Shp 2阻断通过肿瘤细胞内、外机制增强抗肿瘤免疫

Shp 2是一种广泛存在的酪氨酸磷酸酶，参与调节肿瘤和免疫细胞信号。本研究发现SHP 2具有新的免疫调节功能。用SHP2抑制剂靶向该蛋白可促进抗肿瘤免疫，包括增强T细胞的细胞毒功能和免疫介导的肿瘤消退。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对SHP 2基因进行敲除，结果表明，针对癌细胞中的SHP 2参与了这种免疫应答。抑制SHP 2活性可增强肿瘤固有的IFNγ信号，增加趋化因子细胞因子的释放，增加细胞毒性T细胞的聚集，增加肿瘤细胞表面MHCI和Pd-L1的表达。此外，SHP 2的抑制降低了免疫抑制性髓系细胞在肿瘤微环境中的分化和抑制功能。在同基因小鼠模型中，Shp2的抑制增强了抗PD-1阻断剂的反应。总之，我们的研究揭示了SHP 2在肿瘤免疫中的新功能，并认为靶向SHP 2是一种很有前途的肿瘤免疫治疗策略。

免疫检查点抑制剂和car-T细胞疗法已经成为治疗癌症的有效方法。1,2。然而，大多数癌症患者对免疫疗法没有反应，因此需要新的治疗方法。3。通过实验和临床探索，启动了许多临床试验，将免疫检查点阻断与放射和化疗等靶向和常规疗法结合起来。4。靶向治疗，包括针对CDK 4/6的细胞周期抑制剂5,6，MAP激酶信号抑制剂7以及针对EZH 2、HDAC和DNMT的染色质修饰酶抑制剂。8,9,10,11，已证明有利于抗肿瘤免疫反应和免疫治疗的有效性，在临床前癌症模型。研究靶向治疗对抗肿瘤免疫的影响，是合理推进综合疗法设计以改善患者预后的关键。

Src同源性-2结构域磷酸酶2(Shp2)，由该基因编码。PTPN 11，是一种广泛表达的非受体酪氨酸磷酸酶，在多种受体酪氨酸激酶(Rtks)下游的信号转导中起着调节作用，如EGFR、fgr和met。12,13。Shp 2通过促进RAS的GTP负载促进癌细胞的增殖和存活14，从而激活RAS-MAPK信号。选择性变构抑制剂SHP 099对RTK/KRAS诱导的肿瘤的抑制作用15,16。除了在癌细胞中发挥致癌作用外，SHP 2还参与免疫细胞的多种信号通路。在T淋巴细胞中，SHP2被招募到pd-1和ctla-4的胞质尾，并通过去磷酸化tcrζ链、ZAP 70和共刺激受体CD 28抑制T细胞活化。17,18,19,20。除这些分子机制外，SHP 2在肿瘤微环境中的作用尚不清楚，其在抗肿瘤免疫中的作用仍有待探索。小鼠结肠移植模型中SHP 2的T细胞限制性消融通过增强CD8细胞毒性T细胞的功能增强抗肿瘤免疫反应21。然而，在另一项研究中，选择性缺失CD4和CD8 T细胞中的SHP2最终导致黑色素瘤的进展和转移。22。Shp 2也是csf-1信号通路的下游，促进巨噬细胞增殖和M2极化，提示shp2抑制增强抗肿瘤免疫的另一机制。23,24,25。鉴于肿瘤微环境的复杂性以及SHP 2在肿瘤细胞信号转导中的重要作用，有必要研究抑制肿瘤细胞和免疫细胞中SHP 2活性的作用，以更好地了解其治疗潜力。

在本研究中，我们发现SHP 2在肿瘤与免疫细胞的相互作用中具有免疫调节作用，并且发现抑制SHP 2功能会引起肿瘤微环境的良好改变和肿瘤进展的控制。在癌细胞中，SHP 2抑制增强干扰素γ(IFNγ)信号，使其下游靶点表达增加，包括趋化因子和抗原提呈机制。Shp 2抑制还通过抑制肿瘤细胞和免疫抑制性髓系细胞促进T细胞的增殖和功能。此外，SHP 2抑制剂与抗PD1抗体的结合导致了在同基因小鼠模型中肿瘤生长的显著回归。

