在2017年至2018年马达加斯加爆发肺鼠疫之后，世卫组织发布了一份TPP，概述了成功的鼠疫疫苗的预期特征。25。这些特点包括：不超过2剂量方案，耐久的保护，无针给药，对所有引起瘟疫的菌株的普遍覆盖，以及储存期间的稳定性。25。这场2017-2018年的疫情似乎与第三次大流行如出一辙，后者首次在马达加斯加造成了瘟疫。7，并提醒我们主动作出反应，以防止日后爆发鼠疫。7.
考虑到2013-2018年期间包括美国在内的33个国家向世卫组织报告的鼠疫病例和死亡人数(病死率为17.5%)，有必要开发新一代鼠疫疫苗。此外，最近发现阿米巴可作为鼠疫细菌的蓄水池，这是令人震惊的。7。最后，对肺鼠疫的自然细胞免疫反应尚不清楚，到目前为止，还没有对任何一种鼠疫疫苗进行第三阶段的临床试验。因此，我们的研究是及时的在小鼠身上试验新一代鼠疫疫苗，并对其免疫反应进行深入研究。
正如我们早些时候的论文中提到的24我们倾向于使用Ad5载体开发鼠疫疫苗，因为它具有(1)特征良好的病毒基因组和整合多种基因的能力；(2)将Ad5载体用于人类的基因治疗应用；(Iii)广泛的取向性感染了各种分裂和不分裂细胞；(Iv)腺病毒在体内有效地向抗原提呈细胞提供转基因产物，以促进快速和健壮的体液和细胞免疫反应；(V)优先诱导Th1型免疫反应，减轻Th2介导的嗜酸性粒细胞相关免疫病理；(Vi)腺病毒向组织培养细胞高滴度复制的能力；(Vii)生产腺病毒疫苗所需的生物遏制要求较低，(Viii)可系统地和通过粘膜表面应用，腺病毒相对稳定，以便于临床使用；(Ix)廉价生产，(X)不需要佐剂，疫苗可作为气溶胶雾气刺激的有效和持久的体液和细胞免疫反应，以及(Xi)研制多价/多组分疫苗的即插即用平台。
Ad5载体还用于评估单价ad5-f1和ad5-lcrv疫苗在鼠疫小鼠模型中的效力。鼠疫菌CO92株，但疫苗由I.M.航路27。此外，我们注意到rAd5-lcrv单价疫苗(8×10)的剂量为1。9(V.P.)在小鼠肺鼠疫模型中，静脉注射N只对小鼠提供20%的保护作用。运送时，没有观察到任何保护措施。路线为90度50尽管抗体效价很高24。我们的研究也表明。疫苗的使用绕过抗Ad5载体的现有抗体，为动物提供保护。24。虽然ad5是人类接触到的最普遍的血清型，但与其他用作疫苗载体的腺病毒血清型相比，它诱发的先天促炎细胞因子反应最小。28.
我们的2剂量rAd5-YFV鼻内接种策略基本上符合世卫组织的TPP。目前研制的鼠疫疫苗经历了第一和第二阶段的临床试验，其基础是F1和V蛋白与明矾混合。29或鞭毛素13副官。这些疫苗诱导了对F1和V抗原的强烈体液反应，并已被证明是有效的在小鼠和一些非人类灵长类动物模型的肺鼠疫。例如，在金刚猴身上观察到了一致的保护；然而，在非洲绿色猴子中，在多项研究中注意到保护的不一致性(0-75%)。8,30,31。缺乏一致保护的确切机制尚未确定；然而，在非人类灵长类动物(NHP)模型中，产生的体液反应是相似的。据推测，非洲绿猴可能需要细胞介导的免疫反应才能得到完全的保护。8，F1-V亚基疫苗没有充分开发出来。
虽然F1和V是鼠疫疫苗发展的重要抗原，但也有一些问题凸显了将其他鼠疫免疫原纳入潜在的通用鼠疫疫苗的重要性。F1胶囊已被证明是非常重要的。鼠疫菌抵抗感染时的吞噬作用32。菌株鼠疫菌这种缺乏f1的基因，在肺炎和bubonic的疾病模型中仍然是完全致命的，尽管在bubonic感染期间有一个较长的病程。19。生物取样研究估计自然出现的f1阴性。鼠疫菌毒株的流行率可达10-16%。18.
