581和613DHPs基因。从271份干血斑滤纸样品中提取DNA。这个DHFR三重突变体I51R59N108, DHPs双突变体G437G581四倍DHFR I51R59N108 + DHPs G437突变型单倍型分别占80.8%、13.7%和52.8%。虽然五倍DHFR I51R59N108 + DHPs G437E540六合彩DHFR I51R59N108 + DHPs G437E540G581突变单倍型体内和体外未检测到SP耐药性，应在该国对这些单倍型进行持续监测，以检测流行率的任何变化。

2005年，尼日利亚联邦卫生部修订了治疗简单疟疾的政策，采用了青蒿素综合疗法(ACTS)。1。这一治疗政策的改变阻止了使用氯喹(CQ)和磺胺-吡啶胺(SP)分别作为一线和二线治疗非复杂恶性疟。然而，在包括尼日利亚在内的疟疾流行国家，SP继续被用作妊娠期疟疾(IPTp)和季节性疟疾化学预防(SMC)的间歇性预防治疗。2,3.

为了证明在非洲SP耐药情况下继续使用SP作为IPTp和SMC，需要通过监测与SP抗药性相关的基因的多态性，对寄生虫抗药性水平进行持续的流行病学监测。点突变，如S436A，A437G，K540E，A581G和A613二氢翼状胬肉合成酶中的T/SDHPs)基因和N51I，C59R，S108N和我164L在二氢叶酸还原酶(DHFR)基因在SP抗性中起重要作用4,5,6。在种群水平上，恶性疟原虫寄生虫，即三重DHFRI突变51，R59、N108，再加上双倍DHPsG突变437，和E540(我51R59N108G437E540)还与iptp的SP疗效降低、无症状孕妇寄生虫清除能力降低和治疗后预防活动缩短密切相关。7,8,9.

自2001年在尼日利亚部署SP为IPTp以来10和2013年的SMC11，有关于这两种点突变的各种报道。DHFR和DHPs在全国各地与SP抗性相关的基因11,12。儿童三重突变型流行率高的报告DHFR(N)51I，C59R和S108(N)除A外437G突变DHPs基因在尼日利亚很常见。13。然而，五倍的出现DHFR + DHPsN的突变51I，C59R和S108N+A437G和K540E是稀缺的13.

因此，本研究的目的是：(1)审查流通的现状。DHFR和DHPs的密码子51、59、108和164的单倍型DHFR的密码子437,540,581和613DHPs(Ii)估计单、双、三、四、五倍突变的流行率。4在尼日利亚五个州的寄生虫中。

基线人口和临床数据

本次分析考虑了来自Adamawa(50岁)、Bayelsa(45岁)、Imo(82岁)、Kwara(45名)和Sokoto(49名)的271名儿童的情况。儿童的基线特征见表1。总体上，男性160人(59.04%)。所有儿童的平均年龄为38.2±16.5个月。平均体温为37.5±2.5°C，其中17例(4.4%)出现高热(登记温度>40°C)。总几何型无性寄生虫血症为14,673寄生虫/μL−1(范围：2003-198,200)。

裂殖子表面蛋白基因分型恶性疟原虫

家谱多态长度标记缔约国会议-2和缔约国会议-1被用于基因分型恶性疟原虫在被考虑参加这项研究的儿童中。一般而言，180名(66.8%)儿童患有多克隆感染(表)2)。所有人群中寄生虫感染的平均复杂性(MCOI)为2.3。两种等位基因家族分布缔约国会议-2和缔约国会议-表中每个国家有1名代表2。总体而言，3D7等位基因家族的扩增率最高(50.7%)。缔约国-多态标记2个，K1等位基因家族最多(18.4%)。缔约国-1多态标记。

