肿瘤浸润肥大细胞与抗pd-1抵抗有关

抗Pd-1治疗被用作许多癌症的一线治疗方法，但是对这种治疗抵抗的机制还缺乏洞察力。在这里，我们通过注射胎儿肝源性CD 34建立了人源化(Hu)小鼠黑色素瘤模型。+细胞和自体胸腺植入免疫缺陷的NOD-SCIDIL2Rγ零(NSG)小鼠。重组后的Hu小鼠受到HLA匹配的黑色素瘤的挑战，并接受抗PD-1治疗，结果导致肿瘤生长受限，但不完全消退.肿瘤rna-seq、多路成像和免疫组织学染色显示趋化因子的高表达，以及FOXP 3的补充。+选择性肿瘤区的Treg和肥大细胞。降低HLA-Ⅰ类表达和CD8+/格兰茨B+在FOXP 3的肿瘤区域观察到T细胞的动态平衡。+Treg细胞与肥大细胞共定位，与抗Pd-1抵抗相关.抗Pd-1与苏尼替尼或伊马替尼联合使用会导致肥大细胞的耗竭和肿瘤的完全消退。因此，我们的研究结果表明肥大细胞的耗竭有助于提高抗Pd-1治疗的疗效.

肿瘤浸润性免疫细胞和非免疫细胞对包括黑色素瘤在内的许多实体肿瘤的治疗反应都有调节作用。1,2。免疫无反应和治疗抵抗是肿瘤患者接受抗pd-1治疗的两大绊脚石。3,4,5,6。抗pd-1治疗的反应常常与包括CD8在内的肿瘤浸润性T细胞的程度有关。+T细胞7,8。尽管存在肿瘤反应性CD8+T细胞、癌细胞通常通过多种机制逃避这些细胞毒性T细胞，这些机制包括：(I)下调肿瘤细胞HLA-Ⅰ类的表达，这是肿瘤抗原提呈所必需的。1,4，(Ii)促进可直接下调T细胞反应的免疫调节细胞的选择性浸润。9或间接下调HLAⅠ类在肿瘤细胞上的表达10(Iii)增加免疫检查点分子的表达。9,11,12。阻止CTLA 4或PD-1等免疫检查点分子的尝试获得了不同程度的成功。在接受抗pd-1抗体治疗的患者中，略高于50%的患者没有任何反应，大约10%的患者有稳定的疾病，25%的患者表现出部分反应，10-15%的患者表现出完全反应。1,13,14。在一些对抗PD-1治疗有初步反应的患者中，随访显示肿瘤复发.由于现有的小鼠肿瘤模型不能复制人类肿瘤的微环境，人们对免疫治疗的耐药机制了解甚少。15,16。这促使我们发展了具有先天和适应性免疫细胞的胡小鼠模型。

在荷瘤小鼠模型中，我们研究了天然免疫细胞与肿瘤细胞在抗PD-1耐药中的串扰.结果提示肿瘤浸润肥大细胞与抗Pd-1耐药有关.使用苏尼替尼或伊马替尼和抗Pd-1联合靶向耗竭这些细胞会导致肿瘤完全消退。在这里，我们揭示了肿瘤浸润肥大细胞在抗Pd-1抵抗中的关键作用.

