双环唑酯抑制疟原虫苯丙氨酸tRNA合成酶的结构基础

抑制疟原虫胞浆苯丙氨酸tRNA合成酶(CFRS)在疟疾动物模型中已显示出预防疟疾传播、提供预防和单剂量治疗的潜力。然而，到目前为止，疟原虫双环齐墩果苷对CFRS的抑制作用尚不清楚。在此，我们提出了结构和生化证据，双环氮杂环化合物是L-PHE的竞争性抑制剂，而L-PHE是CFRS催化的氨基酰化反应所需的三种底物之一，是寄生虫蛋白质合成的基础。关键是，我们的共晶结构聚氯乙烯Frs-brd 1389配合物表明，双环氮杂环配体结合在两个不同的亚位。光伏CFRS催化位点配体占据L-PHE位点和辅助腔，并穿过ATP结合位点。鉴于brd 1389识别残基在apicomplexan frs中是保守的，本工作为开发抗这两种药物的药物奠定了一个结构框架。疟原虫以及相关的丛状神经丛。

由根尖丛寄生虫引起的疟疾疟原虫，主要是由于出现了对第一线药物具有抗药性的寄生虫株，这给全球健康带来了巨大的挑战。1,2。因此，有必要发现和验证新的药物靶点以及不受传统抗疟药耐药机制影响的化合物。2,3。理想情况下，抗疟发展的候选对象应该有一种新的作用机制(Moa)，迅速减少无性血液阶段的寄生虫，并对人类宿主寄生虫生命周期的所有阶段具有活性。2。近年来，一系列以双环氮杂环为核心的小分子被发现具有多级抗疟作用，并能在小鼠疟疾模型中实现单剂量治疗。2。结果表明，这些化合物通过抑制抗疟作用而发挥抗疟作用。恶性疟原虫胞浆苯丙氨酸-tRNA合成酶(CFRS)2一种蛋白质合成所必需的酶。这个PFCFRS确实被证实为双环氮杂替丁系列分子的药物靶点。2为进一步开发药物奠定了基础。氨基酰基-tRNA合成酶(AARS)以氨基酰基腺苷酸盐(AA-AMP)的形式激活氨基酸，并使氨基酸作为核糖体的饲料传递到同源RNA的3‘端。3,4。因此，AARS的抑制导致细胞生长中断，最终导致细胞死亡。3。值得注意的是，疟原虫FRS以外的AARS最近也成为抗疟发展努力的焦点。3.

如以前所示恶性疟原虫，疟原虫有三个蛋白质翻译室：细胞质、顶体和frs所居住的线粒体，将带电荷的trna喂入核糖体基础的蛋白质合成中。4。两种恶性疟原虫和间日疟原虫，FRS以α-二聚体(α)和β-二聚体(β)亚基的形式存在，进一步二聚体形成(αβ)复合物。24。Cfrs的这种异四聚体结构是保守的，但在α和β亚基的链长和功能上有显著差异。5。Frsα亚基含有活性位点，催化两步氨基酰化反应，而β亚基的主要功能是识别trna的反密码子区域，编辑带有等位氨基酸(如酪氨酸)的trna分子。5。这些cfrs高度保守，并且具有高的序列同一性。疟原虫表明导致人类疟疾的所有五种寄生虫的FRS可以被一个单一的化学系列所针对。在本工作中，我们揭示了抑制的生物化学和结构基础。疟原虫的x射线共晶体结构聚氯乙烯FRS与BRD 1389，一种有效的抗疟从双环氮杂替丁化学系列。

