尼古丁通过刺激N2中性粒细胞和产生肺转移前利基而促进乳腺癌转移

吸烟对肿瘤免疫有着深远的影响，尼古丁是吸烟的主要成瘾成分，尽管尼古丁是一种非致癌物，但它能促进肿瘤的发展。在这项研究中，我们证明了尼古丁的慢性暴露在肺内形成转移前的利基中起着关键的作用，它是通过吸收亲肿瘤的N2-中性粒细胞来实现的。这一转移前小生境促进从N2-中性粒细胞分泌的分泌糖蛋白STAT 3激活的脂钙蛋白2(Lcn 2)的释放，并诱导肿瘤细胞间充质上皮的转变，从而促进肿瘤细胞的定植和转移生长。早期乳腺癌患者和有吸烟史的无癌女性血清和尿Lcn 2水平升高，提示Lcn 2是预测女性吸烟者转移风险增加的一种有前景的预后生物标志物。此外，天然化合物红景天甙能有效地消除尼古丁诱导的中性粒细胞极化，从而减少激素受体阴性乳腺癌细胞的肺转移。我们的发现提示尼古丁诱导的N2中性粒细胞对肺癌细胞定植有促进转移的作用，并说明红景天甙的治疗作用，以增强乳腺癌患者中性粒细胞的抗肿瘤活性。

中性粒细胞或多形核白细胞是人类循环中数量最多的白细胞(50~70%)。1。它们在炎症和宿主防御微生物感染中起着至关重要的作用。2。近年来，它们也被认为是调节肿瘤生长和转移的免疫反应的一部分。3。然而，中性粒细胞在肿瘤进展中的确切作用一直是一个争论的问题，因为中性粒细胞被证明同时具有亲肿瘤和抗肿瘤的特性。3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16。重要的是，高循环中性粒细胞/淋巴细胞比率(Nlr)是各种癌症预后不良的一个强有力的生物标志物。17,18,19,20,21,22,23,24。事实上，一项对8563名乳腺癌患者进行的大型Meta分析发现，nlr的增加与整体和无疾病的不利生存有关，特别是在三重阴性乳腺癌中。25。相反，其他研究将中性粒细胞标记物与不同癌症患者的生存率联系起来。26,27,28,29,30。这些相互矛盾的观察源于中性粒细胞中存在表型异质和功能多样的群体，这些群体控制着他们对环境信号的反应方式。31。越来越多的证据表明，环境污染物(如香烟烟雾)的长期影响对吸烟者的免疫力和健康具有普遍影响，因为它对先天免疫系统和适应性免疫系统都有不利影响。32,33,34,35。相反，人们发现吸烟会诱发EMT。36在肺癌中通过激活信号通路如STAT 3、AKT和NF-kB。37,38,39。此外，先前的研究表明lcn 2在吸入香烟烟雾的COPD患者的肺和血浆中持续表达。40,41。有趣的是，有一个强有力的迹象表明，尼古丁是香烟烟雾中的主要成分，通过降低NK细胞活性、T细胞增殖、巨噬细胞抗原处理活性和树突状细胞数量，对烟尘诱导的免疫抑制有显著的促进作用。42,43,44,45,46,47,48,49,50。此外，流行病学研究还表明，吸烟/尼古丁与各种癌症的风险增加密切相关。51,52。也有报道说，吸烟与浸润性乳腺癌患者肺转移负担增加密切相关。53,54,55这增加了18%的风险，降低了33%的生存率。56,57。然而，尼古丁在乳腺癌肺转移中的潜在作用及其对中性粒细胞的潜在直接影响尚不清楚。在本研究中，我们通过分析尼古丁相关炎症在乳腺到肺转移中的作用，用系统的方法解决了这个问题。我们已经证明，尼古丁偏斜中性粒细胞极化在转移前的生态位和促进转移定植乳腺癌通过增强癌细胞可塑性，从而促进肿瘤的进展。