胡小鼠的建立

我们使用了一种先进的Hu-小鼠模型，该模型与其他转基因Hu-嵌合体有很大的不同，以揭示抗PD-1治疗的免疫抵抗机制(图一)。1A)17,18,19。与持续产生生长和分化因子的转基因鼠嵌合体不同，在我们的模型中，细胞因子的靶向和连续传递是由AAV 8或pMV 101 DNA载体编码的转基因提供的(补充图)。1)促进人免疫细胞的重建。与其他胡鼠模型不同，我们的免疫重组小鼠的寿命稳定在30周左右(补充图)。2)人类CD 34之后+细胞注射。我们的模型的长期稳定性提供了一个机会来描述人类肿瘤挑战后免疫治疗的治疗反应。在这个模型中，在CD 34之后的8-12周。+细胞注射，人CD 45的稳健水平+与未重组的NSG小鼠相比，外周血中可观察到淋巴细胞(如图所示)。1B)。AAV 8 HU-细胞因子(IL-3、IL-7和GM-CSF)的释放(P<0.0 5)p(0.00025)增加人CD 45的水平+与未接受任何细胞因子的组相比，小鼠外周血循环中的细胞。1C)。细胞因子SCF、FLT 3和THPO的加入有助于T细胞和髓系细胞的分化，但并不能提高人CD 45的水平。+细胞。此后所有小鼠均接受上述细胞因子，如IL-3、IL-7、GM-CSF、SCF、FLT 3和THPO。除了人CD 45的存在外，每批小鼠都是独立的。+我们观察到一小部分单核细胞/髓系细胞(HLA DR)的存在。+、CD 33+、CD 15+、CD11b+，以及CD 14+；(图)1D)，NK细胞水平(CD 56)+)(图1.1ET细胞(CD3)+；CD4+，和CD8+)和B细胞(CD 20)+)(图1.1F)。NK细胞(图1.1E)和B细胞亚群(附图)。3A一开始很高，三到四周后，它们的水平随着小鼠胸腺的下降而下降(图一)。1g和补充图。3B)，小鼠脾脏。氢和补充图。3C)和肾包膜移植的胡氏胸腺(图一)。1I)重新植入人类淋巴前体细胞，进行分化。免疫缺陷NSG小鼠白细胞介素2受体γ零基因型，淋巴结欠发达20因此，我们无法获得足够的组织材料来描述这个淋巴器官。T细胞和B细胞抗原的有效表达依赖于巨噬细胞(CD 68)+我们在脾脏和小肠中观察它们(附图)。4A)。当我们在循环血液中检测到抗原特异性IgG时，B细胞是完全功能的(见下面的抗hTERT反应)。人CD4+和CD8+在脾脏、胸腺和肠系膜淋巴结组织中检测到T细胞亚群(附图)。4B)。肝、肠系膜淋巴结和脾脏组织内的T细胞均为TCRγ/δ+.在细菌代谢物(羟基-2-甲基-2-丁烯基-4-焦磷酸[HMBPP]的存在下，这些细胞在体内进一步膨胀。)21；补充图。4C)。表达tcrγ/δ+链的T细胞对黏膜或上皮层的病原体有保护作用；由于其功能活动不受HLA限制，它们在实体肿瘤治疗中的潜在应用正在探索中。22。脾脏中大多数T细胞均有不同程度的T细胞受体(Tcr)α/β表达。+链子(附图)5).

荷瘤小鼠免疫细胞的功能：对肿瘤的应答

如果小鼠与人类淋巴细胞完全重组，那么我们需要确定体液(B-)和细胞(T-)免疫细胞的功能，以及它们对一种经常需要抗原呈递给T和B细胞的免疫制剂的反应能力。为此，胡小鼠用hTERT dna疫苗(一种通用的肿瘤相关抗原)进行了免疫。23(无花果)2A)检测体外刺激后脾淋巴样细胞对hTERT抗原的反应能力，然后用IFNγELISPOT法检测其对hTERT抗原的应答能力。在一组跨越hTERT蛋白的重叠肽上观察到了抗TERT特异性T细胞反应。2B)。此外，免疫后的hTERT小鼠血清中还存在hTERT特异性IgG抗体，证实了B细胞的功能。2C)。PVax1载体不存在T或B细胞反应，对照组、非免疫重组NSG小鼠的脾细胞对hTERT DNA免疫反应不明显(图1)。2B，c).

