不同的机制控制着p5 3在与不同细胞命运相关的靶基因上的基因组识别

抑癌基因p53通过选择性地启动几种可能的转录产物之一，整合应激反应通路，从而触发细胞命运决定(如细胞周期阻滞、凋亡)。这个过程的基础是四聚体p53与基因组中的20 bp反应元件(RRRCWWGYYYN)的结合。0-13(RRRCWWGYYY)。一般来说，在细胞周期阻滞的目标区域(如：p21)的亲和力高于凋亡靶点的亲和力(例如，bax)。然而，RE序列的代码背后的选择性仍未破译。在此，我们通过显示编码的关键决定因素嵌入DNA形状来确定p53与高亲和力和低亲和力区域结合的分子机制。我们进一步证明，在RE的第3、8、13和18位置，由G/C或A/T BP编码的小/主要沟宽的差异通过诱导不同的Arg 248和Lys 120构象和相互作用，决定了不同的p53 DNA结合模式。在体内通过bax RE的基因组编辑证实了该编码的预测能力，以相互转换dna结合模式、转录模式和细胞命运结果。

为了应对不同形式的压力，抑癌基因p53选择性地诱导了一系列不同的转录程序之一，每个转录程序都与一个独特的生物学结果相关(如细胞周期阻滞、凋亡、DNA修复、萎缩)。1,2。这个过程的中心事件是四聚体p53与RRCWWGYYYN一致序列基因组中的调控dna基序(即反应元件)的结合。0–13RRCWWGYY(R=A或G，W=A或T，Y=C或T，N=任何碱基)3,4。针对这一初步步骤，流行的模型认为p5 3具有剂量依赖性的靶基因激活，与细胞周期阻滞靶点相关的RES具有较高的亲和力，与促凋亡的靶标有较低的亲和力。5,6,7。这提供了一个概念上令人满意的模型，在这个模型中，DNA损伤轻微的细胞会诱导低水平的p53蛋白，只有在高亲和力区域才能结合，从而为细胞在进入细胞周期之前修复其基因组提供了机会。然而，如果dna的损伤程度超过了细胞的修复能力，就会产生足够高数量的p53，甚至与促进凋亡的靶基因相关的低亲和力的Res也会被占据和激活。

以前曾有人提出，在给定的RE中，不匹配bps的数目决定了它的结合亲和力。8,9。然而，同样数量错配的RES与p53仍有不同的亲缘关系，这表明超出共识错配程度的机制是造成这一现象的原因。这在生理上是相关的，因为在体内2183中只有10%的p5 3 res与所有20 bps的一致序列相匹配。10。P53 Res在位于核心序列(CWWG)两侧的三重态rrr/yyy序列上具有最高的序列变异性。11，p5 3四聚体通过来自dna小沟的arg 248和dna主沟的lys 120与这些碱基发生相互作用。12。值得注意的是，与dna结合的p5 3的不同晶体结构和分子动力学模拟表明，arg 248，特别是lys 120侧链具有高度的动态性，当与dna复合时，可采用多种构象。12,13,14,15。这组观察触发了我们的假设，即Lys 120和Arg 248残基与Res可变序列的相互作用可能是p53选择性的潜在来源。

Lys 120在P53靶基因选择性调控中的作用已经被探讨过。该残基的乙酰化与促凋亡基因表达的增加呈正相关。16,17，而Lys 120至Arg(K120r)的保守性癌源性突变则选择性地抑制细胞凋亡的诱导和p53与促凋亡区域的结合，而不影响诱导细胞周期阻滞。18。然而，p53剂量依赖性和Lys 120依赖性靶基因选择性的分子机制尚未确定。在我们的研究中，我们描述了一种解释p53与两组主要基因组靶点的差异结合的机制--高亲和力和低亲和力的Res，分别与细胞周期阻滞和促凋亡基因相关。具体来说，RE小沟槽宽度由RE中第3、8、13和18位的G/C或A/T BP编码，Arg 248检测到，决定了两种不同的p53 DNA结合模式。我们的发现提出了一个P53 RE密码，机械连接RE序列，DNA形状，DNA结合模式，和生物输出。