尼古丁诱导的中性粒细胞在肺转移前浸润并促进转移

为了评估吸烟与乳腺癌患者肺转移的关系，我们对三个先前报道的乳腺癌队列进行了回顾性的全面分析。53,54,55,58有吸烟史的癌症患者共有1077人。我们发现，与不吸烟者相比，目前吸烟者或前吸烟者的肺转移发生率明显高于不吸烟者(图1)。1A)。尼古丁对原发性肿瘤生长的促肿瘤作用已被证实。59,60然而，其对远处转移的机制影响尚不清楚。此外，鉴于缺乏可靠的尼古丁剂量数据，我们通过检测尼古丁的初级代谢物-柯蒂宁的血清水平，以及烟草烟雾暴露的生物标志物，确定了尼古丁的人体相关生理浓度，并以时间依赖的方式注射了2毫克/千克尼古丁，并发现与成年吸烟者相比，科蒂宁水平与以前所描述的从未吸烟者相比具有可比性。61(补充图。1A)。因此，我们每隔几天给小鼠注射2mg/kg尼古丁。如先前所报告的注射62,63,64。接下来，我们通过注射4T1和E 0771小鼠乳腺癌细胞模型，检测尼古丁在自发性和实验性转移模型中的作用，以评估有无异基因Balb/c或C57BL/6小鼠的自发和实验性转移。注射尼古丁(每隔一天直到终点)，然后监测肿瘤的生长。1B、补充图。1b和2A)。我们发现，尼古丁暴露在两种自发的情况下都显著增加了肺转移负担，增加了100倍以上(图1)。1C，补充图。2B)和实验(附图)。1C)转移，与之形成对比的是，原发性肿瘤的生长增加了不到10倍(如图所示)。1D，E、补充图。1d和2C，D)。值得注意的是，与对照组相比，尼古丁显着地促进了转移结节的数量，从而降低了无肺转移生存率(附图)。1英、法)。为了明确尼古丁对肿瘤环境中哪一种免疫细胞类型的影响并促进原发和转移性肿瘤的分化，我们用免疫组织化学(图G)法检测了对照组和尼古丁处理小鼠原发和转移瘤中中性粒细胞(ELA 2)、巨噬细胞(F4/80)和NK(NKp 46)细胞的组成。1g、补充图。1g和2E)。在这些天然免疫细胞中，巨噬细胞是最丰富的群体，分别占原发肿瘤的25%(4T1)和~18%(E 0771)，转移性肺中的~5%(4T1)和~3%(E 0771)。1g、补充图。1g和2E)。重要的是，中性粒细胞(多形核细胞)是尼古丁治疗小鼠肺转移的主要细胞群(4T1~40%，E 0771~27%)。1g、补充图。1g和2E)。这些结果提示尼古丁可能在转移性定植的肺免疫微环境的预处理中起着关键作用。为了验证这一假设，我们采用了一种不依赖于癌细胞扩散或血管内的转移前小鼠模型。Balb/c或C57BL/6小鼠经腹腔注射尼古丁(2mg/kg)或PBS 10天后，静脉注射荧光素酶表达4T1或E 0771小鼠乳腺癌细胞。氢，补充图。2F)。肿瘤细胞注射后，小鼠未接受尼古丁。我们发现，与对照组相比，尼古丁的预暴露使肺转移负担增加了100倍以上。1I，J，补充图。2G，H)。重要的是，预先接触尼古丁的小鼠在注射癌细胞(转移前肺)之前，在循环和肺中的中性粒细胞数量显著增加，并且在静脉肿瘤植入后转移生长(转移性肺)期间，它们的数量逐渐增加(如图1所示)。1K，补充图。1H，I)。为了进一步验证这一结果，我们分析了吸烟者的外周血(n=12)及禁止吸烟(n=12)无癌症的人体受试者(见补充数据)2)测定外周血中性粒细胞(CD 15)的数量。+VeSSC嗨)。我们的结果显示，吸烟者的循环中性粒细胞的数量明显高于不吸烟者(补充图)。1J).