接下来，我们确定T细胞是否有能力在人源化黑色素瘤小鼠模型中抑制肿瘤的生长(模式，图)。二维空间)。为此，小鼠有90-120绝对CD8。+外周血T细胞数/μ1受到黑色素瘤细胞的攻击，黑色素瘤细胞与供者CD 34上表达的HLA-A等位基因之一相匹配。+细胞。我们的几个黑色素瘤细胞系只表达一个HLA-A等位基因.此外，这些细胞系没有显示HLA-C分子的蛋白表达，通过FACS分析。我们还没有匹配CD 34+HLA-B等位基因的细胞几乎不可能找到与HLA-A和B-等位基因相匹配的供体CD 34细胞，目前还没有提供完全自体系统的人性化模型。由于我们的模型有胸腺移植(自体供体CD 34)+细胞)植入肾包膜下，以消除具有异源反应活性的高亲和力TCR，我们没有看到在完全重组的Hu-小鼠身上出现任何不良事件。尽管HLA-A等位基因匹配的肿瘤模型存在局限性，但与未重组的NSG小鼠或高循环B细胞的Hu-小鼠相比(>65%CD 20)，对肿瘤的生长有明显的抑制作用。+；图1.2E)和低(<1%)CD8+T细胞从肿瘤中获得的tcr序列表明tcrα/β的表达受到限制。+链子(附图)5)。来源于不同供体(HLA-A1、-A2、-A3)的小鼠脾脏T细胞均与黑色素瘤分化抗原的CD8肽反应，证实T细胞对黑色素瘤肿瘤的反应性(附图)。6)。为了进一步证实肿瘤的反应性，我们又使用了两批HLA-A2荷瘤小鼠，并证明CDR 3/TCR序列预测和暗示了脾脏对黑色素瘤分化抗原(Mart-1和gp 100)和肿瘤-睾丸抗原(MAGE 1和NY-ESO-1)的不同反应性。然而，在肿瘤中，我们发现CDR 3/TCR序列暗示对Mart-1具有限制性/克隆反应性。7)。从脾脏和肿瘤中获得的CDR 3序列对CMV或EBV相关抗原的非特异性反应性非常有限。其次，如果T细胞对肿瘤敏感，并有能力抑制肿瘤的生长，我们想知道荷瘤小鼠的治疗是否会受益于已知维持肿瘤浸润的CD8的抗pd-1治疗。+T细胞活性1,9,12。在建立的肿瘤模型中，具有相似CD8的胡氏小鼠。+T-细胞水平(模式，图.)2F抗Pd-1抗体对2种不同转移性黑色素瘤的生长有明显的抑制作用(WM 3629[HLA-A3]；图1)。2G和A 375[HLA-A2]；2H)与对照IgG或非重组NSG小鼠经抗Pd-1抗体治疗后的肿瘤生长相比较。两种肿瘤的免疫细胞浸润情况与IHC染色结果相似。在另一例转移性黑色素瘤(451路)中，抗Pd-1治疗对肿瘤生长的影响微乎其微(补充图1)。8)。45 1Lu黑色素瘤细胞IHC染色未见免疫浸润细胞。在患者中，肿瘤负担是抗pd-1治疗反应的一个限制因素。24。与患者的反应相似，我们在胡小鼠身上的结果也显示出对抗体治疗的异质性反应。

抗PD-1后肿瘤T细胞的异质浸润

其次，为了了解抗PD-1治疗后混合治疗反应的现象，我们用MassCytoF和RNA-seq对抗PD-1治疗后的荷瘤小鼠进行IHC、多重成像和RNA-seq，并与对照组小鼠进行比较。与对照组相比，抗PD-1治疗的Hu-小鼠肿瘤切片中的免疫浸润水平较高(见IHC染色；图1)。3A)。此外，CD4的分布也是不均匀的。+和CD8+接受抗PD-1治疗的小鼠肿瘤内的T细胞(如图所示)。3B，c和补充图。9)。部分肿瘤区CD8浸润不良。+T细胞和这可能已经导致了一种治疗抗药性的肿瘤，继续显示无限制的生长。用MassCytof和25种稀土金属标记抗体对肿瘤组织切片进行多重成像显示，CD8水平明显升高。+/颗粒酶(Gr)B+T细胞(图1.三维空间)使用ImageJ软件进行量化，并将其表示为饼图。CD8+/颗粒酶(Gr)B+T细胞具有效应记忆表型(CD45RO)。+；图1.3E[顶板])接受抗PD-1治疗的小鼠.CD8有选择性分布。+/颗粒酶(Gr)B+T细胞(图1.三维空间，右下2个面板)。此外，FOXP 3的存在有所增加+缺乏CD8区的Treg细胞+T细胞浸润(图.3E相同区域的HLAⅠ类表达也有明显下调，其表现为平均强度水平的差异(p=0.035099；图1。第三代[左面板，白色箭头]和图。3H)。这些观察是相似的，在另一个样本，用于细胞TOF染色。我们的观察结果进一步证实了FOXP 3的发现。+上调导致上皮癌HLA-Ⅰ类分子的抑制10。为了深入探讨HLAⅠ类表达的选择性下调机制，我们对抗PD-1抗体治疗和不抗PD-1治疗的Hu小鼠肿瘤进行了RNA-seq分析。