我们的研究描述了与抑制肿瘤细胞SHP 2相关的免疫表型和肿瘤微环境，支持在分子和表型多样的恶性肿瘤患者中治疗性抑制SHP 2活性的前景。

抑制肿瘤细胞内Shp 2增强免疫细胞介导的肿瘤杀伤作用

为了探讨SHP 2在体外的免疫调节作用，我们优化了一种肿瘤球体-PBMC共培养(附图)。1a)。肿瘤球体形态保留了一些与肿瘤微环境有关的生理特征，如氧和细胞增殖梯度。26, 27。此外，在与活化T细胞共培养的背景下，有利于免疫细胞浸润的研究。首先，我们检测了SHP 099在人卵巢癌细胞株OVCAR-8中与新鲜分离的人外周血单个核细胞(PBMCs)共培养。在无PBMC刺激的情况下，共培养无肿瘤杀伤现象(附图)。1b)。我们用抗CD3/CD 28微球激活PBMC，以模拟肿瘤抗原对T细胞的激活。活化后，CD3阳性T细胞在6天内扩增，成为主要免疫群体(附图)。1c，d)。活化的PBMCs与OVCAR-8球体孵育时，肿瘤细胞有明显的杀伤作用(图1)。1a)。为了评估SHP 2在这一过程中的作用，我们用SHP 099对共培养的球体进行了处理，发现它在6天后，完全在活化的T细胞存在的情况下，以剂量依赖性的方式减少了肿瘤细胞的数量(如图1所示)。1a)。OVCAR-8细胞对SHP 2的抑制不敏感，尽管有有效的靶点参与和信号传导抑制(图二)。1A，c和附图1e)。因此，在共培养中观察到的表型归因于免疫细胞介导的肿瘤杀伤.TNO 155，一种目前正在临床发展中的SHP2变构抑制剂，也观察到了同样的表型。1(d-f)虽然我们观察到不同供体的T细胞在基线杀伤上的差异，但SHP 2抑制剂治疗后所观察到的表型是可复制的(图一)。1B，e)和一致的一个小组的癌细胞株(补充图。2(a-d)B2M敲除抗原提呈机的消融对免疫介导的肿瘤杀伤没有影响(附图)。2(E)，表示没有异基因反应。

为了探讨抑制癌细胞中SHP 2对免疫介导的杀伤的特异性作用，我们采用了多西环素诱导的SHP2基因敲除策略。两个单一导向RNA(SgRNAs)靶向性PTPN 11将其导入OVCAR-8细胞，构成性表达CaS 9蛋白。OVCAR-8-Cas9-sgPTPN 11-1和2个细胞池显示了显著的敲除效率(补充图)。2f)。然后，在多西环素存在或不存在的情况下，与PBMC共同培养池。在多西环素处理的共培养物中观察到增强免疫介导的肿瘤杀伤作用，利用来自3个不同供体的pbc细胞，表明癌细胞中shp 2的缺失使它们对免疫介导的杀伤敏感(图1)。1g)。为探讨在免疫细胞室特异性抑制SHP 2的作用，我们在OVCAR-8中体外表达了多西环素诱导的SHP 099-非靶向SHP2突变体SHP2-T253M/Q257L，并与PBMC共培养。由于SHP-2-T253M/Q257L高表达的癌细胞在SHP 099存在的情况下仍能维持MAPK信号的激活，因此我们认为SHP 099在此背景下的作用主要在免疫细胞中(附图)。2g)。SHP 099治疗后，SHP 2突变体在癌细胞中的表达显著减弱了免疫介导的肿瘤杀伤作用(图1)。1(H)提示抑制肿瘤细胞SHP 2的表达是SHP 099增强T细胞杀伤肿瘤细胞的关键。但值得注意的是，SHP 2突变体的过度表达并不能完全挽救肿瘤的表型，提示在免疫细胞中抑制SHP 2的表达也可能导致肿瘤细胞的体外杀伤。