尼古丁戒断在转移过程中的作用尚不清楚。因此，为了解决这一问题，我们用尼古丁预处理小鼠10天，然后在Balb/c小鼠体内注射4T1细胞，第1天、15天或30天停止尼古丁治疗，并评估荷瘤小鼠和无肿瘤小鼠的肿瘤负担和中性粒细胞水平。我们的结果表明，即使戒烟30天后，发生肿瘤生长和远处转移的风险仍未得到预防，这意味着有吸烟史的乳腺癌患者仍有转移风险(补充图5)。3A-E和4A-D)。总之，这些结果强烈地表明，尼古丁的持续暴露会在肺部产生一个炎症性的微环境，其特征是活化的中性粒细胞大量涌入，从而创造了一个有利的转移前生态位。

尼古丁激活的中性粒细胞减少肺转移

为了研究尼古丁激活的中性粒细胞在转移过程中的功能贡献，我们在尼古丁处理或未处理环境下，通过注射特异性消耗Ly6G的抗Ly6G(克隆1A8)单克隆抗体，进行了中性粒细胞耗竭实验。+中性粒细胞而非单核细胞12,65。第一次尼古丁和抗Ly6G治疗24h后，将4T1细胞静脉注入小鼠体内(见图)。2A)。与同型(IgG)处理的小鼠相比，中性粒细胞耗竭小鼠肺转移负担有明显的抑制作用(图一)。2A-D)。另一方面，经尼古丁处理的荷瘤小鼠和无瘤小鼠的肺均被活化的中性粒细胞(CD11b)明显浸润。+Ly6G+与对照组相比，抗Ly6G小鼠肺组织中的比例明显降低(图1)。2E；补充图。S5A-C)。此外，中性粒细胞的减少显着地抑制了肺内转移结节的数量，延长了这些动物的肺无转移存活(图一)。2F，G)。与对照组相比，尼古丁预处理的无瘤小鼠循环中性粒细胞也有明显的抑制作用(补充图)。S5D，E)。这些结果进一步证实，尼古丁暴露可引起肺内中性粒细胞的积累，并强烈促进肺转移的发生。

尼古丁以STAT 3依赖的方式促进中性粒细胞极化/活化为n2表型。

为了进一步了解尼古丁处理过的中性粒细胞的功能特性，我们用n1/n2相关标记物评估了人和小鼠原始中性粒细胞的体外极化。66,67。我们发现尼古丁治疗使中性粒细胞明显偏向N2型(CD 206，CCL 2，ARG 2)(图1.3A，补充图。6A，B)。中性粒细胞的这种极化在无瘤小鼠或荷瘤小鼠的肺中也很明显，在图中使用的是同型/抗Ly6G。2(补充图。6C)。由于尼古丁能够在体外和体内重新编程中性粒细胞，我们下一步试图鉴定在此过程中在中性粒细胞中激活的转录因子(S)。我们检查了n1/n2中性粒细胞的微阵列数据，并与转录因子数据库进行了交叉参照。66,68。我们的分析表明，与N1-中性粒细胞相比，N2中性粒细胞中STAT 3转录因子的表达最为明显。6d)。然后，我们检查了STAT 3下游信号签名。69用n1-/n2-中性粒细胞表达谱中的基因集富集分析(GSEA)激活中性粒细胞。66。与N1-中性粒细胞相比，STAT 3激活信号确实在N2-中性粒细胞中显著富集(补充图)。6E)。我们进一步验证了这一发现，使用人的初级和HL-60中性粒细胞，显示上调了STAT 3的表达，尼古丁治疗(图一)。3B)。重要的是，我们发现在已知的STATTIC存在的情况下，尼古丁激活的中性粒细胞中的STAT 3和p-STAT 3有明显的下调。STAT 3抑制剂，以一种剂量依赖性的方式(如图所示)。3C；补充图。6f，G)。然而，我们并没有观察到同样剂量的STATTIC处理后癌细胞中STAT 3的表达减弱(补充图)。六小时)。我们还检测了中性粒细胞(HL-60)极化在尼古丁治疗中是否存在STATTIC使用N1/N2相关标记。我们发现，在STATTIC存在的尼古丁治疗显着下调N2相关的标记(补充图)。6I)。为了进一步验证这一结果，我们用STAT 3-在尼古丁存在或不存在的情况下特异性siRNA。我们发现STAT 3基因敲除导致N2标记物的表达显著减少(补充图)。6J)。此外，为了研究N2-中性粒细胞在体内对肺转移的直接作用，我们进行了n2-中性粒细胞过继转移(CD11b)。+Ly6G+)用尼古丁处理的Balb/c小鼠骨髓中分离出尼古丁10天(图1)。三维空间；补充图。7A，B)。如图所示。3D-G；补充图。6K同时给予尼古丁和STATTIC治疗后，N2中性粒细胞过继转移导致肺转移负担显著增加。我们还检测了相关的N1和N2中性粒细胞标记物在肺转移瘤中的表达。与尼古丁联合STATTIC治疗组相比，尼古丁和过继转移的N2-中性粒细胞诱导转移性肿瘤中N2-中性粒细胞浸润(CD 206)，主要表现为N1-中性粒细胞浸润(NOS 2)(图2)。3H，I)。重要的是，在预先接触尼古丁的小鼠的转移前实验中也获得了类似的结果，结果显示肺内N2-中性粒细胞(CD 206)的积累明显增加，转移肺中N2-中性粒细胞(CD 206)的数量逐渐增加(附图)。7C，D)。此外，我们还分析了吸烟者的外周血(n=12)及禁止吸烟(n(12)无癌症的人，以确定循环的N1/N2中性粒细胞的状态。我们发现吸烟者循环中N2-中性粒细胞(LDN)的比例明显高于不吸烟的N1(HDN)(补充图)。8A，B)。此外，我们还发现，与HDN条件培养基相比，LDN条件培养基显著促进了4T1肿瘤细胞的生长(附图)。SF8C-F)。我们还发现，p-STAT 3在小鼠转移前肺/中性粒细胞中的表达明显增加(静态治疗可逆转)以及吸烟者的肺转移损害(补充图)。SF9A-C)。这些结果表明，尼古丁暴露后肺转移增加的原因是：STAT 3-活化的N2-中性粒细胞，促进随后的转移形成。