抗PD-1治疗后肿瘤浸润肥大细胞的研究

为了确定肿瘤细胞内的免疫表型，CiberSort分析25对rna-seq数据进行了分析，发现肿瘤内存在较高丰度的静止肥大细胞(如图所示)。4A和补充图。10A)和增加CXCL 10的表达。4B)在抗Pd-1治疗后获得的多个肿瘤标本中，表明趋化因子可能在这些细胞的动员中起着重要作用。免疫组织学染色证实，与对照组相比，接受抗PD-1治疗的Hu-小鼠肿瘤中肥大细胞水平显著升高(p=0.005407；图1。4C，d)。Cibersort分析显示，其他类型的免疫细胞类型包括单核/巨噬细胞、T-细胞和B-细胞在抗PD-1治疗的肿瘤中，而且这些细胞的表达水平在肿瘤之间是不均匀的(补充图1)。10A)。在所有肿瘤中，与中性粒细胞相关的基因表达相对较低(附图)10A)。进一步检查抗PD-1治疗后的肿瘤组织切片显示肥大细胞与FOXP 3共定位。+Treg细胞，一直被观察到并且非常重要(p=0.000047)与对照组相比(图1)。4E这可能与肿瘤细胞HLA I类的下调有关(如图所示)。3G，h，f)。为了使肥大细胞被肿瘤细胞所吸收，它们需要表达趋化因子受体。26,27，其中之一是CXCR 3。4G)，肿瘤浸润肥大细胞共表达CXCR 3(补充图)。11)，这在另一个肿瘤样本中是一致的。黑色素瘤可分泌CXCL 10。28，我们确实证实了它在肿瘤中的存在(图一)。4H)。CXCL 10与CXCR 3结合，而CXCR 3也存在于肥大细胞上。29,30这也是这些细胞大量浸润到肿瘤区域的可能原因之一。

免疫检查点治疗后肥大细胞的浸润

为了了解临床相关性，在肿瘤切片和对接受抗pd-1或免疫检查点治疗的黑色素瘤患者的三组独立RNAseq数据集的cibersort分析中，证实了肥大细胞的存在。12,31(无花果)5A-d)。在两例接受免疫检查点抑制剂的临床试验患者中，静息肥大细胞的丰度较高且有统计学意义(p=0.00001；GSE 123728和p=0.049；GSE 91061)。在另一个审判中32与抗PD-1治疗的患者相比，无反应患者肥大细胞的丰度增加。然而，由于参加本研究的患者人数较少，差异无统计学意义。除肿瘤浸润性静止肥大细胞外，肿瘤组织中还存在其他免疫细胞亚型。和以前一样，其他免疫细胞亚型在肿瘤中的分布是不均匀的(补充图)。10b-d).