BRD 1389选择性结合CFRS，并通过L-PHE竞争抑制氨基酰化。

为了确定双环氮杂环化合物对CFRS的抑制方式，我们转向BRD 1389(图1)。1A，补充图。1(2)在生长抑制实验中具有较高体外效价的一系列类似物。PF3D7和PFK1 EC50分别为13和12 NM)，对寄生虫FRS酶活性有较强的抑制作用，对人体同源物具有较高的选择性(表)。1、图1.1B，补充图。3C，d)。测定了纯化杂二聚物的酶活性。PF孔雀绿底物与底物L-Phe和ATP的cfRS分析6。特别是，为了理解PF在固定饱和浓度(L-PHE或ATP)和不同抑制剂浓度下测定CFRS动力学、酶活性。然后对实验数据进行竞争、混合或非竞争性抑制模式的评估。我们首次在ATP的恒定浓度下进行了这项研究，随着L-Phe浓度的增加而增加.这些数据表明，BRD 1389表现出一种竞争抑制模式，与L-PHE结合(如图所示)。1C)与全球竞争抑制模型相适应，导致Ki6±2nm。这些结果与先前报道的一种紧密相关的双环氮杂环醚(BRD 1095)抑制体外寄生虫生长的数据一致，后者显示出较高的EC值。50随着L-Phe浓度的增加2。然后，我们重复了以ATP为变浓度底物的抑制研究模式.这些数据符合修正的高底物抑制米氏方程(对应的双倒数图，见图)。1D)，与非竞争性抑制模型一致，其中brd 1389给出了Ki10±5nm。这些结果表明BRD 1389通过L-Phe的竞争优先与游离酶结合。这一作用机制是独特的，相比于其他有前景的抗疟Aars抑制剂的cladosporin类。7,8,9(类似于腺苷)或卤素支架(紧密结合需要ATP)10,11,12。此外，为了了解选择性的程度，我们用PFCFRS和人胞浆FRS(房协(CFRS)这些数据显示出明显的结合亲合性和结合动力学(BRD 1389 K)。d: PFCFRS：4 NM；房协CFRS：16 M)适合于1：1的非线性回归结合模型(特异结合)(补充图)。3C，d).

总体结构光伏CFRS

为了解开蛋白质-抑制剂相互作用的结构基础，我们结晶了光伏CFRS-BRD 1389配合物，并获得了衍射至3 Au的晶体。结构采用分子置换(MR)方法。房协CFRS作为模板(PDB：“3L4G]Https://www.rcsb.org/structure/3l4g]“)。这个光伏CFRS-BRD 1389晶体属于正交空间群P21212每个不对称单元有一个杂二聚体(αβ)。(αβ)2生物异质四元组装是通过沿c轴的两倍轴完成的。光伏CFRS(αβ)2组装符合纯化蛋白的大小排阻色谱剖面，其大小为298 kDa(补充图)。3A)。我们的决赛光伏Cfrs-brd 1389原子模型包含905个残基299：α亚基，606：β亚基，1毫克2+，和一个配体(BRD 1389)。α亚基的N端结构域(残基1-270)在晶体中缺失，没有观察到电子密度。这一点通过晶体包装分析进一步证实了这一点。光伏FRS-BRD 1389复合物，并通过SDS-PAGE的结晶蛋白(补充图。4)。α和β亚基的整体折叠和组织与人类的同源性非常相似。房协CFRS图2A，b)，但例外情况是，光伏CFRSβ亚基在其PB1结构域内缺乏一个18残基长的片段，而在其B2亚结构域中有两个独特的插入(IL-1：421-444，IL 2：535-551)(补充图)。5)。有趣的是，β1和β2亚结构域(β亚基)与α亚基之间的联系在寄生虫和人类酶之间是显著不同的。1 E-j，补充图。6A)。在……里面房协α亚基被同一β亚基的β1和β2亚域所包围，而在光伏CFRSβ1和β2‘与β亚基相关联(图1)。1J，i)。这一差异的产生是由于β1和β2之间的链接器长度较短。光伏CFRS与房协CFRS(图1.1H，k)有三个残基(384-TYT-386)插入。有趣的是，在所有人类疟原虫中都观察到了这种三残基短链。1H，k)并且暗示着域的交换(如图所示。1g)在光伏形成封闭的功能性杂四聚体(αβ)2大会。

BRD 1389占据L-phe站点和疟原虫CFRS

在.的精炼过程中光伏差分傅里叶电子密度(F)的CFRS模型研究o-Fc)图谱显示BRD 1389被绑定在酶活性位点(如图所示)。2C，d)。结合配体随后用模拟退火忽略图(SA-omit)图进行了验证。二维空间)。叠加光伏CFRSα亚基房协CFRS和[医]嗜热热症FRS(TTFRS，PDB：“2 IY5[Https://www.rcsb.org/structure/2IY5])允许在这些FRSs上定位L-PHE、ATP和tRNA结合位点(如图所示)。3C)。进一步分析光伏CFRS：BRD 1389配合物显示，BRD 1389的二芳基乙炔基位于L-PHE位点，其4-环丙氧基苯基驻留在一个辅助口袋中，[6.2.0]-重氮杂环十二烷基位于ATP位点附近。光伏CFRS(图1.三维空间，补充图。7)。这个光伏CFRS：BRD 1389配合物主要通过疏水和亲水相互作用在多个位置稳定，有助于识别重氮环十二烷核、4-环丙氧基苯基和二芳基乙炔附属物(图1)。3A).