尼古丁极化的N2中性粒细胞促进间充质向上皮间质的转化

上皮间充质转化(EMT)和间充质间质转化(MET)在转移性定植中起着关键作用。70肿瘤微环境中的间质细胞和免疫细胞对肿瘤细胞的可塑性有显著的影响。71。为了研究N2-中性粒细胞对这些过程的影响，我们首先对人、小鼠原代中性粒细胞和不含尼古丁的永生化人中性粒细胞(HL-60)进行处理，然后提取条件培养液(CM)治疗间充质样MDAMB 231和MCF10CA1a乳腺癌细胞。我们发现，来自尼古丁诱导的N2中性粒细胞的CM强烈地促进了这两种癌细胞的MET表型。4A，补充图。10A，B)。MDA 231和MCF 10CA1a的表达增加，进一步证实了MDA 231和MCF 10CA1a的上皮转移。钙粘蛋白, 埃帕姆，和角朊18的表达减少波形蛋白, N-钙粘素，和ZEB 172(无花果)4B，补充图。10C)。此外，我们还检测了E-钙粘素在原发于无花果中的自发性转移和中性粒细胞缺乏的小鼠原发性乳腺和肺转移瘤中的表达。1g和2A，并发现尼古丁治疗组的原发性乳腺和转移性肺中E-钙粘蛋白的表达增加(如图所示)。4C)。另一方面，中性粒细胞衰竭小鼠的肺转移与同类型处理的肺相比，E-钙粘蛋白的表达降低(如图所示)。4C)。有趣的是，当我们用尼古丁处理成纤维细胞(mrc-5)中的CM处理癌细胞时，我们没有观察到emt/met标记物的任何变化，而尼古丁处理的单核细胞(Thp1)cm增加。钙粘蛋白较小程度的表达(附图)。10d)。尼古丁诱导的中性粒细胞CM对上皮样MCF 7细胞的作用也没有改变。波形蛋白和钙粘蛋白与间充质样MDAMB 231和MCF10CA1a细胞的表达比较(附图)。10d)。因为据报道尼古丁直接增强癌细胞59，我们还研究了它对癌细胞的直接作用。正如预期的那样，癌细胞(MDAMB 231、MCF 10CA1a和MCF 7)中的尼古丁治疗导致EMT标记物显著增加(波形蛋白)相对于未处理的对照细胞(如图所示)。4D)。4T1细胞经尼古丁处理或不加尼古丁处理时，也观察到类似的结果(补充图)。11A，B)。此外，我们观察到，与对照相比，尼古丁诱导的人中性粒细胞产生的CM治疗后肿瘤细胞的生长明显增加(如图1所示)。4E)。我们还检测了尼古丁特异性的表达。α4和β2多个乳腺癌细胞(MCF 7、MDAMB 231、MCF 10CA1a和BT 549)和人/小鼠原代中性粒细胞的受体。有趣的是，两者α4和β2与乳腺癌细胞相比，受体在人和小鼠初级中性粒细胞中被选择性地过度表达。4F)。这些结果表明，尼古丁激活的N2-中性粒细胞足以使癌细胞重新编程，以获得上皮表型并促进肺转移。