肥大细胞耗竭改善抗pd-1治疗

如果肥大细胞与抗Pd-1治疗耐药有关，那么肥大细胞的耗竭将导致肿瘤生长的改变。肥大细胞被认为是c-kit受体阳性，人们可以通过小分子抑制剂的药物干预来靶向这些细胞。我们使用了sunitinib，这是一种多靶点的受体酪氨酸激酶抑制剂，包括c-kit受体，已知该受体可以耗尽肥大细胞和Treg细胞。33,34并采用抗PD-1药物治疗荷瘤小鼠。苏尼替尼与抗PD-1联合应用可使3/5小鼠肿瘤完全消退，而单用苏尼替尼治疗对肿瘤生长无明显影响(图一)。6A)。荷瘤小鼠接受苏尼替尼和抗PD-1联合治疗后，存活时间均大于48天，与接受苏尼替尼、抗PD-1或对照IgG组比较，差异有显着性意义(图一)。6B)。我们使用了伊马替尼，一种类似于苏尼替尼的药物，但对c-kit受体更有特异性，并发现当胡小鼠接受伊马替尼和抗PD-1联合治疗时肿瘤完全消退。伊马替尼对肿瘤生长无影响。同时，一种靶向VEGF和PDGF受体的药物西地拉尼(Cediranib)在抗PD-1治疗中未能引起肿瘤的完全消退。这并不令人惊讶，因为在实验中使用的黑色素瘤细胞株中VEGF或PDGF受体的表达很低到中等。与对照组相比，胡鼠脾脏肥大细胞减少，进一步证实了其他组对苏尼替尼作用的影响。33,34(无花果)6C，d)。显示肿瘤完全消退的Hu-小鼠在停止治疗后4周内没有复发的迹象，所有的Hu-小鼠都能够排斥显示记忆性T细胞反应的肿瘤。我们的结果提示肥大细胞与抗PD-1的治疗耐药有关.

肿瘤在逃避治疗反应中起着动态的作用。这是通过直接或间接利用肿瘤基质细胞进行治疗抵抗来实现的。1,4。已经确定了几种机制，包括改变和/或激活冗余信号通路，以及下调抗原递呈机制以逃避抗肿瘤特异性T细胞，所有这些都有助于耐药肿瘤细胞的复活。1,4。在最近的一项研究中，转化生长因子β被认为是驱动耐药表型和促进黑色素瘤mhcⅠ类下调的主要因素。35。我们和其他人已经证明肿瘤浸润的成纤维细胞、巨噬细胞和B细胞在治疗耐药性中具有重要作用。2,36,37。肿瘤浸润肥大细胞与乳腺癌和前列腺癌的治疗耐药性和肿瘤进展密切相关。38,39.

本研究结果提示肿瘤浸润肥大细胞和FOXP 3细胞的存在与肿瘤细胞HLA-Ⅰ类的下调有关，缺乏CD8。+T细胞在这些地区，并在有效的肿瘤杀伤和最终免疫逃逸后，抗PD-1治疗(模式图)。6E)。抗Pd-1治疗后，趋化因子的产生增加，肥大细胞浸润到肿瘤中。肥大细胞与FOXP 3的共定位+在肿瘤切片的选择性区域观察到Treg细胞可能导致局部的耐药性。FOXP 3的同时存在+Treg细胞和肥大细胞与HLA-Ⅰ类在肿瘤中的低表达有关。3E，f，h)。黑色素瘤细胞HLA-Ⅰ低表达与CD45RO浸润不良有关。+、CD8+、颗粒酶B+T细胞和肿瘤逃逸的可能原因，以及治疗的抗药性。苏尼替尼(Sunitinib)或伊马替尼(Imatinib)是包括c-kit在内的两种受体酪氨酸激酶抑制剂和抗PD-1抑制剂，两者的联合作用导致肿瘤完全消退，提示肥大细胞的耗竭对免疫检查点治疗反应是有益的。肥大细胞与抗PD-1治疗的结合需要更多的研究，这将为开发新的联合免疫治疗方法和小分子信号抑制剂治疗黑色素瘤患者提供新的方向和理论基础。

试剂

本研究中使用的抗体试剂清单载于补充表。1。关于用于组织细胞TOF多路成像的金属结合抗体面板，请参阅补充表。2并参考Wang等人。40.