多态DHFR基因

在所调查的271名儿童中，241名(88.9%)、245名(90.4%)和219名(80.8%)感染了携带突变体I的寄生虫。51，R59和N108等位基因。没有一名儿童感染了寄生在L突变体上的寄生虫。164等位基因。突变体I的分布51，R59和N108多克隆感染的等位基因显著高于单克隆感染(p<0.05)。所有从伊莫州登记的儿童中获得的分离物都感染了只带有突变体I的寄生虫。51和R59等位基因1a，b)。

多态DHPs基因

在所调查的271名儿童中，223名(82.3%)和45名(16.6%)感染了携带变异G的寄生虫437和G581等位基因。没有一个孩子感染了携带E变异体的寄生虫540和T/S613等位基因.突变体G的分布437和G581多克隆感染的等位基因显著高于单克隆感染(P<0.05)。1c，d)。

DHFR和DHPs单倍型频率与分布

寄生在DHFR三重突变体I51R59N108，双突变体I51R59，双突变体R59N108,单突变体N108在271名儿童中，单倍型分别占80.8%、8.1%、0.74%和7.4%。2)。儿童的比例DHFR三重突变体I51R59N108双突变体I51R59北方(Adamawa、Sokoto和Kwara)和南方(Bayelsa和Imo)州的单倍型相似(p>0.05)。相反，DHFR单突变体N108北部各州高于南方各州(p>0.05)。双突变体R59N108单倍型只在Kwara州和Sokoto州(北方州)的两个儿童中记录到(见图)。2).

寄生在DHPs双突变体G437G581，单突变体G437单突变体G581在271名儿童中，单倍型分别占13.7%、66.1%和2.6%。3)。没有三倍和四倍DHPs突变单倍型，因为没有一个菌株携带突变等位基因DHPs540.双突变体G的分布无差异。437G581单突变体G437北部和南部各州的单倍型(p>0.05)。

合并流行率DHPs和DHFR单倍型

不同等位基因的流行率DHFR和DHPs基因组合为单突变单倍型(DHFR N108)，双突变单倍型(DHFR R59N108)，三重突变单倍型(DHFR I51R59N108)，四重突变单倍型(DHFR I51R59N108 + DHPsG437)，五重突变单倍型(DHFR I51R59N108 + DHPs G437E540)和六元组突变单倍型(DHFRI51R59N108 + DHPs G437E540G581)得到审议(表3)。虽然大部分DHFR I51R59N108在多克隆感染中只观察到8种单倍型，在克隆性(p>0.0 5)或位置(即北部和南部)的分布上差异无显着性(p>0.0 5)。在271名儿童中，有143人(52.8%)出现了四重突变单倍型(表)。3)。143例中83例(58.0%)为多克隆性感染，但在克隆性(多克隆性与单克隆性)或定位(P>0.05)上，该单倍型的分布无显着性差异(P>0.05)。271名儿童中没有一人感染了E型五重突变和六元组突变的寄生虫。540突变等位基因缺失(表)3).

本研究对循环状态进行了评估。DHFR和DHPs的密码子51、59、108和164的单倍型DHFR的基因和密码子437,540,581和613DHPs基因和估计流行率DHFR + DHPs尼日利亚无并发症恶性疟儿童271例(<5岁)经治疗10年后获得的混合突变单倍型改为ACTS。

我们研究的多态性数据显示，突变体I的发病率很高。51(88.9%)和N108 (80.8%) DHFR等位基因与突变体G437 (82.3%) DHPs等位基因。这些突变体的相似流行率DHFR和DHPs尼日利亚记录了等位基因11,13和其他西非国家14,15。尽管这些变异等位基因在西非的流行率普遍较高16，其他西非国家的流行率较低(26.5-56.25)4,17。这些西非国家流行率差异的确切原因可能是由于这些国家使用SP的不同18。还有，恶性疟原虫在这些地区的病人中，其他疾病的病因以合并感染的形式存在。同样有道理的是，在治疗这些混合感染时使用其他与舒帕有关的药物可能会选择这些突变。恶性疟原虫不同水平的基因组19.

