用免疫分析面板比较人对LPS的免疫反应，体内内毒素血症与体内外比较刺激

脓毒症患者早期表现出高炎症性免疫反应，可导致器官衰竭和死亡。在我们的研究中，我们评估了人类的免疫调节。体内内毒素血症模型及与体外用38个转录标记物刺激LPS。在LPS攻击前后4小时采血，用FilmArray系统用免疫分析板(IPP)进行检测。IPP的使用表明，先天免疫的标记在对LPS的反应中起主导作用。体内，主要是与单核细胞和中性粒细胞相关的标记物。比较这两种模式，体内和体外，大多数标记以相似的方式被调控(68%)。一些细胞因子标记，如肿瘤坏死因子, 干扰素-γ和IL-1β表达不足体外相比较体内。T细胞标记要么没有改变，要么被向上调制。体外，与向下调制相比体内。有趣的是，与中性粒细胞相关的标记在相反的方向上表达，这可能是由于细胞招募和反馈回路的存在所致。体内。IPP工具能够捕捉人类的早期免疫反应。体内内毒素血症模型，一个翻译模型，模仿在脓毒症患者中观察到的免疫反应。

脓毒症的宿主免疫反应目前被认为是一种超炎症反应的初始阶段，同时伴随着一种抗炎反应，以恢复体内平衡。1。在重症监护病房(ICU)，由脓毒症引致的死亡率可高达45%。2由于器官衰竭1。管理脓毒症患者的主要挑战是，由于个体间的变异、病原体或感染源以及治疗反应的不同，宿主反应具有高度的异质性，从而导致不同的免疫轨迹和结果。3,4。许多临床试验已经进行，目前正在进行中，以测试几种免疫导向疗法的有效性，以改善患者的预后。例如，抗炎药，如白细胞介素-1受体拮抗剂(伊尔-1Ra)5免疫刺激剂，如白细胞介素-7(伊-7)6和γ干扰素(干扰素-γ)7,8,9其他有希望取得成果的国家目前正在接受评估。尽管如此，目前还不可能很容易地识别和划分不同免疫状况的患者，以便在日常的临床实践中从这种治疗中获益。10。基于免疫生物标志物的免疫分析工具的可用性可以帮助判断脓毒症患者的免疫功能障碍(超炎症或免疫抑制)。这种工具可用于个性化医学，帮助分层和分配病人可能受益于有针对性的免疫调节剂，并监测他们对治疗的反应。7,11.

脂多糖是一种高度抗原性的分子，来源于革兰氏阴性菌，通过Toll样受体-4(tlr-4)激活大量炎症级联。12。LPS刺激可以模拟脓毒症的初始急性炎症反应，两者都是。体内和体外。人类体内内毒素血症模型是一种建立良好的模型，可以从挑战后半小时至20天内捕捉宿主的反应。13. 体内内毒素血症患者在脓毒症中会出现全身感染的暂时性症状，包括发烧、寒战、头痛和恶心。这些症状伴随着血压、心率的增加，以及中性粒细胞减少、淋巴细胞减少和单核细胞缺乏。14,15。其他在免疫学研究中被广泛应用的模型是体外LPS刺激全血。使用体外模型帮助解开了许多炎症反应的潜在机制，它也可以作为免疫功能的独立测试。16。测试不同兴奋剂的安全性、无创性和灵活性使体外模型易于使用和吸引研究人员。这个体外模型在诊断领域中也被证明是有价值的，在此领域中，功能测试，如tf-α释放后的lps刺激，已经被用来测试患者外周血单个核细胞(PBMC)的免疫能力。10。这种建立良好的模型有助于在转录和蛋白质组水平上解开宿主反应的复杂性。条件体外模型更易于控制和复制，而体内该模型更好地模拟了人体或患者对炎症的反应，因为它允许除招募和动员各种免疫细胞外，还可出现正负反馈环。15,17。但是，设置一个体内人类内毒素血症模型面临诸多障碍，如各国的规章制度、志愿者的筛选和精心招募(以尽量减少异质性)、健康志愿者的潜在风险以及随后的持续监测等。