组织和细胞系

人类黑色素瘤组织是根据宾夕法尼亚大学医院内部审查委员会(IRB)和费城Wistar研究所批准的知情同意程序获得的。胎儿肝脏和胸腺组织是根据知情同意获得的，这是由美国加州阿拉米达高级生物科学资源研究所和Wistar研究所批准的。人类黑色素瘤细胞系(A 375,451 LU，WM 3629)已经被详细描述过了。41简单地说，他们是从病人的肿瘤组织中分离出来的，在DMEM或RPMI 1640+DMEM或RPMI 1640培养基中培养成细胞系。L-谷氨酰胺和5%FBS。在用于任何实验之前，对所有细胞系进行支原体和短串联重复序列(DNA)的检测。

小鼠体内研究

所有的动物实验都是根据Wistar研究所的机构动物护理和用户委员会(IACUC)批准的协议进行的。NOD/LTSSCIDIL2Rγ零根据杰克逊实验室(00557)颁发的许可证，在wistar研究所近亲繁殖了小鼠(NSG)。所有的研究都是根据美国国家卫生研究所出版的“实验动物护理和使用指南”进行的。Wistar动物设施完全通过实验室动物护理评估和认证协会(AAALAC)和家畜实验研究协会的认证。小鼠在温度控制下(21°C~22°C)，湿度30~34%，12 h(上午6：00)和非光循环(下午6：00)。他们被安置在通风良好的一次性笼子里，里面有辐照过的玉米床上用品和单独的管道创新架。实验动物和对照动物都被饲养在同一个保持室，在无菌环境中无菌处理(Ⅱ类)，作为5只老鼠/单位笼社会笼，并以辐照食品颗粒和HCL水喂养。Wistar动物设施有一个质量控制计划，在每个控制室中，有5%的小鼠定期检测常见的小鼠病毒(仙台病毒、小鼠肺炎病毒、小鼠肝炎病毒、马洛病毒、reo病毒、淋巴细胞脉络膜炎病毒、外殖吸虫病毒、小鼠肺炎病毒、多瘤病毒、乳突病毒[1和2]、小鼠轮状病毒、小鼠细小病毒和小鼠诺拉病毒)、肺支原体和幽门螺杆菌。每个看台的哨兵被送到查尔斯河(马尔文，PA)进行诊断测试。兽医每周对所有老鼠进行三次监测。为实现人源化，从同一供体(孕18-22周)取胎肝和胸腺。雌性NSG小鼠(6-8周)接受胸腺移植(1-2mm)3)在骨髓切除后24h，用布地芬(30 mg/kg，I.P.；Sigma-Aldrich[B 2635]，St.Louis，MO)。随后立即注射自体肝源性CD 34。+造血干细胞(10例)5细胞/老鼠，I.V.；如图所示。1A)用与抗人CD 34结合的微珠子磁选。42(Miltenyi Biotec.，[130-046-703]，Auburn，CA)。6~8周后(>50天)，用18色bd lsrⅡ分析仪对人免疫细胞进行多色流式细胞术检测。2(BD生物科学)。应用编码人白细胞介素3、白细胞介素7和gm-csf的AAV 8小鼠，加速人免疫细胞的重建。43(感染该AAV 8的肝细胞株的裂解液在CD 34感染后6-7天显示出23-40 pg/ml的细胞因子)。+细胞注射(图1.1C和补充图。1A; 108(四)。所有来自无花果的老鼠。1D还接受了编码FLT 3、SCF、THPO(补充图)的质粒传递(胫前肌电穿孔；50-100μgDNA)。1B)。DNA质粒在AAV 8人细胞因子注射后6-7天开始释放。从接受DNA质粒的小鼠血清中检测到上述细胞因子20~60 pg/ml，持续3~4周，4周后逐渐消退。6~8周后(>50天)，用18色bd lsrⅡ分析仪对人免疫细胞进行多色流式细胞术检测。2(BD生物科学)。为此，在含锂和肝素的BD微保持器采血管中采集了100例颌下腺出血的μ1血。用ack裂解缓冲液(生命技术公司，Carlsbad，Ca)溶解红细胞，然后用FACS培养基(磷酸盐缓冲液、2%fbs和0.1%叠氮钠)进行一次洗涤，然后再悬浮在100μ1培养基中，并与一组氟铬共轭鸡尾酒抗体(补充表)共同孵育。1)30分钟。用洗涤一次去除多余的抗体，然后再将细胞悬浮在300μl FACS培养基中进行流式细胞分析，以确定人体免疫细胞类型的百分比。计数绝对计数珠(生命技术)是用来获得绝对淋巴细胞计数使用制造商的协议。为了区分活细胞和死细胞，细胞用DAPI(MP生物制剂，Solon，OH)染色。细胞用抗小鼠CD 45和抗人CD 45抗体染色，以区分小鼠和人细胞，并在人CD 45上设置人的所有亚群。+细胞(见附图。12选通策略)。当人CD 45在动物外周血中达到~25%(650-800个细胞/μ1)时，小鼠被认为是人源化的。所有重组小鼠按人免疫细胞水平分为实验组(CD 45)。+/CD8+90~120细胞/μ1)。小鼠皮下注射HLA-A等位基因黑色素瘤细胞(10只)5)在右翼。所有肿瘤一旦可触及就接受治疗(~100毫米)。3以抗Pd-1(10 mg/kg，1×周，5-6次注射)、Keytruda、Merck、Rahway、NJ抗体及相应的IgG抗体作为对照。选择小鼠口服苏尼替尼(每天20 mg/kg)、伊马替尼(50 mg/kg，每日)或西地拉尼(6mg/kg，每日)；所有药物口服灌胃，均从癌症治疗评估计划([CTEP]、NCI、贝塞斯达、MD)获得，或与抗PD-1抗体联合用药5~6周。显示肿瘤完全消退的胡小鼠被给予为期4周的药物假期，然后再用相同肿瘤细胞数量的一半进行再次攻击。荷瘤小鼠，肿瘤超过500 mm3每天监测肿瘤坏死或肿瘤大小超过2000 mm的小鼠。3按照Wistar IACUC指南进行安乐死。肿瘤每周用数字卡尺测量两次。