磺胺-吡啶甲胺曾被用作疟疾的每周预防措施，在此期间，突变体E。540记录等位基因2,5。然而，当SP的治疗使用已从每周预防改为IPTp和SMCs时，我们的研究表明没有突变E。540等位基因。尼日利亚最近的研究也观察到了类似的趋势。11,19。这种突变等位基因的消失可能是由于治疗政策的改变导致该国SP药物压力降低的结果。

皮尔斯等人20说明了测量单倍型频率相对于每个点突变的流行率的重要性，因为单倍型是决定抗性水平的因素。我们观察到高频率(80.8%)的DHFR三重突变单倍型(I)51R59N108)，这表明类似寄生虫的持续循环，就像在act引入后的早期研究中所报道的那样。11,12,18。这些寄生虫可能是由于SP药物的压力而选择的，因为这种药物在该国并没有完全撤回，而是一直用作IPTp和SMCs。三氯氰菊酯、磺胺甲基唑靶向药物的应用DHFR基因肉食肺孢子虫在疟疾和艾滋病共同感染的环境中，也可能是选择这种单倍型的原因之一。恶性疟原虫尼日利亚人口5。这种突变单倍型在如此高的频率上的发生是令人担忧的，因为在DHFR基因在体外具有比I更高的1.5到3倍的耐药能力。51N108或R59N108双突变5。因此，在SP作为IPTp和SMCs的应用中，吡啶甲胺作为一种伙伴药物的有效性受到了威胁。虽然双倍DHPs突变单倍型(G)437G581)是在我们的研究中观察到的(12.9%)，没有E。540突变DHPs基因与单突变体G的组合437或双突变体G437G581在本研究中，我们希望双突变体G437E540单倍型对磺胺嘧啶耐药至关重要5.

在本研究中，我们还观察到了高水平的多克隆感染，因为大多数被考虑的国家有超过60%的儿童患有多克隆感染。进一步的数据分析表明突变体DHFR(我51，R59和N108)和突变体DHPs(G)437和G581多克隆感染的等位基因显著高于单克隆感染(P<0.05)。此外，DHFR三重突变体I51R59N108单倍型在多克隆感染中显著增高(P<0.05)。这些观察可能是有问题的，因为高水平的多克隆性与寄生虫传播和多样性的增加有关。这可能导致这些变异等位基因和单倍型在国内的传播增加。这可能危及在尼日利亚使用SPS作为IPTp和SMCs。

未出版恶性疟原虫微卫星数据21确认了使用缔约国-1和缔约国会议-2个多态基因，但也显示这些寄生虫与5个寄生虫种群的群体分化程度较低(尼日利亚州)。这表明，尽管观察到了高度的寄生虫多样性，但在全国范围内，寄生虫在基因上是相似的。这可能是由于观察到的相似的分布组合。DHFR + DHPs三重突变单倍型(DHFR I51R59N108：P>0.05)和四重突变单倍型(DHFRI51R59N108 + DHPs G437：P>0.05)在本研究中考虑的该国北部和南部各州。

五重突变单倍型(DHFR I51R59N108 + DHPs G437E540)早些时候在尼日利亚的报告(2005年)5在这项研究中没有出现。这可能是由于从SP作为疟疾二线治疗到ACTS的政策改变，SP药物压力降低了。五元组和六元组突变单倍型都与体内和体外SP抗性密切相关。22在南部和东部非洲23,24在目前的研究中，他们的缺席不仅是有益的，而且与西非其他国家的报告是一致的。4,25。尽管如此，对重新出现的持续监测DHFR I51R59N108 + DHPs G437E540的出现DHFR I51R59N108 + DHPsG437E540G581应在该国维持单倍型，以检测记录流行率的任何变化。这将确保迅速采取替代控制措施，防止这些单倍型在该国境内传播，如果不加以制止，将导致SP作为IPTp和SMC的效力降低。