在本研究中，我们使用了我们最近描述的一个工具：免疫分析面板(IPP)，这是一种使用FilmArray系统的多重分子工具。18，用38个免疫相关转录组标记来评估宿主对LPS刺激的反应。体内。该标记小组针对几种免疫功能，细胞表面标记和免疫反应的两臂，包括炎症和抗炎反应。我们比较了基因调控体内对决体外LPS刺激健康志愿者的全血样本，以便更好地了解每种模型在捕捉宿主对内毒素血症反应的复杂性方面的能力和局限性。

健康志愿者

来自荷兰的8名健康、非吸烟、白人男性受试者(年龄18-25岁)接受了检查、筛选和招募，以研究体内人内毒素血症模型14。志愿者接受脂多糖(LPS)药丸注射(大肠杆菌O 113参考内毒素，美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院，剂量为2纳克/千克体重。全血(2.5mL)采集于PAX基因管(前分析，德国希尔登)T0(LPS注射前)和T4(LPS注射后4h)。PAX基因管经多次倒置后，按厂家推荐在室温下孵育2h，在-80°C保存至转录检测。血细胞计数用全自动血液学分析仪XN-9000进行(Sysmx，Etten-leur，荷兰)。这项研究得到了机构伦理和研究委员会的批准(阿姆斯特丹大学医疗中心所在地AMC；荷兰试验登记号码NL 4425(NTR 4549)；ClinicalTrials.gov标识符NCT 02127749)。所有受试者都给予书面知情同意，并根据赫尔辛基宣言进行研究。

为体外从8名健康志愿者(6名男性和2名女性(年龄21至55岁)从EFS(法国里昂法国血库法国血库)采集全血。1毫升肝素血液被分配到预先加热的Tru培养管(MyriadRBM，奥斯汀，TX，美国)，含有2毫升的单独培养基(NUL)或含有LPS的培养基(大肠杆菌O55：b5；100纳克/毫升)。选择Truculartuc系统作为体外模型，因为它是一个易于使用的培养管提供了标准化的培养基和LPS，因此，设计用于标准化诊断测试(目前只供研究使用)。19,20...样品在37°C的干燥块中孵育4小时，在IPP原型中直接测试。根据EFS的制度规定，献血者在献血时和到达我们实验室之前，获得了献血者的知情同意，并匿名提供了他们的个人资料。

转录组分析

受刺激全血样本(PAX基因)体内样品与真文化刺激体外)用IPP原型进行测试。18按照制造商的指示。简单地说，袋是与水化液提供的试剂盒水化。将100μL的PAX基因混合物或Tru培养混合液与该试剂盒提供的约800 L裂解缓冲液混合，直接注入袋内，并在FilmArray 2.0和FilmArray火炬仪器上运行(美国盐湖城，BioFire，Inc.)。结果在不到1小时内交付，并计算出标记的标准化表达值。18.

统计分析

用层次聚类(欧氏距离)对归一化表达值进行分析，并在热图图中对基因的差异调制进行标度分析。对主成分分析(PCA)中使用的归一化数据进行标度和中心化。用missmda软件包计算生物学参数和细胞计数中的缺失值。21，其中使用PCA模型来估计丢失的值来执行PCA-双图。基因的规范化表达水平表现为中位和四分位数范围(IQR)框和晶须图。用Mann-Whitney U检验对未配对样本进行LPS刺激前后的比较。体内抗衡体外模型)，而配对wilcoxon符号秩检验用于配对样本(体内T4型对T0型。P-值使用fdr(benamini-hochberg错误检测率)进行调整，以进行多次检测。22。显着性水平为5%双面试验。使用R软件3.5.1进行并计算了统计分析(R核心小组，奥地利维也纳)23.

基因调控体内人内毒素血症模型

IPP工具在LPS注射后4h在转录水平捕捉宿主在全血中的免疫应答。PCA表明，LPS刺激驱动了数据集中的可变性(图1)。1A)。所有未受刺激的个体(T0)都分组在小区的左侧，而被刺激的个体(T4)则稀疏地向相反方向分组。主成分-1(x轴)解释了数据集的78.7%的可变性，并分离了两个时间点(在LPS攻击之前和之后)。