HLA分型

用GenJET基因组DNA纯化试剂盒(热Fisher[K 0722]，Waltham，MA)分离胎儿肝脏或黑色素瘤细胞基因组DNA。标准PCR采用以下HLA等位基因特异性引物(Coralville，IA)：HLA-A1前向5‘-ACA GAC TGA CCG AGC GAA和反向5’-CTC CAG GTA GAC GAC TCT CCG；HLA-A2前向5‘-GAC GGG GGG GAG ACA CGG AAA和反向5’-CAA gag CGC Gagg TCC TCT；HLA-A3前向5‘-CGG AAT GTG GTG CAG和反向5’-CAC C ACG GG GTG CCA；HLA-A9前进5‘-TCC ATG ATG TAG TTC和反向5’-CAA gag Gagg TCGGTCC TCT；B2微球蛋白正向5‘-CGA TAT TCA TCA GGT ACT和反向5’-CAA CTT TCA GCA GCT TAC；b-actin正向5‘-TGC TAT CCC TGT ACG CCT CT和反向5’-CCA TCT CTT GCT GGA AGT CC。PCR循环条件如下：初始变性步骤95°C 5 min，变性30次(95°C，30 s)，退火(56°C，30 s)，延伸(72°C，30 s)，然后在72℃下延长10 min。44。HLA A位点序列用SeCore试剂盒(1 Lambda)和应用生物系统3130 xl遗传分析仪(热Fisher)测定。采用HLA序列分析软件(UTYPEDx)进行分析和等位基因分配。

免疫染色

IHC染色按先前所述进行。2。组织切片经靶检液(Citate[S 1699]或Tris-EDTA缓冲液[S 2367]；Agilent-DAKO，Santa Clara，Ca)试剂盒在95℃孵育20 min后，与原抗体孵育20 min(FOXP 3[1：10]；CD4、HLA I类、HMB 45和肥大细胞类酶[均为1：100稀释]；CD 68[1：400稀释]和CD8[1：500稀释]；TCRγ/δ[1：50稀释])。检测原发抗体时，用抗小鼠抗体、抗大鼠抗体或抗兔抗体孵育，稀释倍数为1：1000，民建联(SK-4100)或AEC(SK-4200)；双载体实验室，Burlingame，CA)显色。用抗小鼠Qdot625在1：500稀释度下观察小鼠抗人TCRγ/δ的结合情况。