研究地点

本研究是国家药品疗效试验(DTET)研究的一部分，目的是监测青蒿甲醚-鲁米凡特(AL)、青蒿琥酯-阿莫地喹(AA)和二氢青蒿素-哌喹(DHP)治疗5岁以下儿童急性非复杂恶性疟原虫感染的疗效。本研究中考虑分析的样本来自五个尼日利亚州，这些州被细分为北部地区(Adamawa、Sokoto和Kwara州)和南部地区(Bayelsa州和Imo州)(图一)。4)。这些州是尼日利亚联邦卫生部2014/2015年度国家消除疟疾方案(NMEP)药物治疗疗效测试(DTET)研究的哨点的一部分。26.

病人登记标准及样本收集

在早期的一项研究中，初步讨论了在哨兵位置登记病人的情况。26。治疗前(第0天)和治疗后第1-3、7、14、21、28、35和42天，将2至3滴手指刺血涂在3毫米Whatman滤纸上(Whatman International Limited，Maidstone，联合王国)。浸在滤纸上的血样可以在室温下适当干燥，并用硅胶储存在密封的信封中。

DNA提取

从干血斑(DBS)中提取dna，即第0天(治疗前)血液浸渍滤纸，检测耐药标记的多态性，并测定原虫的遗传多样性。27。一种齐根DNA提取试剂盒(齐根，希尔登，德国)被用来从DBS提取DNA，遵循制造商的协议。简单地说，1/4的DBS被用于提取，最后用缓冲液AE洗脱60μl的DNA含量。

基因分型恶性疟原虫使用缔约国会议-1和缔约国会议-2基因

多态长度标记缔约国会议-2和缔约国会议-1被套式PCR扩增，如前所述。28。由于尼日利亚报告的PCR扩增率较低，本研究未考虑glurp多态标记。29。PCR扩增在热环(Eppendorf VAPO)上进行。最后一卷25μ1，2%(2%)琼脂糖凝胶用于PCR扩增的分辨率。扩增产物根据100碱基对(BP)DNA分子量标记(新英格兰生物标记，贝弗利，MA)和凝胶可视化盒(Syngene，UK)进行检测。根据样本中存在的寄生虫克隆的数量进行解释。简单地说，如果一个病人的寄生虫在一个等位基因家族中显示多个等位基因家族或多个扩增子片段，那么感染被定义为多克隆。如果一个分离物在一个等位基因家族中有一个单一的扩增片段，而另一个等位基因家族(Ie)没有被扩增，那么感染被定义为单克隆。6.

高分辨耐药试验

如上文所述，进行了高分辨率熔炼(HRM)试验。30。简单地说，制备了10X引物-探针混合物和反应混合物。在含有9.0μ1反应混合物的聚合酶链反应(PCR)中，配以一微升的定量DNA样品。使用的聚合酶链反应循环和熔化条件是前面描述的。30。仪器所包含的标准软件用于未标记探针分析，根据不同的熔化温度，指示不同碱基对的熔融峰，并与野生型和突变型对照进行比较，以确定两者的等位基因。DHFR(补充图。沙一和S2)和DHPs(补充图。S3和S4)化验。本研究采用的寄生虫基因组对照，即3D7、HB3、DD2和Tm90C6B，均由BEI资源(MR4、BEI资源，美国)慷慨捐赠。

统计分析

用Epi-Info软件第6版和SPSSforWindows20.0软件对数据进行二次录入和分析。通过计算χ对比例进行比较。2使用Yates的修正，Fisher的精确或Mantel Haenszel检验。采用学生t检验和方差分析(ANOVA)对正态分布的连续数据进行分析.曼-惠特尼U使用检验和KruskalWallis检验(或按Wilcoxon排序和检验)对不符合正态分布的数据进行比较。P值<0.05，差异有显着性(P<0.05)。