20。研究表明，用不同种类的lcrv进行疫苗接种，并不能提供交叉保护。假结核Y.感染20。这个场景呈现了一种情况，在这种情况下，潜在的爆发菌株鼠疫菌可以避免F1-V亚单位疫苗所提供的保护。
在一些早期的研究中30，F1-V亚基疫苗对F1阴性的免疫应答效果鼠疫菌在免疫后11周报告了该菌株。同样，突变的功效假结核Y.小鼠口服表达CAF 1基因的菌株已被发表，以对抗引起口蹄疫和肺鼠疫。33。在本研究中，我们评价了rAd5-YFV疫苗的有效性。在15周的免疫期间内，以及在对F1阴性的挑战后鼠疫菌肺鼠疫模型中的毒株。
我们的rAd5-yfv疫苗有可能缓解f1阴性的感染问题。鼠疫菌通过包含第三抗原YscF(T3SS的另一组分)而携带LcrV变异的菌株34。在父母期间鼠疫菌我们观察到单价rAd5-LcrV疫苗与rAd5-YFV三价疫苗所提供的100%保护相比略有下降(86%)。2C)。在鼠疫模型中，保护的下降更为明显(57%对100%)。二维空间)。此外，在F1-阴性期间鼠疫菌鼻内接种rAd5-LcrV疫苗仅能提供57%的保护，而三价rAd5-YFV疫苗仍能提供100%的保护。2E)。RAd5-yfv免疫所赋予的更高水平的保护，特别是对f1阴性的保护。鼠疫菌，可能与附加抗原YscF有关，因为两种疫苗中的F1成分(rAd5-LcrV和rAd5-YFV)免疫小鼠都不起作用。然而，我们谨慎地得出了这一结论，因为rAd5-LcrV与rAd5-YFV疫苗可能存在不同程度的LcrV表位暴露，从而可以更好地保护rAd5-LcrV和rAd5-YFV疫苗的感染。今后将对这些研究进行详细阐述。
回顾过去，我们更希望能生产出rAd5-FV疫苗。但是，因为我们生成了F1−突变体鼠疫菌CO9219−突变体鼠疫菌CO92将为这项研究提供所需的资料。我们选择YscF作为研究表明，用这种t3ss针状结构蛋白免疫小鼠，可以保护小鼠免受包裹的皮下注射的影响。鼠疫菌CO9235，并针对静脉注射的色素沉着位点阴性。鼠疫菌Kim菌株34。此外，我们还证明了动物的血清免疫鼠疫菌根据我们的蛋白质组学研究(未公布的数据)，CO92与YscF反应强烈。因此，我们推测保护抗原YscF可与F1和LcrV联合应用，研制出更有效的新一代rAd5-YFV疫苗。
与rAd5-LcrV疫苗相比，rAd5-YFV疫苗对小鼠的免疫应答更强。首先，rAd5-YFV疫苗免疫小鼠的抗体滴度较高，高的抗体不仅针对Rf1-V融合蛋白，而且对每个个体抗原(rf1、rLcrV和rYscF)都有较高的抗体效价。3C，d)。我们注意到rAd5-YFV和rAd5-LcrV两种疫苗的IgG 1和IgG2a滴度均高于IgG滴度(如图所示)。3)。在生物学上，情况不应如此；然而，这种情况并不少见，可以反映所使用的次级抗体的结合亲和力和特异性。事实上，在其他研究中也有报道说IgG亚类的水平高于IgG滴度。34,36,37,38。总之，三价疫苗和单价疫苗都根据IgG2a抗体滴度(IgG2a/IgG 1˃1的比值)产生了更强的Th1应答。39。IgG 1和IgG2a在保护动物免受各种感染方面有着不同的作用。40,41.