在热图的上部面板上(如图所示)。1B)，在T4时可观察到20个基因的上调制。先天免疫反应的标记控制了上调的基因，其中包括炎症介质，如NFKB 1(参与炎症反应的转录因子)和阿洛5(参与花生四烯酸与炎症相关的白三烯合成)，早期促炎细胞因子。肿瘤坏死因子和IL-1抗炎细胞因子β伊-10和IL1RN，中性粒细胞表面标记物CD 177(中性粒细胞特异性标记物)、CD 64, TREM 1，和S100A9。后三种是中性粒细胞和单核细胞表面表达的标记，这两种细胞是应对LPS攻击的第一道细胞。

下面的面板突出了18个在T4时被下调的基因。其中包括单核细胞和T细胞表面标记物，以及参与T细胞活化和分化的因素。单核细胞表面标记CX3CR1(Fractalkine受体，对单核细胞的存活起主要作用)，CD 74(HLA-DR的不变链)和CIITA(主要组织相容性复合体II类反式激活剂)均为下调型。此外，T细胞标记物的表达减少，包括IL7R(与淋巴细胞发育有关)，Tbx 21(TH)1细胞特异性转录因子)ZAP 70(部分T细胞受体，在T细胞信号传递中起关键作用)表明淋巴细胞功能受损。减少CD3D(编码T细胞表面糖蛋白CD3δ链)及GATA 3(调节T细胞发育的)表达也被IPP工具捕获，这可能与淋巴细胞计数的下降有关。

大鼠的生物学参数及免疫细胞调节体内内毒素血症模型

我们在先前的研究中记录了LPS刺激前后免疫细胞绝对计数的动态变化。14。LPS刺激4h后，单核细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞明显减少，中性粒细胞计数增加2倍(补充图)。沙一).

用主成分分析(PCA)对同一组志愿者的生物学参数进行分析，确定并评价各变量对T0和T4分离的贡献。对观察到的反应贡献最大的变量是单核细胞和淋巴细胞的绝对计数，以及凝血因子II和X、凝血酶原时间(PT)、纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)、炎症细胞因子：IL6, IL8, 肿瘤坏死因子-α抗炎细胞因子IL 10(补充图。S2)。与免疫细胞计数有关的各种标记的相关性如图所示。2。S100A9和CD 177与中性粒细胞计数呈显著正相关(Pearson系数>0.7)。单核细胞计数与CX3CR1和消极的肿瘤坏死因子表达(Pearson系数>0.8)。至于淋巴细胞计数，则与CD3D和GATA 3(皮尔逊系数>0.7)。其馀生物标记物与IPP标记细胞计数的相关性均在0.7以上(Pearson系数)，这是一种强相关的指标，详见附图。S3.

为了评估免疫细胞计数的变化对基因表达的影响，我们将各标记物的表达水平调整为相应免疫细胞的绝对数量。除t0和t4外，大多数标记仍在t0和t4之间差异表达。CD 64, GATA 3和CD3D(无花果)S4)。如属CD 177和CD 74，我们观察到一个明显的差异表达，没有达到统计显着性，这可能是由于有限的样本数量。

比较体内人内毒素血症模型体外Tru培养系统中的LPS刺激

用ipp标记研究体内内毒素血症模型与内毒素血刺激体外。大多数IPP标记物(68%)在LPS刺激后均表现出相似的表达模式。对整个数据集进行PCA分析(图1)。3)，并且可以观察到未受刺激的(NUL)体外样本紧密地聚集在体内对照标本位于第一PCA轴，而受刺激样本(T4)则分组在同一轴(PC-1)的另一侧。主成分-1(x轴)代表47%的数据集可变性，4小时后将LPS的响应从等距离的未受刺激样本中分离出来。特别令人感兴趣的是pc-2(y-轴)在这一分析中，它根据模型的类型将两种LPS反应分离开来。体外或体内，解释了整个数据集的41.2%的可变性(如图所示)。3)。有趣的是，图。3表明两种模型的方差方向是相反的。导致pc-2轴差异的主要基因是：TDRD 9, 谷胱甘肽, S100A9, CD 177, TREM 1, CD 64, ALO 5，ADGRE 3和IL1RN(上调基因)体内)，以及CTLA 4, TIM3, GATA 3, IL7R, CCNB1IP1和ZAP 70基因(下调)体内).