尼古丁激活的N2中性粒细胞分泌Lcn 2促进乳腺癌细胞上皮可塑性

为了鉴定尼古丁诱导的介导癌细胞MET的N2中性粒细胞分泌因子(S)，我们利用一个聚焦于EMT/MET基因的qPCR芯片对经尼古丁处理或不加尼古丁处理的人原代中性粒细胞进行了表达谱分析。如附图所示。12A与对照组相比，尼古丁激活的N2-中性粒细胞中Lcn 2的表达明显上调.Lcn 2是一种分泌型糖蛋白，可在中性粒细胞中表达。73...我们进行了ELISA分析，发现与未处理的中性粒细胞或癌细胞相比，尼古丁处理的人原发性中性粒细胞和HL-60细胞确实分泌了大量的Lcn 2。5A)。此外，我们注意到明显的剂量依赖性下调Lcn 2在尼古丁处理的N2-中性粒细胞存在的情况下，STATTIC(补充图)。12b)。此外，我们还对ENCORI数据库进行了分析。74确定Lcn 2功能相关性ERα，PR，和HER 2乳腺癌患者中的表达。我们发现Lcn 2表达与ERα，PR，和HER 2表达式(附图)12C)。为了进一步阐明Lcn 2在诱导上皮表型中的作用，我们用人重组Lcn 2(HrLCN 2)处理癌细胞(MDAMB 231，MCF 10CA1a)。我们发现，低浓度的hrLCN 2(2.2M)诱导了癌细胞的MET表型，这一点得到了强E-cadherin和低Vimentin表达的进一步证实。5B、C)。我们还研究了尼古丁激活的N2中性粒细胞CM对癌细胞的影响。我们观察到E-cadherin和KLF 4(MET标志)的上调表达。75,76烟碱激活的N2-中性粒细胞经CM处理后，Vimentin和磷脂ERK 1/2的表达均低于对照组。相反，当癌细胞仅用尼古丁直接处理时，则发现两者成反比关系(图一)。5D)。重要的是，尼古丁在癌细胞中诱导的EMT在用hrLCN 2处理时获救，类似于用CM处理的癌细胞从尼古丁诱导的N2-中性粒细胞(如图所示)。4B小组(图1.5D)，表示Lcn 2是上皮表型的候选驱动因子。由于Lcn 2是由尼古丁激活的中性粒细胞分泌的，我们测试了Lcn 2作为吸烟者早期乳腺癌进展的生物标志物的潜在用途。我们定量测定了治疗前、Ⅱ期、激素受体阴性的乳腺癌患者血清和尿液中Lcn 2的水平(n=20的血清和n=20(尿液)和无癌症女性(n=12的血清和n=20(尿液)是否有吸烟史(见补充数据)3–5)。我们发现吸烟患者和无癌症吸烟者血清和尿液中Lcn 2水平明显高于非吸烟患者和非癌症患者(图1)。5 E、F)。为了进一步验证这些结果，我们使用了一组先前公布的23例乳腺癌转移患者。77。肺转移患者肺转移率明显升高。Lcn 2与有其他转移的患者相比(附图)。12D)。而且，因为LRP 2/megalin被报道能结合和介导细胞摄取Lcn 278,79我们检测了其在MDAMB 231或转移性乳腺癌PDX获得的CSC(癌干细胞样细胞)中的表达。我们发现LRP 2CSC在乳腺PDX和细胞系中的表达均明显下调(附图)。12E)。在癌症患者队列中使用非csc和csc进一步验证了这一点。80 (n在我们先前公布的710例乳腺癌患者的队列数据中81(补充图。12F，G)。有趣的是，我们观察到LRP 2癌细胞、PDX、肿瘤患者及TNBC患者非CSC的表达(n=162)与CSC细胞及腔内型乳腺癌患者比较(n=218)来自同一组别(附图)。12F，G)。此外，为了研究N2-中性粒细胞分泌的Lcn 2对促进MET和肺转移的直接功能作用，我们应用crispr/cas 9技术将ccn 2基因敲除。Lcn 2中性粒细胞。在体外测试时，我们观察到尼古丁诱导的CM治疗后，MET表型和肿瘤细胞生长明显下降。Lcn 2基因敲除中性粒细胞(HL-60)与对照细胞(野生)比较(附图)。13A，B)。然而，当Lcn 2将敲除细胞过继转移到裸鼠体内，然后静脉注射MCF 10CA1a人乳腺癌细胞。Lcn 2与野生型细胞相比，肺转移负担明显减少(补充图)。13C-G)。这些数据表明尼古丁激活的N2中性粒细胞在一定程度上通过诱导Lcn 2发挥促肿瘤作用。