我们观察到rAd5-YFV疫苗免疫小鼠脾细胞经Rf1-V抗原体外刺激和BrdU标记后，T细胞增殖水平明显高于rAd5-LcrV免疫小鼠。4C)。在免疫小鼠的攻击过程中注射BrdU和体内感染后72小时的增殖也有类似的趋势(图一)。4C)。同样，我们也观察到CD4的数量显著增加。+干扰素γ+当rAd5-YFV接种于rAd5-LcrV疫苗时，T细胞无论是免疫后还是免疫后都是如此(见图)。4E)。此外，rAd5-YFV疫苗免疫小鼠的脾细胞上清液中产生的干扰素γ和IL-4量明显高于rAd5-LcrV免疫小鼠对感染的反应(补充图)。2C)。这些数据进一步强调了rAd5-YFV比rAd5-LcrV作为鼠疫疫苗候选的优势。
据报道，f1-V亚基疫苗通过抗体等分型，以明矾对Th2的免疫应答起调节作用。31,42。相反，rAd5-LcrV和rAd5-YFV疫苗均能产生较强的Th1和Th2-免疫应答，并且根据IgG2a/IgG 1抗体比值和Th1细胞因子的总体水平，rAd5-LcrV和rAd5-YFV均有较强的Th1和Th2免疫应答倾向(图1)。3E和补充图。2C)。Th1偏倚的反应通常与强大的细胞介导的免疫有关，而这种免疫是非洲绿猴抵抗肺鼠疫所必需的。43.
单剂量的rAd5-YFV疫苗在小鼠对亲本CO92的攻击后提供了令人印象深刻但不完全的保护(88%)(如图所示)。1C)。我们注意到在第二次注射rAd5-YFV疫苗后，抗F1-V IgG抗体滴度显著增加。3)。这种促进作用在细胞介导的免疫反应中也被观察到，因为抗原特异性CD4水平的增加。+干扰素γ+用2剂rAd5-YFV疫苗免疫小鼠，观察T细胞与单一疫苗的比较(图一)。1D)。虽然这些数据表明，需要2剂疫苗才能提供完全的保护，但在没有足够的时间完成由世卫组织制定的tpp中所概述的全面疫苗方案的情况下，在爆发的紧急情况下，可以注射1剂rad5-yfv疫苗。25.
“跨太平洋伙伴关系协定”还规定，在反应性疫苗情况下，可行的疫苗应给予至少2年的保护，对于理想的预防性使用情况，至少应给予5-10年的保护。25。我们检测到rAd5-YFV疫苗免疫小鼠在攻击后第3天，即最后一次免疫(第108天)后88天(~13周)检测到高水平的抗原特异性抗体滴度。这些数据表明，2剂量的rAd5-YFV疫苗可诱导小鼠持续的免疫应答(图一)。5G，h)。由于小鼠和人类生命阶段之间的非线性关系，很难将小鼠模型中的保护时间与人类可能产生的保护时间联系起来。44。然而，我们并没有观察到在其他疫苗研究中发现的抗体滴度在使用1-或2剂量的f1+v亚单位疫苗时的下降趋势。45,46.
我们还观察到免疫小鼠血清中F1、LcrV和YscF特异性IgA抗体水平明显高于对照组(图1)。5H)。虽然我们没有在接种前检测免疫小鼠肺中的IgA抗体，但我们注意到攻击4周后BALF中F1-V特异性IgA的水平更高(如图所示)。5H)。抗原特异性IgA抗体，尤其是在呼吸道中的抗体，对呼吸道感染和动物免疫是非常重要的。通孔经鼻途径可促进粘膜免疫的刺激。
然而，重要的是要注意，IgA在肺鼠疫中的作用尚不清楚。在Singh等人的一项研究中，IgA在保护小鼠免受肺鼠疫方面似乎是可有可无的。36。在这些研究中，Yope-lcrv是由一株弱毒株产生的。假结核Y.，动物通过口服途径免疫。我们未来的研究将充分探讨IgA在rAd5-YFV疫苗保护肺鼠疫中的作用。
在长期的研究中，我们观察到2剂量疫苗方案除了诱导高水平的抗体外，我们还观察到明显的T和B细胞增殖，以及较高的CD4百分比。+干扰素γ+和CD8+干扰素γ+免疫后和免疫后小鼠的细胞。6)。这些数据证实了所产生的体液免疫和细胞免疫反应都是健壮和长寿的，这些数据还得到了脾细胞细胞因子和趋化因子谱的进一步支持(图一)。7)和侵染病原体的快速清除(如图所示)。5C，f).