多重组织MassCytoF染色

细胞TOF染色如先前所述40。简单地说，无载体抗体是商业上获得的(补充表)。2)，用Fluidigm公司的MaxparX8金属共轭试剂盒标记镧系金属。R(201300，加拿大安大略省)。用Tris/EDTA缓冲液对95°C离体组织切片进行抗原提取30 min，冷却切片，用3%BSA-PBS溶液阻断，4°C与抗体混合物(100μ1)共同孵育，然后用PBS冲洗3×3，用1：400稀释液(Fluidigm 201192 B)在PBS中标记30 min。用水(3×)冲洗，风干30 min，用Fluidigm Hyperion成像系统采集图像质量细胞。

Rna-seq和Cibersort

用Zymo直接zol RNA微准备试剂盒(Zymo Research，[R 2073]Irvine，CA)从治疗前后(抗PD-1)小鼠脾脏、肿瘤组织和组织块中提取RNA。用ScriptSeq完整金盒(BG 1224；Illumina，Madison，WI)进行核糖体RNA缺失，用专利末端标记法生成定向文库。利用TAPestation 4200和生物分析仪2100系统(Agilent，Santa Clara，CA)对RNA和最终文库进行质量控制。利用KAPA库QantqPCR试剂盒(Roche，[KK 4835]Pleasanton，CA)对最终文库进行量化，并在Illumina公司的NextSeq 500上进行75 bp的配对高输出测序。用rsem v1.2.12软件进行rna-seq数据分析，用DESeq 2进行下游表达分析。45。标准化的rna-seq数据被用来枚举肿瘤浸润的白细胞，这是一种在线分析工具。25.

脾T细胞刺激

小鼠脾细胞(5×10)496井圆底微滴度板的每井，康宁，纽约)被刺激72h与各种黑色素瘤肽(补充图。S6传说)。所有制剂均在T细胞培养基[RPMI 1640]和GlutaMAX培养基(LifeTechnologies-Invitrogen，Carlsbad，CA)中添加5%FBS。孵育后，用活细胞进行RNA提取(见上文)，用Maxima First Strand cDNA合成试剂盒(热Fisher)进行cDNA合成。

实时PCR

简单地说，qPCR是使用应用生物系统公司的7500快速实时PCR系统和PowerSYBR绿色PCR主混合技术(LifeTechnologies)进行的。定制qPCR引物(补充表)3)，是从集成DNA技术公司(Coralville，IA)购买的。热循环条件为：95°C，15 min，15 s，95℃，1 min，60°C，实验一式三份，用平均值测定mRNA水平。根据生产厂家(应用生物系统7500软件v2.0)，采用比较CT法计算各mRNA的相对定量(RQ)和表达量。所有样本均归一化为内源性对照GAPDH。

T细胞受体序列分析

利用QIAseq免疫库构建了用于下一代免疫序列测序的TCR文库。试剂盒(IMHS-001Z人类TCR小组，QIAGEN，美国马里兰州)，旨在丰富tcrα，β，γ和δ亚单位。简单地说，从脾脏和肿瘤组织中分离到的RNA被用于tcr特异性cDNA的合成，通过针对恒定区的基因特异性引物富集tcr可变区，以及进行准确、敏感的tcr克隆型和库多样性评估的分子索引(UMIS)。最后的库是在Illumina的NextSeq 500上使用300周期的中期输出测序工具包进行测序的。Clonotype调用是使用IMSEQ软件生成的。46通过QIAGEN网络服务器(Https://qiagen.com)。UMIS的计数由至少三个读码支持作为相对TCR受体序列的测量。用Shannon-Wiener指数计算不同V-J克隆型的相对频率，绘制出相应的热图。