肿瘤细胞中Shp 2的抑制促进T细胞增殖/功能

在OVCAR-8细胞存在或不存在的情况下，我们进一步评估了SHP 2抑制对T细胞增殖的影响。用羧荧光素琥珀酸酯(CFSE)预标记PBMC，用流式细胞仪(FACS)分析细胞分裂情况。在OVCAR-8细胞存在的情况下，SHP 2的抑制显着地促进了多个供体细胞在共培养中的T细胞增殖(如图1所示)。2(a-c)我们还观察到在SHP 099处理的共培养中，颗粒酶B在CD8 T细胞上的表达增强。2F和补充图。3g)。这进一步提示SHP 2的抑制增强了细胞毒性T细胞的杀伤能力。

在没有肿瘤细胞的情况下，SHP 2抑制(SHP 099)可使T细胞增殖减弱，而TNO 155的T细胞增殖不受影响。(补充图。3(a-d)据报道，shp 2是pd-1和ctla-4等免疫检查点信号的下游介质，其作用机制是去磷酸化CD 28和zap 70，从而阻止tcr介导的MAPK信号激活。17,18,19,20...提示SHP 2抑制可能减轻检查点信号的免疫抑制作用，激活MAPK通路，促进T细胞增殖。但SHP 099处理后T细胞MAPK信号没有明显增强(附图)。3(E)提示SHP 2的抑制并不能通过MAPK途径促进T细胞的增殖。我们观察到只有在肿瘤细胞存在时，SHP 2才能增强T细胞的增殖，说明SHP 2对T细胞的作用是相互依赖的。

我们推测，在共培养的肿瘤细胞中抑制SHP 2活性可能介导T细胞表型。事实上，多西环素引起的肿瘤细胞SHP2的缺失在共培养中促进了T细胞的增殖。2D和补充图。3f)。SHP 099与表达SHP 2突变体的OVCAR-8共培养时，T细胞增殖无明显影响。2e)。

综上所述，这些数据表明，靶向肿瘤细胞中的SHP2促进T细胞增殖和肿瘤细胞的杀伤，提示SHP 2可能在抗肿瘤免疫中具有重要作用。

Shp 2抑制CXCR 3配体的表达促进体外免疫浸润

为了探讨SHP 2抑制诱导的抗肿瘤免疫机制，我们在SHP 099存在或不存在的情况下，对OVCAR-8癌细胞进行了单细胞RNA测序(ScRNAseq)。4a，b)。我们发现，与SHP 099共同培养时，三种趋化细胞因子CXCL 9、CXCL 10和CXCL 11在肿瘤细胞中的表达增加，CXCL 10的表达量和表达量最显著(图1)。3a，b)。通过对共培养条件培养基的Luminex细胞因子分析，我们证实了scRNAseq在蛋白质水平的数据。SHP 099/TNO 155共培养可促进CXCL 10的分泌。3c)。后续ELISA分析证实了这一观察(补充图)。5a)。另外，在MIA Paca-2-PBMCs共培养中，SHP 2抑制了CXCR 3配体CXCL 9和CXCL 10的表达，提示通过抑制SHP 2上调趋化细胞因子可能是肿瘤微环境中常见的表型(附图)。5b)。

为了鉴定CXCL 10的细胞来源，我们进行了细胞内CXCL 10染色，然后进行FACS分析。SHP 099/TNO 155单独作用于CD 45阴性肿瘤细胞共培养时CXCL 10表达上调，而免疫细胞中未见CXCL 10上调，与scRNAseq数据一致(见图)。3d)。

CXCL 9、CXCL 10和CXCL 11是表达CXCR 3的抗肿瘤白细胞的趋化细胞因子，如效应T细胞。28。通过光片荧光显微镜观察肿瘤球内免疫细胞浸润情况，探讨抑制SHP 2对体外免疫细胞迁移的影响。肿瘤球体体积随着时间的推移而缩小，可能是由于免疫细胞介导的杀伤(附图)。5c)。与图中的数据一致。1在共培养的第3天和第6天，与对照组相比，SHP 099治疗后肿瘤球体较小(补充图1)。5c，d)。为了避免肿瘤球体大小的改变对免疫浸润定量的影响，我们在24小时后测定了SHP 099对肿瘤细胞浸润的影响，由于大多数免疫细胞仍围绕着肿瘤球体表面，可见SHP 099处理促进了免疫细胞向肿瘤内的浸润(见图)。3E，补充电影1和补充电影2与对照组相比，SHP 099处理的球内浸润免疫细胞的数量几乎是对照组的两倍(图1)。3f)。进一步分析将肿瘤球体分为三个区域，其中90%以上的浸润免疫细胞位于球体的外层和中层，共培养24h后可达到预期的效果。SHP 099处理增强了免疫细胞在两层的浸润(见图)。3g)。在TNO 155处理的肿瘤球体中也观察到相同的表型(如图所示)。3H，i)。