BRD 1389的活性位点疟原虫CFRS采用独特的构象

在这个复杂的，开放和关闭构象的残渣Arg 548(图。4A，d是值得注意的。特别是Arg 548的弯曲可能为4-环丙氧基苯基调节打开了辅助口袋的入口点，突出了BRD 1389与4-环丙氧基苯基的相互作用的诱导拟合性质。光伏CFRS(图1.4D)。苯腺苷酸结合TTFRS，Arg 321和Phe 216的胍系(光伏CFRS；Phe 455)为ATP的腺嘌呤环提供堆叠支持，而在光伏CFRS-BRD 1389相应的胍(属于Arg 548)被移离活动地点，采用开放构象(图1)。4A，d)。这一点可以在L-phe结合中进一步研究。房协CFRS，其中相应的Arg 463向内移动(即向活动部位移动)，而采用封闭的构象。另外，在光伏CFRS：BRD 1389复合物在PA1结构域内BRD 1389结合位点附近有两个明显的有序环构象：(1)残基443-453(环1，ATP结合袋)的左向外位移(开放构象)；(2)左手向内移动(闭合)507-515(循环2，在辅助口袋)(图2)。4A-C，补充图。6B，c)。在……里面光伏Cfrs：brd 1389，循环2采用类似苯腺苷酸键的闭合构象。TTFRS与L-PHE不同房协开放式构象图4C，补充图。6C)，而循环1相对于两者移动。TTFRS和房协CFRS达到一个开放的状态(图。4B，补充图。6B).

BRD 1389识别的结构基础光伏CFRS

位于L-PHE位点的BRD 1389的二芳基乙炔部分是通过β链残基Ala541-Trp542-Gly543-Leu544(图1)确认的。3B)，当其边缘苯基环被Tyr 497覆盖时，它提供了一个芳香的T形π…。π相互作用在~4.2Au的距离(如图所示)。3B)。此外，二芳基乙炔分子被Asn 519、Gln 457和Glu459等疏水元素所包围。3B)。BRD 1389的尿素部分被埋在一个槽中，由G 506，His508，Glu510，Lys512-513，Leu 515，Ile 552和Pro549组成。3B，e和4C)。尿素/凹槽间的相互作用主要是由疏水接触来稳定的，尤其是来自Pro549和His508，而残基Val517、Ile 483和Pro549则为环丙氧基基提供三明治支持。3B和4C)。BRD 1389的尿素组分与主链形成氢键相互作用。N-Ser 545原子(图1.3A，b)。上述一系列广泛的相互作用使BRD 1389处于‘L’形构象中，其甲氧基甲基被Arg 443、Glu445、His451和Phe 455的插座残基包围。有趣的是，BRD 1389的结晶位姿接近该抑制剂在水溶液中的构象(补充图)。8和补充表2)。这种相似性突出了重氮杂环十二烷支架的三维形状和刚性在分子附属物的预定向中的重要性，以达到最佳的目标接触。从结构上光伏CFRS：BRD 1389与苯腺苷酸结合TTFRS，很明显地，重氮环十二烷核及其甲氧基甲基延伸部分刷过腺嘌呤结合区的典型ATP结合位点(图1)。三维空间和4B)。考虑到BRD 1389与光伏CFRS(4 NM，表)1)，BRD 1389阻止疟原虫cFRS先用L-Phe，再用ATP。事实上，在孵化的时候光伏高浓度BRD 1389和ATP类似物(非水解腺苷5‘-(β，γ-咪唑)三磷酸，即AMPPNP)的CFRS只与BRD 1389结合。这一结果进一步支持BRD 1389结合可能阻断ATP的参与。令人吃惊的是，残留在光伏识别关键配体组分(重氮环十二烷核、4-环丙氧基苯基、甲氧基甲基和二芳基乙炔基)的cfr是保守的，包括在人类感染的寄生虫，如人类感染的寄生虫中。弓形虫和隐孢子虫(补充图。9).