RE码区分p53效应通路

为了了解Lys 120完整性在识别特定RE序列中的作用，我们进行了染色质免疫沉淀实验，并分析了在同基因人H 1299肺癌细胞系中，p53的条件表达野生型(WT)和K120R型的全基因组占用率。1A)。在我们的芯片-seq数据中，我们发现了1358个独特的WT p53基因结合位点，这些位点与先前发现的20 bp的Res有关(见图)。1B)10。在1358 Res中，只有622(45.8%)在Lys 120转化为精氨酸(K120R结合)时保留了p53结合。其余736个(54.2%)位点在Lys 120转化为精氨酸后失去p53结合(称为“K120R-unbinding”)，并且呈现出较低的WT p53占用率(补充图)。1A，b)。与以前的生物观测一致18在我们的研究中，绝大多数与细胞凋亡正调控相关的Res基因是K120R非结合的。相反，对细胞周期阻滞或DNA修复等过程起关键作用的基因仍被K120R p53变异体所结合。1C和补充图。1C).

进一步分析Res在我们的芯片-seq峰中的核苷酸序列，发现来自一致RE的基因错配数与WT、p53在体内的占用率或对Lys 120完整性的依赖没有直接关系(补充图1)。2)。因此，我们假设RE中特定位置的序列同一性有助于这两种可能相互关联的特征。为了质疑这一假设，我们在我们的数据集中为K120R结合和K120R无界Res生成了一致的序列。这一分析表明，这两组Res序列的主要差异在于与核心序列(CWWG)相邻的位置(图)。1D)。更具体地说，在Res的第3、8、13和18位，在K120R结合组和在K120R非结合组中，它显示出A/Tbps的优势。另外，对这些部位核苷酸含量的进一步分析证实了这一观察结果，即80%的富含G/Cbps的位点缺乏K120R-P53结合(如图所示)。1E).

因为Lys 120的完整性在区分RES中的作用与不同的细胞命运有关。18我们评估了在第3、8、13和18位置的G/C相对于A/T BP含量是否能类似地区分与不同细胞命运相关的目标。通过对319项先前发表的基因研究进行全面的Meta分析，我们从芯片seq数据中分析了res，这些数据与先前被确定为高置信度p5 3靶点的基因相关联。19。值得注意的是，对16个促凋亡靶点的Res分析显示，G/Cbps在这些位置富集，类似于图中所示的序列。1D对于整个K120R-Res的无界群(图1.2A,   b、底部)。一项对16个高度置信度的支持生存目标的Res分析显示，在这些位置上有一个以A/Tbps为主的一致序列，类似于图中所示的序列。1D对于所有K120R的Res(图1)。2A, b、顶部)。此外，与凋亡相关的Res在核心序列(CWWG)上平均出现更多的错配，相对于亲存活的Res。然而，进一步的测试表明，这些错配只略微降低了p53在体内的占用率(补充图)。3A)，并且不规范K 120-依赖(补充图。3B)。有趣的是，与CWWG核心直接相邻的位置上的G/C和A/T BP含量仍然可以区分K120R和K120R非束缚区域，这与CWWG序列本身的状态无关(补充图)。3C)。这些发现表明，p53对不同类型RES的差异识别至少部分是由初级DNA序列中第3、8、13和18位置的A/T和G/C BP含量编码的。

P5 3在体外使用两种不同的RE结合模式。

为了定量p5 3与K120R结合和K120R非结合Res的结合，我们测定了P53与K120R结合的解离常数。Kd)的自然和人工Res，使用荧光偏振在275 mmNaCl，这将最好地反映体内条件，使非特异性dna结合无法检测(表)。1和补充图。4)14,20,21。在这些实验中，我们使用了一种不含非结构N端反式激活和脯氨酸丰富区的耐热重组p53蛋白。此ΔN-p5 3结构(残基94-393)与p5 3蛋白具有相同的dna结合特异性。14,22。在上述盐条件下，WT p53对K120R结合的Res(23~97 NM)具有较高的亲和力，而对K120R无结合的Res(254~783 nm)的亲和力则低一个数量级。这证实了以前的报道，即细胞周期阻滞的亲和力较高，如p21RE，促凋亡的亲和力较低，如bax ree。6,21。Lys 120与Arg的转换对K120R结合的Res(43~80 NM)的结合亲和力影响较小，而对K120R非结合Res的结合亲和力(800 nm至不可检测性)则显著降低。总之，这些体外数据再现了芯片-seq观察到的K120R结合选择性(如图所示)。1B)，以及其他地方18.