Shp 2通过干扰素γ信号转导介导抗肿瘤免疫

从scRNAseq数据集，我们比较了共培养组和单纯肿瘤组的肿瘤细胞的转录谱。作为补充图。4C显示，各组肿瘤细胞均表现出各自的聚类特征(共培养组肿瘤细胞在0、2、4、5、6、7组；肿瘤组在第1、3组肿瘤细胞中)。对共培养的肿瘤细胞的进一步分析表明，SHP 099处理的肿瘤细胞在第6组中有特异性的聚集(附图6)。4C，右)。对第6组肿瘤细胞的路径特征分析表明，细胞因子介导的信号通路和淋巴细胞增殖/活化途径是前10位上调信号通路，这与我们从图中得到的结果是一致的。2和3(补充图。4d)。此外，干扰素信号在SHP 099处理的肿瘤细胞中多次出现上调信号(补充图)。4D)，提示干扰素通路参与SHP 2抑制介导的免疫应答。

CXCL 10和其他趋化因子是干扰素γ通路的转录靶点，它们在肿瘤中的表达往往与免疫检查点阻断的临床反应有关。29,30,31。我们用scRNAseq数据描述了肿瘤细胞干扰素γ信号通路中基因表达的变化。4a)。值得注意的是，在肿瘤细胞共培养过程中，SHP 2特异性抑制细胞因子(CXCL 9、CXCL 10、CXCL 11和CCL 5)和抗原提呈机制(HLA-A、HLA-B和B2M)上调了大量的干扰素γ标志基因。4a)。其次，我们对共培养条件培养液中干扰素γ的浓度进行了定量测定.如预期的那样，干扰素γ仅在T细胞刺激下才能检测到，共培养物中干扰素γ的总量显著高于仅刺激了PBMC的培养物(补充图)。6a)。SHP 099处理不能提高免疫细胞的干扰素γ分泌，无论是在共培养还是单用PBMC(补充图)。6a，b)。我们假设癌细胞中的SHP 2阻断剂能增强其对干扰素γ的反应，并在SHP 099或TNO 155存在下检测OVCAR-8肿瘤球体对重组人干扰素γ(rhIFNγ)的反应。RhIFNγ治疗后SHP 099和TNO 155均上调CXCL 10分泌(图1)。4B和补充图。6此外，SHP 2阻断降低了影响OVCAR-8细胞活力所需的rhIFNγ的剂量，说明SHP 2抑制肿瘤小球对IFNγ致敏。4C和补充图。6d)。

干扰素γ下游信号是通过JAK-STAT途径介导的。32。考虑到SHP2通过去磷酸化STAT 1来负调控JAK-STAT通路33,34在SHP 099存在或未加入rhIFNγ的OVCAR-8细胞中，我们进行了Westernblots检测STAT 1磷酸化的研究。我们发现，SHP 099在阻断p-ERK激活的同时，上调了rhIFNγ-诱导的STAT 1磷酸化。4d)。

此外，我们击倒了IFNGR 1在OVCAR-8。几乎75%的IFNGR 1蛋白在细胞池中被耗尽(补充图)。6e)。在共培养条件下，shp 099存在时肿瘤细胞的杀伤作用显著减弱。IFNGR 1击倒OVCAR-8(图1.4e)。这支持了这样的假设：SHP 2可能通过负调控IFNγ信号增强肿瘤细胞对免疫介导的杀伤的抵抗力，而SHP 2的阻断可能起到释放这种抑制的作用。