选择性和抗性的基础-赋予突变

第二，了解双环氮杂环化合物选择性结合和抑制的结构基础。疟原虫CFRS和人类同系物相比，我们比较了光伏CFRS：BRD 1389和房协CFRS-L-PHE配合物侧重于位于配体位点5奥尔范围内的残基。三个变异残基光伏-V 458/HS-I 373，光伏-Y 480/HS-F395，光伏-I 483/HS-L 398位于光伏CFRS(图1.5A)。这表明BRD 1389的选择性可能是由末端环丙基醚引起的。5A)。值得注意的是，已知的所有蛋白质残基在突变时都会产生对双环齐墩果酸的抗药性。2位于FRS的α亚单位内，靠近BRD 1389(如图所示)。5B)。所有这些突变都不是直接出现在ATP、tRNA或L-PHE位点上的(如图所示).5B，补充表3)。然而，一个重要的突变光伏CFRS-L 544V(相当于PFCFRS-在结构上削弱BRD 1389的效能的L550V(表)支撑BRD 1389的[6.2.0]-重氮环1、图1.5B，d)。当我们重建PFCFRS-L 550 V，并测试其酶保真度，我们观察到K显著增加。m底物L-PHE的值(10倍)，而不是ATP的值，表明对双环氮杂环化合物的抗性可能来自于寄生虫的生存和CFRS酶活性的本质之间的权衡(见图)。5C，d).

通过生化和结晶学研究的结合，我们揭示了生物化学和结晶学的分子基础。疟原虫双环齐墩果酸对CFRS的抑制作用。我们已经证明BRD 1389通过竞争性地阻断L-PHE的结合来抑制寄生虫的CFRS功能。BRD 1389的二苯乙炔基位于L-Phe的结合位点，而[6.2.0]-重氮环十二烷核部分包封了ATP结合区。另一方面，BRD 1389的环丙氧基苯基脲区域占据了一个辅助口袋。光伏CFRS疟原虫CFRS与人体同源物在该地区的残留变异是双环氮杂环化合物对酶的高度选择性抑制和杀虫作用的基础。到目前为止，已对两类疟原虫Aars抑制剂进行了结构评估。3。它们要么是单位点占位者(cladosporin，一种腺苷模拟物)，要么是双位点任务者(卤素酮，L-Pro和tRNA 3‘端的模拟物)。因为brd 1389同时占据了L-phe站点和一个辅助口袋光伏CFRS，它代表了一种新的双位点疟疾寄生虫Aars抑制剂。6一个,6；右面板)。

总体而言，我们对有助于CFRS抑制剂选择性和耐药性的蛋白质区域和残基的映射为设计具有更好效力和安全性的下一代化合物提供了一个结构平台。事实上，酶抑制剂的结构也揭示了多样性导向合成(DOS)的基本原理。13,14,15产生这种抑制剂支架的库，即包含刚性双环骨架和多个立体基因元素，在进入酶内的口袋方面发挥了关键作用，而这种口袋可能是经典图书馆中的化合物所无法接触到的。传统的库中充满了含有高比例sp原子的化合物。2杂交，导致更平坦的架构。BRD 1389是DOS的产物，相反，BRD 1389会产生急转弯，并渗透到内部的深口袋中。光伏几乎是直角的CFRS。

因此，这项工作可能允许生成具有可调药物性质的化合物库，通过将FRS作为靶点，可以将注意力集中在其他由apicomplexan驱动的人类疾病上。特别是，在结构的指导下，现在可以开发出三位抑制剂，通过对[6.2.0]-重氮杂环十二烷支架进行化学修饰，完全占据ATP位点。更广泛地说，这项工作为新的抗疟疾药物开发铺平了道路，并有可能是由弓形虫病和隐孢子虫病等由复用者引起的其他疾病。

BRD 1389构象预测

计算使用Schr dinger Maestro版本12.3.012，MMshare版本4.9.012，发布版2020-1，平台Windowsx64。在Jaguar中进行几何优化16第12版10.7版，采用密度泛函理论(B3LYP)、6-31G**基组和Poisson-Boltzmann有限(PBF)水溶剂化模型。用薛定谔大师叠加工具对晶体结构和计算结构进行了最大共同子结构叠加。

BRD 1389的合成

BRD 1389是由已知化合物(8)制备的。R9R第10次S,Z)-9-(4-溴苯基)-6-(4-硝基苯基)sulfonyl)-10-((trityloxy)methyl)-1，6-diazabicyclo[6.2.0]dec-3-ene.14请参阅综合议定书和分析数据的补充资料。