红景天甙通过阻断尼古丁诱导的N2中性粒细胞极化而选择性抑制肺转移

上述结果表明，尼古丁激活N2-中性粒细胞，支持侵袭性癌细胞向肺转移。因此，寻找一种特异性阻断中性粒细胞极化的药物将是治疗乳腺癌肺转移的一种有希望的方法。为此，我们使用了天然化合物库(n=124)筛选选择性阻断尼古丁治疗时N2-中性粒细胞极化的化合物ARG 2用双倍qPCR方法表达，用ELISA法确认结果(见图)。6A)。我们发现红景天苷是最有效的抑制作用的最佳候选化合物。ARG 2表达和分泌(图1.6B，C)。为进一步评价红景天甙对尼古丁激活的N2中性粒细胞的抑制作用，采用尼古丁加红景天甙治疗HL-60中性粒细胞，并检测N1/N2相关标记物。我们发现N2标记物显著减少(CD 206，ARG 2)与N1标记(CD 95，NOS 2)。同样，我们也观察到活性p-STAT 3/的下调。STAT 3由红景天苷在尼古丁治疗下进行(图一)。6d，E)。这表明红景天甙能阻断尼古丁介导的N2-中性粒细胞向N1-中性粒细胞的极化。在裸鼠体内静脉注射MCF10CA1a乳腺癌细胞，然后腹腔注射尼古丁(2mg/kg)和红景天甙(20 mg/kg)，直至终点。我们发现红景天甙显着地降低了尼古丁介导的肺转移负担和肺转移结节的数量，从而提高了肺无转移生存率(图一)。6f-J)。我们还检测了相关的N1和N2中性粒细胞标记物在肺转移瘤中的表达。我们发现尼古丁诱导N2-中性粒细胞浸润(CD 206)。+)转移性肿瘤与尼古丁+红景天甙治疗组比较，主要表现为N1-中性粒细胞浸润(NOS 2)。+)(附图。14A，B)。此外，红景天甙治疗对小鼠没有任何明显的毒性，也没有降低癌细胞的活力(补充图)。14C-E)，表明红景天甙的中性粒细胞特异性作用。我们还检测了N1和N2中性粒细胞标记物在无肿瘤转移前肺组织中的表达。我们发现尼古丁诱导的N2-中性粒细胞(CD 206)在转移前肺的浸润和红景天甙治疗将这些中性粒细胞逆转为N1-中性粒细胞(NOS 2)(补充图2)。14F，G)。综上所述，这些结果强烈地表明红景天甙是一种有前途的治疗药物，可用于预防或管理吸烟引起的乳腺癌肺转移。