Shp 2抑制增强主要组织相容性复合体(Mhc)Ⅰ类和程序性死亡配体1(pd-l1)蛋白在癌细胞中的表达。

ScRNAseq数据显示，SHP 099在共培养的肿瘤细胞中，抗原处理和表达基因被上调(如图所示)。4a)。在FACS测量的蛋白质水平上也是如此(图1)。5a)。RhIFNγ治疗OVCAR-8球体时，HLA-ABC蛋白呈剂量依赖性上调，SHP 2抑制可显著增强其在癌细胞中的表达(图一)。5b)。击倒IFNGR 1在OVCAR-8细胞中，SHP 099处理可减轻MHCⅠ类细胞在共培养中的上调作用(图1)。5C和补充图。7a)。此外，基因敲除PTPN 11在肿瘤细胞共培养中，MHCⅠ类表达增强，而肿瘤细胞中耐药SHP2突变体的外源性表达在SHP 099处理时未能上调肿瘤MHCⅠ类的表达(如图1所示)。5D和补充图。7(B)证实SHP 099增强肿瘤细胞内的干扰素γ信号是由于对SHP 2的靶抑制所致。抗原表达缺陷与对T细胞介导的肿瘤杀伤耐药有关。35,36,37因此，SHP 2阻断剂对肿瘤细胞MHCⅠ类表达的上调，为将SHP 2抑制与免疫治疗相结合提供了理论依据。

肿瘤细胞利用pd-l1的免疫抑制功能逃避宿主免疫系统38,39。T细胞衍生的干扰素γ通过JAK-STAT信号通路对pd-L1在癌细胞中的表达进行了正调控。40。我们观察到与活化的PBMCs共培养时，Pd-L1在肿瘤细胞中的表达上调，SHP 2的抑制进一步增强了Pd-L1的表达。5E和补充图。7c)。Shp 2的抑制也增强了rhIFNγ-诱导的OVCAR-8球体PD-L1的上调(图1)。5F和补充图。7(D)。干扰素γ信号转导被证实。IFNGR 1在OVCAR-8中敲除(图8)。5G和补充图。7e)。同样，击倒PTPN 11在肿瘤细胞中，pd-L1在共培养中的表达增加(如图所示)。5(H)；相反，通过过度表达SHP 2突变体受损的SHP 099诱导的PD-L1上调来保护肿瘤细胞(附图)。7f)。

Shp 2抑制降低4T1同基因小鼠模型的肿瘤负荷

为了研究SHP 2抑制对小鼠体内肿瘤免疫功能的影响，我们采用了小鼠4T1乳腺癌模型。用SHP 099处理的小鼠肿瘤生长明显减弱，呈剂量依赖性(如图所示)。6a，b)。为了了解这种效应是否需要完整的免疫系统，我们将4T1细胞植入免疫受损的NSG小鼠，并用SHP 099治疗。SHP 099治疗对4T1的生长有轻微的剂量依赖性作用，表明SHP 2抑制也能减缓免疫受损小鼠的4T1肿瘤生长(补充图)。8a，b)。用ΔT/ΔC公式在各模型内归一化SHP 099治疗数据时，4T1同基因模型的高剂量SHP 099(100 mg/kg)显示ΔT/ΔC较小(26.83%vs 50.01%)，说明SHP 099对4T1同基因模型的免疫功能增强(如图1所示)。6A和补充图。8a)。总之，SHP 099治疗引起的4T1模型肿瘤生长缓慢可能至少部分归因于增强的抗肿瘤免疫。

为探讨SHP2抑制体内抗肿瘤免疫的机制，我们采集肿瘤组织，进行免疫组织化学和流式细胞术分析，分析其免疫表型。我们观察到在SHP 099处理的肿瘤中CD8 T细胞增加，这与SHP 099共培养时增强免疫细胞浸润相一致(见图)。6c，d)。治疗后CD4 T细胞百分比和数量不变(附图)。8c，d)。此外，SHP 099治疗显著增强CD8 T细胞的增殖和活化，也符合体外数据(图一)。6E，f)。IHC染色证实在SHP 099治疗后，CD8 T细胞在4T1肿瘤组织中明显浸润(见图)。6g)。为了探讨IFNγ信号在SHP 099治疗肿瘤体内是否有增强作用，我们检测了肿瘤组织MHCI和Pd-L1的表达。我们观察到在蛋白质水平上表达增加的趋势(如图所示)。6H，i)。在转录水平上，我们观察到在较低剂量下SHP 099处理的肿瘤中表达显著增加(补充图)。8(e-g)此外，CXCR 3配体Cxcl 9和Cxcl 11SHP 099治疗组mRNA表达也有增强趋势(附图)。8H，i)。为了进一步阐明SHP 2阻断剂对干扰素γ信号转导的调节作用，我们在NSG小鼠体内利用人骨尤文肉瘤细胞RD-ES和人PBMCs过继转移。SHP 099治疗可在人免疫细胞存在的情况下上调RD-ES肿瘤中IFN-γ通路信号基因的表达(补充图)。8(k-r)