为了进一步了解K120R结合模式和K120R非束缚模式的性质，我们确定了Kd在较低的盐浓度(200毫米NaCl)下的数值。在此条件下，WT p53(8~45 NM)和K120R突变体(23~280 nm)与K120R非结合Res的结合亲和力均较高盐浓度高，表明存在静电驱动的相互作用。相反，对于WT(6-26 NM)和K120R(33~37 NM)蛋白，在较低的离子强度下，对K120R结合Res的识别量仅略有增加，这与主要的非极性相互作用是一致的。我们还分析了一种理想的、富含G/C、可能是k120R的无结合RE，称为“亲凋亡RE”，因为我们在结合分析中使用的天然区域(bax、re和noxa ree)与p5 3共识序列(包括核心(Cwg)序列)有不匹配之处(表中小写字母表示)。1)。理想的稀土证实了天然的K120R-无束缚Res的特征，表明不匹配对结合模式或K120R敏感性没有影响。这些体外结合数据表明，p53对K120R结合的Res采用高亲和力、非静电有效结合模式，而K120R非结合Res则采用低亲和力、静电有效结合模式。

P5 3对不同类型的RES采用结构不同的dna结合模式。

为了研究在体外观察到的两种不同的p5 3结合模式在原子水平上是否相关，我们分析了蛋白质数据库(Pdb)中可用的p5 3 dna晶体结构，并将它们按Lys 120被排序或无序分类，根据省略电子密度图(补充表)判断。1)。在第一组中，p5 3结构与bax样RE(pdb：6fj5)复合。23、图1.3A和补充图。5)，Lys 120以延伸的构象向主槽突出，与嘌呤基R12和R13形成直接氢键。在双螺旋(小凹槽)的另一侧，Arg 248采用弯曲构象，其胍基与Y8和/或Y9的磷酸(或Y9)直接或水介导的静电相互作用，其碱基对R12和R13(图1)。3A和补充图。5)。在第二组中，p5 3结构与p21样RE复合物(pdb：3q05)。14、图1.3B和补充图。6Lys 120侧链无序，这是由于P53 L1环内的Cα原子远离主沟槽外，阻止了Lys 120 Nζ原子与嘌呤碱的氢键。Arg 248被扩展并渗透到主要是疏水作用的小凹槽中。14,22。我们证实，这两种具有代表性的PDB结构的dna序列仅在4bps时存在差异，它重新描述了在体外观察到的两种不同结合模式的特点(表)。1)。因此，P53在高亲和力、K120R结合和低亲和力、K120R非结合区确实采用了结构上不同的结合模式。

虽然有不同的Lys 120和Arg 248构象，但以前在不同区域的配合物中有报道。12,15目前的发现为理解这两个关键的DNA接触残基在为p53占据基因组提供特异性方面所起的作用提供了一种机制上的理解。例如，Lys 120转化为精氨酸只会影响与低亲和力K120R非结合Res的结合亲和力，因为精氨酸侧链会引起与这些Re的立体冲突(图1)。3C)。我们的分析还为体外观察到的不同盐敏感性提供了结构基础(表)。1)由于低亲和力下的盐依赖作用，K120R不结合Res可归因于四聚体p53中的4个Arg 248残基与DNA主链磷酸盐的静电相互作用，而这些精氨酸残基在高亲和力K120R结合的盐不敏感结合模式下转变为以非极性疏水作用为主。