识别转移前小生境促进肿瘤生长的机制是一个积极研究的领域；然而，外界环境因素在扩散性肿瘤细胞大量消耗的背景下，决定器官特异性转移的进展，知之甚少。在这里，我们提供了令人信服的证据，尼古丁的长期暴露在启动中性粒细胞的招募和转移前小生境的形成中起着至关重要的作用，它使中性粒细胞向肿瘤支持的表型倾斜。以前关于转移前小生境形成的研究已经揭示了肿瘤动员和吸收BMDC和几种免疫细胞所产生的复杂的相互作用。82。转移前小生境内的这些细胞通过分泌炎性细胞因子、生长因子和促血管生成分子来重建局部微环境，从而支持肿瘤细胞定植、增殖和促进肿瘤转移。83,84,85,86,87,88。此外，最近的发现强调了中性粒细胞在炎症反应过程中在转移前小生境形成中的新作用。4,9,12,89,90。有趣的是，在我们的研究中，我们发现尼古丁暴露前逐渐增加中性粒细胞的积累，然后明显增加肺转移负担。此外，我们还发现，即使在尼古丁戒断后，中性粒细胞的数量也显著增加，这与早先的一项研究非常一致，研究表明高白细胞数与戒烟后持续存在的吸烟显著相关。91。此外，健康吸烟者和乳腺癌患者中性粒细胞/淋巴细胞比率(Nlr)升高与全身炎症和预后不良有关。25,92。我们还发现，在无癌症吸烟者中有大量的循环中性粒细胞，这与先前的一项研究相一致，该研究报告了吸烟者和稳定期COPD患者外周血中性粒细胞数量的增加。93,94。此外，已有研究报道尼古丁增强中性粒细胞的抗凋亡信号和趋化迁移，导致中性粒细胞积聚和促进局部组织损伤。95,96。有趣的是，最近的一项研究表明，吸入电子烟中的尼古丁会触发中性粒细胞活化，从而促进炎症反应。97。这些观察结果与我们发现尼古丁在肺内产生促炎症环境中的转移作用是一致的。肿瘤中性粒细胞的活化内流进一步显示尼古丁在提供适宜的微环境以吸引肿瘤细胞到靶器官(肺)并帮助其生长或存活，从而促进转移前小生境的形成。

中性粒细胞在调节原发肿瘤的生长和转移到转移疾病中起着至关重要的作用。3。它们具有抗肿瘤作用。98例如直接杀死肿瘤细胞12,99,100，起抗原提呈细胞的作用。101，以及最近发现的抗体介导的上睑下垂。102。中性粒细胞也通过分泌白三烯来促进各种癌症的转移。4、FGF 2103，Bv887，或者是经历了NETISION的过程89。总之，这些证据提出了在中性粒细胞中存在表型异质性和功能多样性的可能性，这些中性粒细胞控制着他们对环境信号的反应。31,104,105。此外，来自早期研究的令人信服的证据105,106,107已经清楚地确定了荷瘤小鼠和癌症患者血液中循环中性粒细胞(N1和N2)的不同群体。此外，最近的一项研究108结果表明，N2-中性粒细胞与血液中的循环肿瘤细胞(CTC)相互作用，促进转移小生境的形成。同样，循环的n2-中性粒细胞也被报道在非癌症炎症性疾病中，如中风、心肌梗死和系统性红斑狼疮。109,110,111。我们的研究表明，尼古丁在吸烟人群血液中常见的病理相关浓度下，引起中性粒细胞的N2-极化。33。值得注意的是，我们发现尼古丁诱导的N2中性粒细胞选择性地定植于无肿瘤小鼠的肺部，并为肿瘤细胞建立了转移前生态位，这些肿瘤细胞后来被植入这些小鼠体内，导致肺转移负担显著增加。相反，当中性粒细胞耗尽或尼古丁激活的STAT 3信号被药物靶向时，肺转移负担和中性粒细胞蓄积量明显减少。部分原因可能是尼古丁与中性粒细胞结合增加，随后α4β2烟碱乙酰胆碱受体上调。112。此外，我们发现活跃的无癌症吸烟者外周血N2-中性粒细胞的数量显著增加.这与吸烟者的免疫反应受损密切相关，因为由于抗原处理途径和趋化因子的下调，N2-中性粒细胞的经典中性粒细胞功能减弱。66。相反，早期的研究显示，在吸烟相关的炎症条件下，中性粒细胞运动能力和趋化能力增强。113,114。有趣的是，最近的一项研究表明，与晚期肿瘤的中性粒细胞相比，早期肿瘤小鼠的中性粒细胞具有更高的自发迁移水平，这表明局部微环境介导的表型转换的作用。115。总之，我们的研究揭示了在尼古丁引发的环境下中性粒细胞极化的STAT 3依赖性机制。它还强调了尼古丁在促使N2-中性粒细胞流入肺中的关键作用，这是在转移前小生境形成过程中引导乳腺癌细胞走向热带的早期先决条件步骤。