蛋白表达与纯化

全长度PF根据早些时候发表的报告，CFRS被净化了。2。全长度光伏CFRS的纯化也按照相同的协议进行。简而言之，编码基因光伏将CFRSα亚基(Pvx_081300)和β亚基(Pvx_090880)克隆到大肠杆菌PETM 11和pETM 20质粒。两种质粒都被共转化为大肠杆菌用0.5mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在16°C条件下诱导B 834菌株高表达18h。大肠杆菌首先将细胞裂解液装于镍-硝基三乙酸(Ni-NTA)柱(GE Healthcare)上，用肝素色谱(GE Healthcare)进一步纯化洗脱部分，用考马斯亮蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)将其纯化成单一条带。纯化后的蛋白呈单峰状，洗脱体积与均质一致。光伏CFRS杂四聚体在Superdex 200分析凝胶过滤柱(GE Healthcare)上。净化光伏CFRS浓度为25 mg/ml。−1保存在−80°C的25 mm HEPES缓冲液中，pH7.5，NaCl 200 mm，βME 5 mm。

寄生虫生长抑制作用的评价

恶性疟原虫从北斗大学获得氯喹敏感株3D7(氯喹敏感株)和氯喹耐药株K1(氯喹耐药株)，用于体外抗疟活性的检测。栽培恶性疟原虫根据Trager的方法进行了一些修正17。将疟原虫置于RPMI 1640培养基加10%人血浆和2%新鲜红细胞的培养瓶中，在37℃和5%CO气体条件下孵育。2和5%O2。寄生虫血症(感染红细胞占红细胞总数的百分比)保持在0.25~10%之间。更换培养基，每2~3天补充新鲜红细胞。药敏试验按Desjardins法进行18修改一下。同时对双环齐墩果酸和已知的抗疟药(氯喹和青蒿素)进行了检测。精确地，将199.5μ1的寄生虫培养物(2%红细胞压积和0 75-1%疟原虫血症)和0.5升按dmso顺序稀释的复方溶液倒入96孔平板中，并在0.001-1μg ml内确定最终药物浓度。−1。在5%CO气体条件下，塔板保持在37°C。2和5%O272小时后，用Makler法定量测定寄生虫的生长情况，检测血浆乳酸脱氢酶(LDH)。19修改一下。准确地说，将培养板保存在冰箱中一夜，然后在37℃解冻，破坏红细胞和寄生虫细胞。在新的96井滴度板中，酶反应液(110 mm L-乳酸，0.5mm乙酰吡啶-腺嘌呤二核苷酸，50 mm三(pH7.5)，10 mm EDTA，50 mm氯化钾，15克升)的酶反应液为100μl。−1分别加入PEG 6000和20℃冻融培养液，在室温下保存30 min。检测液采用等体积混合2mg ml制备。−1硝基蓝四唑和0.1毫克毫升−1在每口井中加入硫酸苯嗪和20μl的硫酸盐溶液。在室温下在黑暗中孵育90 min后，对660 nm处的吸光度进行了分析，并对IC进行了分析。50根据剂量反应曲线计算S值。

酶抑制试验

这些都是用孔雀石绿分析做的，就像先前发表的报告一样。1,6。对100 M ATP、50 M L-苯丙氨酸和100 NM重组PERs酶进行了简单的反应。PF，PV，HS，PF突变体(L550V)在含30 mm HEPES(pH7.5)、150 mm、NaCl、30 mm KCl、50 mm、MgCl的缓冲液中2、1毫米DTT和2U/ml大肠杆菌在37°C下进行无机焦磷酸酶(50μl总体积)的酶促反应，在清晰、平底、96孔板(共星96孔标准微板)中进行。反应混合物在37℃下孵育2h，加入孔雀绿溶液12.5mol/L，室温孵育5 min后，测定无机磷酸盐(PI)的含量。在620 nm处用分子器件谱M_2测量吸光度。以不含FRS酶的反应为背景对照，从酶的反应中减去其值。在氨基酰化反应缓冲液中加入BRD 1389，浓度范围为0.1nm~10000 nm。集成电路50数据的值显示为三个副本的平均值±SD。

表面等离子体共振实验

实验在Biacore T 200仪器(GE Healthcare)上进行，在含5%二甲基亚砜(DMSO)的10 mm磷酸盐缓冲液(PBS)、pH7.4的缓冲液中进行。在实验开始前，用运行缓冲液对流动系统进行启动。双管齐下PFCFRS和房协以N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和乙基(二甲氨基丙基)碳二酰亚胺(EDC)为固定剂，用标准胺偶联化学将CFRS固定在传感器芯片CM5上，固定化水平约为1500 RU。在单循环动力学模式下进行了结合实验。BRD 1389在运行缓冲液中连续稀释，以60μ1 min的流速注入。−1用Biacore评价T 200评价软件(GE Healthcare)进行数据分析，经溶剂校正后，将数据拟合到1：1结合评价法中，确定平衡离解常数(K)。d).