小槽宽由arg 248测量，决定了p5 3的稀土结合模式。

P53-DNA复合物中DNA序列的比较(附表)1)显示A/Tbps在RRR/YYY侧区占优势，具有无序的Lys 120侧链。因为A/Tbps可以在B型DNA中诱导出较窄的小沟和较宽的主沟。24,25，我们研究了典型的p53-DNA结构中DNA的形态。我们发现，与CWWG核心基序相邻的区域(Arg 248与DNA相互作用的地点)的大小沟槽的宽度确实在这两个结构中发生了改变(图1)。三维空间)。在富A/T，p21-类，K120R结合RE中，小沟槽是狭窄的，在主要疏水模式下被扩展的Arg 248侧链所识别(图)。3B和补充图。6)。在G/C丰富，Bax样，K120R-无结合RE中，Arg 248以弯曲的构象感受到较小的凹槽，与DNA静电相互作用(图1)。3A和补充图。5)。因此，在CWWG基元附近只有两个bps(位置8和18，如图所示)。三维空间)足以切换这些例子中的p53结合模式，而不考虑CWWG核心基序的基本组成(补充图)。7)11,26。我们认为Arg 248侧链构象受小槽宽影响的假说是由p53(R273H/T284R)的双重突变所证实的，该突变使小槽宽变宽，导致Arg 248侧链构象发生变化(补充图1)。8)27,28。这些发现证实了P53 Res在BPS 3、8、13和18处的小槽宽对于确定不同的DNA结合模式至关重要，因为它能诱导不同的Arg 248构象和相互作用。

重写RE代码重写p5 3函数

我们的模型预测在第3、8、13和/或18位置的单或双BP转换会影响RE的小槽宽，改变Arg 248和Lys 120的相互作用，最终决定p53的结合模式。为了严格验证该模型，在体外和体内引入了靶向G/C到A/T和A/T到G/C BP转换。利用体外dna结合实验，我们测定了Kd将G/C转换到A/T转换的改良bax_8/13 RE在自然bax RE的第8和第13位置的值(图1)。4A)。与模型一致，这些转换增加了WT p53与该RE的亲和力(从460 NM增加到40 NM)，并恢复了K120R-p53的结合。Noxa_3/13 RE的WT和K_(120 R)-p53结合率也有增加，其中在第3和第13位含有G/C到A/T转换(补充图1)。9A)。我们还测量了KdP21_8/13 RE在第8位和第13位具有反向A/T至G/C转换。这些转换降低了WT p53(从23 NM到99 NM)的亲和力，更显着地降低了K120R-p53(从43~479 NM)对此RE的亲和力(附图)。9B)。接下来，我们通过将G/C引入肌苷-胞嘧啶(I/C)转换，在不影响主槽宽的情况下，实验控制了RE的小槽宽。29。这些变化可能通过增加Arg 248与DNA结合的非极性性质而对K120R敏感性无影响，从而影响Arg 248与DNA的相互作用。WT-p53与Bax_8/13 I/C RE的亲和力从460 NM增加到83 NM，但K120R-p53结合仍未检测到。4B)。在人工6FJ5RE(附图6 FJ5 RE)中，在I/C类似位置引入G/C取代后，K120R结合的WT亲和力和保留率也有所增加。9C).

为了评估在体内是否可以可预测地操纵RE编码，我们研究了体外结合数据是否与人类细胞中的p53结合行为相关。最初，这种策略依赖于由p53 RE的特定变体驱动的荧光素酶记者小组。天然和人工的高亲和力和富A/T的Res(p21和3Q05)被K120R-p53完全激活，而低亲和力和富G/C的Res(Bax和6FJ5)对K120R-p53的激活有明显缺陷。4C)，与体外结果一致(表)1)。值得注意的是，bax RE位点8和13从G/C转换为A/T，或完全转换位置8至13，类似于p21 RE(从CCCGGG到TCCCAA，“bax_4bp”)，完全恢复了K120R-p53的反应性。相反，p21_8/13 RE中的A/T~G/C转换降低了K120R-p53的激活，这与本文提出的双结合模式模型是一致的。4D).

编辑RE代码可以相互转换p5 3驱动的细胞命运。

由于P53 RE共识序列非常简并，在人类基因组中活性Res的例子很少，仅在第3、8、13和/或18位有一个核苷酸差异。为了验证我们的模型在天然染色质的背景下，这一有限的例子被检查了p53占位。在其中一个例子中，通过对已证实但未被证实的p53靶基因APBB 2和SSUH 2的比较，在A/Tbps、与APBB 2基因连接的RE中、在与SSUH 2基因连接的RE中，A/T bps和SSUH 2位点上的双核苷酸转换强烈地降低了WT P53的结合，完全减少了K120R-p53蛋白的结合，这再次支持了该模型(补充图)。10).