上皮间充质转化(EMT)及其逆转过程(MET)是胚胎发育和组织修复中的基本进化保守过程，但也赋予癌细胞恶性特性。116。早期的研究已经确定EMT是逃避原发肿瘤的先决条件，但是这个过程是不够的，甚至可能不利于早期定植，因为肿瘤细胞需要恢复转移生长所需的一些上皮特征。117,118,119,120,121,122。此外，最近的研究表明，MET可以由细胞内成分或基质成分诱导。70,71,123,124,125,126,127,128,129。然而，直接的机械证据，定义了在吸烟诱导的公开炎症过程中免疫细胞和癌细胞之间的相互作用，以及在转移前小生境支持癌细胞定植的可能贡献，人们对此仍然缺乏了解。在此，我们发现尼古丁激活的中性粒细胞分泌糖蛋白脂钙蛋白2(Lcn 2)，促进间充质癌细胞以旁分泌的方式向上皮表型(Met)转化，这是转移定植的重要步骤。130。值得注意的是，我们发现积极吸烟的乳腺癌患者和无癌症女性血清和尿液中Lcn 2水平的升高进一步支持了我们的体外研究结果。此外，我们还发现了Lcn 2用ERα, 公共关系，和HER 2原发性乳腺肿瘤中的表达(附图)。12C)，这与先前的发现一致，即Lcn 2导致减少ERαMCF 7在乳腺癌细胞中的表达131。我们还发现Lcn 2-与野生型中性粒细胞相比，空中性粒细胞在诱导MET和转移方面效果不佳(补充图)。13A-G)通过调节ERK-KLF4信号轴，抑制尼古丁对MET的影响，提示其是上皮表型的候选驱动因子。132,133,134。有趣的是，Ouzounova等人。最近发现粒细胞(Gmdc)是髓源性抑制细胞的一个子集，它能够在乳腺癌中恢复emt。128。虽然中性粒细胞和gMDSCs均表现出表型和功能上的相似性。135，尼古丁激活的中性粒细胞对肿瘤的支持作用提供了直接的实验证据，以区别于他们在研究中报道的gMDSCs的免疫抑制功能。有趣的是，尼古丁曾被发现直接增强各种癌细胞的EMT。59。但是，应该指出，LRP 2感受器Lcn 278在乳腺癌干细胞中的表达水平较低。此外，最近的一项研究表明，EMT细胞比MET细胞对中性粒细胞毒性更敏感，同时促进了转移前肺的有效播种。136从而强调环境刺激在建立肺转移中的重要性。总之，我们的发现表明，尼古丁激活的N2-中性粒细胞对癌细胞可塑性的时空调控，将间充质肿瘤细胞转化为上皮细胞，在转移前的利基处有效生长。

通过筛选天然化合物库，我们确定红景天苷是尼古丁诱导中性粒细胞N2转化的有效抑制剂。红景天苷是一种天然抗氧化剂，最初从药用食品植物中提取。红景天137具有潜在的抗炎作用。138、抗病毒139，以及抗癌140财产。红景天甙通过调节多种途径，包括Noch 1，表现出抑制肿瘤的作用。141、STAT 3138、PI3K/AKT142。然而，这些由红景天苷介导的直接肿瘤细胞毒性作用需要较高的体外和体内剂量。140。在本研究中，我们发现小剂量的红景天甙能有效地抑制尼古丁诱导的中性粒细胞向n2表型的极化，并通过减少活化而增强其n1表型。STAT 3表情。此外，我们没有发现任何明显的小剂量红景天甙对癌细胞生长的影响。重要的是，我们发现红景天甙在尼古丁暴露后显著降低了肺转移负担，从而抑制了肺转移。考虑到红景天甙对尼古丁诱导的中性粒细胞活化的体内外抑制作用及其在低剂量下的最小毒性，红景天苷可为长期预防和抑制转移，特别是对有吸烟史的癌症患者提供潜在的治疗手段。虽然香烟烟雾中的其他成分可能与转移有关，但其在转移中的作用仍然有限。据我们所知，至今还没有研究过尼古丁与其对乳腺癌肺转移中性粒细胞的直接影响之间的潜在联系。

我们的发现描述了尼古丁促进乳腺癌肺转移的机制，其机制是通过改变转移前肺中性粒细胞的极性，然后通过分泌的Lcn 2刺激细胞与细胞的通讯，从而促进乳腺癌的肺转移。重要的是，我们发现红景天苷是一种潜在的治疗剂，可以特别增强肺内中性粒细胞的抗肿瘤活性。7).