PFCFRS抑制模式研究

为了建立BRD 1389的抑制模式，通过改变抑制剂和底物的浓度，收集了由上述酶抑制试验部分描述的孔雀绿分析平台生成的数据集。利用图Pad棱镜，将每个数据集分别拟合到Michaelis-Menten方程，并对得到的Lineweaver-Burk图进行了检验，以确定竞争抑制、混合抑制或非竞争性抑制的诊断模式。然后在全球范围内将数据集与适当的模型(有EQ)相匹配。1和2分别用于竞争性抑制和混合抑制。

结晶、数据收集和结构确定

净化PFCFRS和光伏CFRS蛋白在293 K时采用悬滴蒸汽扩散法进行结晶，采用商用晶化屏(Index、JCSG-plus、Morphus、PACT总理、PGA、水晶屏、PEG/离子和ProPlex；汉普顿研究和分子维数)。在96孔板上进行了初步筛选，使用的是一个纳米滴点灭蚊机器人(TTP LabTech)。将75、100、50 nL纯化蛋白溶液分别与75、50、100 nL的油藏溶液(1：1，2：1，1：2滴比)混合，进行结晶试验。每一滴水与100毫升相应的储液液进行平衡。结晶前，光伏CFRS稀释至12毫克毫升。−13毫米BRD 1389，5毫米MgCl2，加入4mmβME，在冰上孵育30 min。

衍射质量光伏CFRS-BRD 1389晶体在pgA屏F4[0.1M氯化钠(pH6.5)，3%w/v聚-γ-谷氨酸(Na)]中获得。+3%w/v PEG 20000，0.1M硫酸铵，0.3M甲酸钠]。在含20%(v/v)甘油的结晶母液中浸泡10-30s后，晶体被装在尼龙环(汉普顿研究)或石环(分子尺寸)中。晶体随后在液氮中闪蒸冷却.在英国金刚石光源(DLS)的I24光束线上收集了X射线衍射数据集，波长为0.9688 A˚。数据由xia 2自动处理流水线进行处理。20使用刻度盘21为了融合。初始模型光伏Frs-brd 1389采用分子置换法(Mr)测定。22带着房协FRS(PDB条目“3 L4G_OP”)[Https://www.rcsb.org/structure/3l4g])作为模板。然后，它受到AutoBuild的限制。23这提供了一个带有R的部分模型工作/R免费31/41%∼29个碎片中有800个残基。随后，通过使用coot进行迭代构建完成了模型的手工构建。24使用Refmac进行细化25。经过每一周期的人工建造和改进，对模型进行了检查和手动调整，使其与2f相对应。o-Fc和Fo-Fc电子密度图在精炼过程中，配体BRD 1389和Mg2+基于差分傅里叶映射中的正峰加入离子，并对模型进行模拟退火。Phenix.refine在菲尼克斯26。最后的模型用R改进到3.0的分辨率。工作/R免费占21.4/28.8%。利用Molbity对模型的立体化学质量进行了分析。27该模型具有良好的几何质量，所有残差都在Ramachandran地块的有利/允许区域(92/8%)。此外，我们还进行了晶体包装分析。光伏使用Coot的FRS-BRD 1389复合体24。补充表中提供了数据收集和结构细化的统计数据。1。原子坐标和结构因子已存入蛋白质数据库，登录代码为“7BY6[Https://www.rcsb.org/structure/7BY6]”.

动力学参数测定

米凯利斯常数，公里的ATP和L-PHE底物全氟化FRS野生型(WT)和全氟化用孔雀石绿法检测FRS突变体(L550V)6在含30 mm HEPES(pH7.5)，150 mm，NaCl，30 mm KCl，50 mm，MgCl的缓冲液中2、1毫米DTT和2U/ml大肠杆菌无机焦磷酸酶(NEB)三磷酸腺苷公里用L-Phe(1000μM)饱和浓度测定，并将ATP浓度从1000μM变化到0.0 1μM。公里L-Phe的测定采用ATP饱和浓度(5 0 0μM)，L-Phe浓度从1 0 0 0~0.0001μM，在37°C下进行2 h反应，用棱镜图6.0软件拟合米氏方程。

序列分析与结构表示

利用程序簇Omega对蛋白质序列进行比对。28通过使用默认设置。所有的结构叠加和图形制作都是用CHIMERA进行的。29和Pymol30.