为了在天然染色质背景下对P53 RE编码进行形式化测试，我们利用CRISPR/Cas9对人细胞内源性bax RE序列进行了编辑。我们编辑野生型bax RE以增加其A/T含量，方法是将8、11、12和13位置从CCCGGG转换为TCCCAA(“bax_4 bp”，与图中使用的序列相同)。4D)。我们的模型预测，这个编辑的bax_4 bp RE应该通过非极性的K120R结合模式被WT p53识别。值得注意的是，与富含G/C的WT、Bax、RE相比，WT p53在编辑的Bax_4 bp RE位点上具有更高的占用率，K120R-p53结合完全恢复。5A和补充图。11A)。此外，通过芯片分析观察到K120R-p53结合的恢复与功能相关，因为它在WT和K120R-p53表达细胞中都能诱导bax mRNA的转录和蛋白的表达(如图所示)。5B，c和补充图。11B)。最后，bax RE在天然染色质内的定向转化，在未经编辑的细胞经历细胞周期阻滞的情况下，导致癌细胞衍生的k120R-p53突变体的促凋亡功能恢复(图1)。5D，e)18。这一数据强烈支持体内模型，并强调DNA结合是p53选择性激活不同效应功能的关键一步。总之，通过在bax RE中引入这一靶向4-bp的改变，并将该结合位点从低亲和力转化为高亲和力，转化为K120R结合，p53依赖的细胞命运结果。

细胞命运的决定经常受到控制基因表达程序的关键转录因子的存在或缺失的调控，这些转录因子最终决定了细胞的表型。在某些情况下，一个关键的转录因子可以“决定”多个细胞命运的选择，这取决于细胞的背景。例如，作为对不同发育线索的反应，sox和wnt/β-catenin家族的单个成员可以推动细胞沿着几条不同的谱系途径分化。30,31。同样，癌基因转录因子myc可以触发细胞周期进程或细胞死亡，也可以以上下文依赖的方式触发。32。和MYC一样，抑癌基因p5 3可以触发多种细胞的结果，通常取决于最初驱动p5 3激活的压力形式。4。单一的、序列特异性的转录因子“选择”仅激活其几个基因表达程序中的一个，这引起了许多生化问题。其中最重要的是如何通过一个保守的dna结合域来识别与不同效应功能相关的基因组靶标。本文报道了p53蛋白DNA结合特异性的一种新机制，即p53 RE中第3、8、13和18位的核苷酸编码在不同的基因组靶点之间产生了DNA形状识别差异，这些差异是由两个关键的DNA接触残基Lys 120和Arg 248识别出来的。我们的发现所建立的密码是预测的，当在体内操纵时，可以用来相互转换p53靶基因的转录模式和细胞的命运。

正如前面提到的，P53 RE异常长，并且比通常观察到的序列特异性dna结合蛋白具有更高的变性水平。在20个核苷酸中，G/Cbps位于第4、7、14和17个位置(RRR)CWWGYYYRRRCWWGYYY(YYY)是P53 RE中唯一不变的位置。这些位置的鸟嘌呤由4个arg 280残基直接识别，这个碱基特异性读出是一个明确的机制，四聚体p5 3通过这个机制识别特定的基因组目标。33,34,35。在RE中，特别是在核心(CWWG)序列中，不匹配bps的数目通常会降低单个res的亲和力。11。然而，在高亲和力结合位点和低亲和力结合位点上都存在着与一致序列相同的不匹配数，包括关键位置4、7、14和17的关键G/C bps中的不匹配。这一发现表明，来自共识RE的失配程度不能完全解释p53与高亲和力和低亲和力Res的差异结合，而且超出基础特异性识别的机制必须解释p53区分不同靶点的精湛能力。