总之，我们的体外和体内数据表明，SHP 2的阻断增强了干扰素γ信号在肿瘤中的作用，并通过细胞毒性T细胞的募集和激活来触发抗肿瘤免疫。

4T1同基因小鼠模型中肿瘤细胞的Shp 2抑制对T细胞功能的促进作用

为了了解抑制癌细胞中shp 2对体内抗肿瘤免疫的特异性作用，我们直接电穿孔cas 9蛋白和靶向sgRNA，敲除了4t1细胞中的shp 2。PTPN 11转化为4T1细胞，建立了4t1-Cas9-sg同基因模型。PTPN 11细胞池，显示了巨大的敲除效率(补充图。9a)。肿瘤细胞中的Shp 2基因敲除显着地延缓了肿瘤的生长，但不如SHP 099(100 mg/kg)治疗有效(图1)。7a，b)。ΔT/ΔC分析表明，与SHP 099相比，靶向SHP 2对肿瘤细胞的抗肿瘤免疫作用较弱。7(A)提示SHP 099介导的抗肿瘤作用也可能是通过抑制免疫或基质细胞中的SHP 2来实现的。

肿瘤组织免疫图谱分析表明，4T1细胞靶向SHP2后，肿瘤CD8 T细胞增多，这与SHP 099的治疗效果有关(图1)。7c)。4T1细胞SHP 2基因敲除促进了4T1同基因模型中CD8 T细胞的增殖和活化，与体外实验结果一致。7d，e)。此外，当SHP 2基因被敲除时，我们观察到Pd-L1在4T1细胞中的表达有增加的趋势。7(F)提示肿瘤细胞SHP 2缺失增强了IFNγ信号。肿瘤细胞SHP 2基因敲除与SHP 099联合治疗对T细胞功能和干扰素γ信号的调节作用更为显著。7(c-f)

总之，我们的体内遗传数据证实了我们的观察使用药物抑制SHP2，并进一步提示，SHP 2抑制肿瘤细胞可促进抗肿瘤免疫。然而，除了靶向癌细胞外，SHP 099还需要其他抑制作用来更有效地降低肿瘤负荷。

Shp 2阻断对免疫抑制性髓系细胞的抑制作用

未成熟髓系细胞的分化在癌症中常被调控失调，导致免疫抑制性髓系细胞的积累，从而促进癌症的进展。41。据报道，shp2抑制使肿瘤微环境中极化巨噬细胞数量发生明显变化，有利于抗肿瘤免疫。42。我们在4T1同基因小鼠模型中观察到SHP 099处理组CD 45+免疫细胞的剂量依赖性下降(附图)。9b)。进一步的分析表明，这一效应的主要原因是CD11b+髓系细胞减少(如图所示)。8a)。SHP 099对CD3+淋巴细胞总数无影响(附图)。9c)。使用4t1-sgPTPN 11同基因小鼠模型证实，SHP 2阻断对CD11b+髓系细胞的抑制作用是通过直接靶向髓系细胞来实现的，因为SHP 2在肿瘤细胞中的抑制作用不影响髓系细胞。8B和补充图。9E，f)。