在对照组动物中，我们注意到促炎细胞因子(IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α)和趋化因子(RANTES/CCL 5和CXCL 1)明显增加，并伴有G-CSF对感染的反应(图1)。7)。这种促炎细胞因子风暴是宿主中性粒-巨噬细胞相互作用在识别入侵病原体中的典型结果。47与肺鼠疫的高度炎症状态相对应(48-72小时P.I.)，如果不能解决，就会导致动物死亡。48,49.
大量的促炎细胞因子风暴也是目前新冠肺炎患者死亡的主要原因，抗炎介质，特别是抗炎因子已成为治疗性干预的首选。43。重要的是，rAd5-yfv疫苗免疫小鼠在免疫后预防了这种促炎细胞因子风暴。鼠疫菌挑战，因为所有上述细胞因子和趋化因子在很大程度上与感染前相比没有变化(图一)。7)。感染对照组小鼠白细胞介素-10水平过高(见图)。7)总体上，Th1和Th2细胞因子水平明显降低，从而抑制了免疫反应(如图所示)。7)。相反，与对照组和感染小鼠相比，免疫动物和受感染动物的IL-10水平仍然很低(图1)。7伴随着高水平的Th1和Th2细胞因子的挑战(图)。7).
CXCL 1是中性粒细胞的重要趋化因子。在不受控制的鼠疫感染中，观察到大量的中性粒细胞，这与炎症细胞因子风暴有关。后者导致免疫介导的肺损伤，导致肺鼠疫期间的病理改变。50。另一方面，我们注意到rAd5-YFV疫苗免疫小鼠中单核/巨噬细胞相关趋化因子CCL 2/MCP 1和CCl 4/MIP 1β水平升高，而对照组对CO92感染反应不明显。7)。活化的单核/巨噬细胞流入感染部位对控制感染、清除死亡细胞和重建受损组织结构具有重要意义。除了趋化性外，CCL 2和CCl 4也参与调节宿主的免疫应答。据报道，CCL 2会影响髓系细胞的行为，从而增强宿主的防御能力、细胞的清除能力、过敏反应，以及对随后感染的主要单核细胞和巨噬细胞的反应。51.
同样，CCl 4在T细胞和体液反应的正常启动过程中扮演着重要的角色。+CD 25+T细胞群52。此外，我们观察到rAd5-YFV疫苗免疫小鼠的GM-CSF水平高于对照组。7)。与G-CSF不同的是，G-CSF在对照组小鼠中增加了对鼠疫菌延长中性粒细胞存活的挑战(图一。7)，GM-CSF是粒细胞和巨噬细胞的生长和分化因子。53。有趣的是，据报道，GM-CSF间接参与了免疫耐受和抗炎反应的诱导.更具体地说，GM-CSF通过诱导“耐受性”树突状细胞(Dc)来促进T细胞介导的耐受。53,54。因此，rAd5-yfv疫苗免疫小鼠产生的细胞因子和趋化因子明显地协调了一种强而可控的免疫反应。鼠疫菌感染，同时避免组织损伤，这与清除鼠疫菌没有任何疾病的迹象，比如皱褶的皮毛，昏昏欲睡的，驼背的姿势，或者没有梳妆打扮。我们先前的研究表明，rad5-yfv接种的nhps没有显示任何被检查器官的组织病理学病变。24.
总之，rAd5-yfv疫苗以2剂量方案诱导体液、粘膜和细胞免疫反应，保护小鼠免受父母造成的肺鼠疫。鼠疫菌CO92及其F1-缺失突变体。在未来，我们将继续研究IgA抗体的重要性及其在预防肺鼠疫中的作用，以及rAd5-yfv疫苗的预防潜力。鼠疫菌无交叉反应的LcrV变异株。此外，我们还将对rAd5-yfv和rAd5-lcrV疫苗进行更全面的比较(例如，rAd5-yfv和rAd5-lcrv疫苗的Lcrv基因，产生免疫反应的动力学)，以及YscF和F1对保护的个体贡献。