由于碱基特异性识别被排除为p53识别RE的主要决定因素，必须考虑其他生物物理机制。与本文报道的结果相关，小槽形识别是蛋白质-dna相互作用中常用的一种机制，被多种dna结合蛋白所利用。24,36。特别是，通过精氨酸残基识别狭窄的小凹槽，通过增加结合亲和力，对蛋白质-dna相互作用有着热力学上的有利影响。24,37。然而，差异精氨酸-小沟相互作用，调节dna结合而没有碱基特异性识别，和dna结合蛋白使用两种结合模式通过不同的小沟相互作用，以前还没有描述我们的知识。我们的发现确定了两种不同的分子机制，p53用于区分其基因组目标，作为该现象的直接后果。我们发现在RE的第3、8、13和18位置存在G/C或A/Tbps编码的较小的槽宽决定了两种不同的P53 DNA结合模式，这两种模式依次与不同的细胞命运相联系。

这里提出的RE码解释了p53对DNA的初始识别。然而，其他因素，如染色质结构或在RE中的中心插入，可能会影响甚至覆盖此代码。例如，在两个半位点之间插入的不连续区域通常具有较低的亲和力，与它们的dna序列无关。38。此外，一些含有一致RE序列的基因组位点在体内没有显示p5 3结合，这可能是由于上述染色质景观的抑制作用。9。这些例外为我们的模型提供了一个重要的警告。然而，对于绝大多数已确定的p5 3靶点，10,19RE的识别主要由DNA序列调控，对于这些基因组目标，选择性DNA结合作为激活下游p53靶的第一步，可以通过我们模型中描述的两种不同的DNA结合模式来解释。

这两种结合模式构成了另一层P53蛋白的基因调控层，通过Arg 248，定性地(主要是疏水和主要静电)和数量(高亲和力和低亲和力)与不同类别的RES产生不同的相互作用。Arg 248在靶基因选择性中的独特作用建立在p5 3生物学中已经确立的和关键的作用上，其中最明显的是arg 248是人类癌症中最常见的突变残基。39。这里报告的关于Lys 120识别RE形状差异的能力的观察与先前关于该残基在DNA识别和细胞命运中所起作用的两个发现有关。首先，Halazonetis小组已经报告了一种结构发现，即含有Lys 120的L1环在与dna复合时可以采用两种不同的构象。14,22。这些构象被称为延伸和凹进，反映了L1环相对于DNA主槽的位置。同样，Eethayathulla等人。40已有报道表明，p53家族成员p73的L1环Lys 120类似物Lys 138在不同的区域表现出不同的构象。这里报道的生物物理、基因组和生物证据的结合已经建立了DNA编码和p53识别机制，将这些观察结合起来。其次，我们和其他人已经证明Lys 120残基是经乙酰化修饰的，其水平与细胞凋亡有关，但与细胞周期阻滞无关。16,17。最后，Lys 120的乙酰化可能是一种机制，通过这种或另一种方式可以稳定p53的DNA识别，未来的研究应该阐明它的潜在作用。

总之，我们发现了两种不同的结合模式，作为一种通过对小凹槽形状的微分识别来赋予p53稀土选择性的手段，为p53生物学中一个尚未解决的重大谜团提供了解释--p53实现剂量依赖性RE识别和差异靶基因激活的机制。由于四个p53单体存在于一个具有四个稀土四分之一位点的复合物中，使得P53-RE相互作用范围很广(从强极性到强非极性)，这两种生物化学结合机制允许p53对其DNA识别进行细微的“微调”。此外，我们的模型描述了p53通过两种不同的结合模式识别DNA，作为p53依赖的下游靶点激活的起始和基础步骤。其他因素，如p5 3激活的特定应激信号通路，p5 3 dna结合区或蛋白质其他部位超过lys 120的残基翻译后修饰，差异辅助因子结合，或脉动表达动力学等，可能在p5 3调控选择性靶基因激活和制定最终细胞命运结果方面发挥作用。4。利用不同精氨酸-小沟相互作用确定的不同dna结合模式，有选择地影响不同的下游通路，建立了单个转录因子的范例后，未来的研究可能会发现其他参与细胞命运决定的dna结合蛋白，这些蛋白质使用类似的机制来获得靶基因选择性。