我们分析了SHP 099治疗对肿瘤浸润髓系细胞亚群的影响。髓源性抑制细胞(MDSC)是一组异质的免疫细胞，包括单核细胞(MMDSC)和粒细胞(GMDSC)。这两种细胞在荷瘤小鼠和癌症患者体内积累，对肿瘤免疫抑制的微环境有一定的促进作用。43。我们观察到在SHP 099治疗的肿瘤中，gMDSCs和mMDSCs的总数显著减少，而在高剂量SHP 099治疗的肿瘤中，gMDSCs所占的比例下降(图一)。8C-e和附图。9(F)，提示SHP 2的抑制作用影响MDSCs的分化。肿瘤相关巨噬细胞(TAMS)存在于肿瘤微环境中，影响肿瘤的形成、生长和转移。44。在多种刺激下，巨噬细胞可分化为抑癌m1和促癌M2。45。我们发现，SHP 099治疗可显著降低M2样巨噬细胞的百分比，而不影响M1-巨噬细胞(图1)。8F和补充图。9g)。同样，在肿瘤细胞中特异性敲除SHP 2不能使SHP 099引起的免疫抑制性gMDSCs和M2样巨噬细胞减少，提示SHP 099对髓系细胞有直接的抑制作用(图1)。8G，H和附图9h)。

为了更好地了解shp2抑制对mdSCs的影响，我们从健康供者全血中分离出CD 14+单核细胞，并通过gm-csf和IL-6刺激诱导其分化为免疫抑制型mdSCs。41在分化过程中，用DMSO或SHP 099处理单核细胞。GM-CSF和IL-6诱导近90%的细胞分化为MDSC表型，而SHP 099处理以剂量依赖性的方式显著抑制分化，提示抑制SHP 2对髓系分化有直接影响(图1)。8i)。6天后，收集MDSCs，以1：2的比例(MDSCs：T细胞)与CFSE标记的活化T细胞共培养。共培养5d后用流式细胞仪(FACS)检测T细胞增殖。在对照组共培养中，MDSCs可抑制T细胞增殖.这种效应被SHP 099治疗后部分逆转(见图)。8j)。这些结果表明，SHP 2的抑制可能通过抑制单核细胞分化为MDSCs的能力和损害MDSCs的免疫抑制功能而增强抗肿瘤免疫功能。

Sp2抑制显示PD1阻断的联合效应

临床上pd-l1高表达与肿瘤免疫逃逸及预后不良有关。46,47,48。免疫检查点的抑制，特别是PD1的阻断，彻底改变了临床肿瘤学的实践。49,50,51。在体外和体内，SHP 2抑制肿瘤Pd-L1的表达，这可能是影响该治疗效果的一个潜在障碍。抗人PD1抗体与SHP2抑制剂联合应用对OVCAR-8球形细胞与活化PBMCs共培养具有增强免疫细胞介导的肿瘤杀伤作用，而PD1抗体无单一作用(补充图)。10a，b)。阻断SHP2与抗PD1协同抑制小鼠同基因CT26结肠癌模型的肿瘤生长(图1。9a)。在MC 38结直肠癌模型中也观察到了联合效应。9(B)虽然，抗PD1的单剂抗肿瘤作用存在差异(图1)。9C和补充图。10d)。与对照组相比，SHP 2抑制剂(TNO 155或SHP 099)对MC 38同基因小鼠的肿瘤生长有明显的抑制作用(图1)。9B，c和附图。10d)。MC 38肿瘤细胞携带G503V突变，对SHP2的直接抑制不敏感。PTPN 11基因。我们用SHP 099治疗MC 38肿瘤并检测Dusp 6的表达，证实了这一点。Dusp 6是由SHP 2(补充图2)正调控的基因。10c)。事实上，SHP 099/TNO 155治疗对免疫受损的NSG小鼠MC 38异种移植物的生长没有明显的抑制作用(补充图)。10E，f)，提示免疫细胞中SHP 2的抑制有助于降低MC 38同基因小鼠模型的肿瘤负荷。

接下来，我们分析了来自MC 38肿瘤的肿瘤浸润免疫细胞。与4T1模型相似的是，SHP 099/TNO 155治疗后肿瘤浸润的CD 45+细胞明显减少，与PD1抗体的结合进一步降低了CD 45+细胞的百分率(补充图)。10g)。我们还观察到，这些治疗不影响CD4+T细胞的数量，但增加CD8+T细胞的百分比，只有在TNO 155+抗-PD1联合臂(图一)。9D和补充图。10h)。与4T1模型不同，单用SHP 2抑制并不能增强MC 38同基因模型中肿瘤浸润的CD8+T细胞。9(D)提示靶向性肿瘤内信号参与CD8+T细胞向肿瘤微环境的募集，提示MC38对SHP2抑制剂不敏感。阻断SHP 2和PD1对减少CD11b+髓系细胞有联合作用(图1)。9E)，这可能是肿瘤中CD 45+免疫细胞减少的原因之一。SHP 099/TNO 155联合免疫检查点阻断后，免疫抑制性髓系源性gMDSCs和mMDSCs的百分比均显著降低(图1)。9F，g)。与免疫抑制的M2巨噬细胞相比，该组合还有效地提高了促进免疫的M1巨噬细胞的比率(图1)。9h)。

总之，这些数据表明，SHP2抑制与免疫检查点阻断联合通过靶向肿瘤微环境中髓系免疫抑制细胞来增强抗肿瘤免疫，有可能导致T细胞介导的肿瘤细胞杀伤。

抑制磷酸酶SHP2对依赖受体酪氨酸激酶和突变KRAS信号的肿瘤具有治疗作用，因为SHP2在介导癌细胞MAPK信号转导中起着关键作用。15,16...本研究利用肿瘤球与人免疫细胞的体外共培养和体内同基因小鼠模型，发现抑制SHP 2的活性通过对肿瘤细胞和免疫细胞的共同作用而改变肿瘤微环境的细胞组成，从而促进抗肿瘤免疫。

在体外，SHP 2抑制可增强T细胞介导的肿瘤杀伤和T细胞增殖/活化。SHP 099/TNO 155通过靶向肿瘤细胞SHP 2和在肿瘤免疫细胞串扰背景下增强肿瘤细胞干扰素γ信号而诱导上述效应。在体内，SHP 2的抑制还通过促进细胞毒性T细胞功能和抑制免疫抑制性髓系细胞而增强肿瘤干扰素γ信号，并表现出抗肿瘤活性。

在癌细胞中，SHP 2的抑制通过增强JAK-STAT信号增强对干扰素γ的应答.因此，包括CXCL 9、-10和-11、MHCI和PD-L1在内的干扰素γ通路靶点在转录水平和蛋白质水平都被上调。干扰素γ信号通路的缺陷导致临床前和癌症患者对T细胞介导的肿瘤杀伤产生耐药性。35,52,53。在本研究中，我们通过敲除干扰素γ受体IFNGR 1来证明干扰素γ信号在肿瘤模型中的重要性；我们观察到T细胞介导的肿瘤杀伤作用，以及mhcⅠ类蛋白在共培养中的表达减弱。Pd-L1在肿瘤细胞表面的表达是一种抗肿瘤免疫的负反馈机制。临床上，pd-l1在肿瘤微环境中的高表达与pd1拮抗剂对免疫检查点阻断的反应呈正相关。38,39。由于SHP 2的抑制增强了Pd-L1在与T细胞共培养过程中的表达，我们将SHP 2阻断与免疫检查点的抑制结合起来，显示出抗肿瘤免疫和延缓肿瘤生长的联合作用。这就提高了SHP 2的治疗抑制作用与检查点阻断相结合的可能性，从而提高了临床治疗效果。

体外MDSC分化和T细胞-MDSC共培养实验表明，SHP 2的抑制通过抑制髓系细胞的免疫抑制作用而直接影响髓系细胞。我们还观察了SHP2抑制对4T1和MC 38模型小鼠骨髓细胞亚群的调节作用。SHP 2抑制肿瘤微环境中免疫抑制性巨噬细胞和MDSCs的表达。根据这些观察，我们推测SHP 099/TNO 155在体内对髓系细胞的调控可能有助于抑制肿瘤的生长。

总之，我们的数据表明，SHP 2抑制是有效的控制肿瘤的生长，通过加强免疫监视和杀死癌细胞。我们建议通过以下途径实现这一目标：(A)在癌细胞中扩增干扰素γ信号。54(B)促进肿瘤细胞分泌趋化因子；(C)增加肿瘤细胞的抗原呈递；(D)积极调节CD8 T细胞的增殖和功能；(E)抑制免疫抑制性髓系细胞对抗肿瘤T细胞的作用。

根据已发表的研究成果和本研究提供的数据，我们认为通过直接抑制癌细胞生长和促进抗肿瘤免疫，抑制肿瘤患者SHP 2活性具有潜在的治疗价值。