我们通过从LPS刺激中减去每个标记物中的未受刺激的表达量，比较了两种模型之间表达模式的不同和相反的标记物(如图1所示)。4)。比较表明ADGRE 3, 阿洛5, CD 177, CD 64, GSN，S100A9和TREM 1只在体内模型，主要与早期天然免疫反应有关。4A)。相反，一些基因被下调。体内仅与适应性免疫反应有关。IL7R, CTLA 4, GATA 3, TIM3，和(国民总收入)(无花果)4B)。有趣的是，一些标记在这两种模型中有不同程度的表达，例如干扰素-γ, IL-1β，和肿瘤坏死因子，并且受到了严格的监管。体外与体内模型(图)4C)。两种模型的比较突出表明，大多数IPP标记都是以类似的模式表达的，而另一些则有趣的是，它们大多是经过调制的。体内只有，而且明显区别了这两种模式。

这个体内人内毒素血症模型是一种可用于模拟脓毒症患者急性炎症模型的翻译模型。15。一旦志愿者受到lps的挑战，天然免疫反应就会被触发，引发几个促炎级联和炎性细胞因子的分泌，随后很快就会增加中性粒细胞计数。24。中性粒细胞减少、单核细胞减少、嗜酸性粒细胞减少和淋巴细胞减少的高峰出现在内毒素激发后2~4h。体内25,26,27,28。这种最初的全身炎症反应与抗炎反应同时发生，以恢复体内平衡.在脓毒症中，这种免疫反应可能成为失调，造成有害的后果。免疫分析面板(IPP)的使用有助于捕捉在体内内毒素血症模型。中性粒细胞相关标记物增加(S100A9，TREM 1中性粒细胞特异性标记物CD 17729)反映中性粒细胞的招募和活化增加，而中性粒细胞的表达增加。CD 64可能意味着中性粒细胞计数的增加。单核细胞表面标记的向下调制(CX3CR1，CIITA和CD 74，HLA-DR的代孕标记物。30)提示单核细胞失活。自适应免疫标记物的向下调制GNLY，Tbx 21，RORγt，CTLA 4)强调淋巴细胞功能、信号传导和T活化的改变H1、TH17和T雷格细胞。什么时候CD3D和GATA 3经调节淋巴细胞计数后，表现为无差异表达，提示其表达可能主要反映淋巴细胞减少。促炎细胞因子和抗炎细胞因子的表达，如肿瘤坏死因子，IL-1β，IFN-γ，IL 10和IL1RN刺激后(如图所示)。1B)。每一种调制都指向一种功能改变，类似于脓毒症患者所观察到的急性炎症期。31。这些结果强调了使用新的分子工具(如ICU床边的IPP)来帮助描述处于危险中的患者的免疫特征的可能性，从而使基于免疫标记的个性化药物成为可能。

在本研究的第二部分，我们将38个ip标记与体外LPS刺激4h后全血。大多数标记(~70%)以相似的方式和方向表达，在大小上没有显著差异(数据未显示)。这两种模型之间的微小差异可能是由于使用不同的健康志愿者或LPS的类型和浓度所致。最近，包括在我们的小组中的两个标记s100a9和trem 1被鉴定为lps剂量依赖性的，它们的表达随着lps剂量的增加而增加。32。奇怪的是，有些标记，如肿瘤坏死因子高表达体外与体内模型IL 10两种模型的表达水平相同(如图所示)。4C)。这些结果与Dorresteijn报告的蛋白质数据不同。等人.，哪里肿瘤坏死因子和IL 10高水平体内相比较体外17。在我们的数据中，IL-1β和干扰素-γ高表达体外相比较体内经过4小时的刺激，这与Dorresteijn的研究结果一致等人。刺激后24小时蛋白质水平17。尽管如此，不同的时间方案和标记物的性质(转录组和蛋白质)也可能导致上述报告的差异。有时，组织中细胞因子的局部产生会产生“溢出效应”，即组织可以向外周血中注入细胞因子，从而提高血清水平。33。虽然转录试验比蛋白质检测更敏感，但转录后调节机制可能因组织而异，而mrna的检测并不一定意味着其翻译。17。转录本的稳定性也会影响他们在血液中的检测，例如，IL1RN4小时后，mrna在血液中保持有效并可被检测到。IL-1β它迅速衰变(T)1/2~1.8小时)34。从体外模型到体内模特。

有趣的是，一些标记在这两种模型之间表现出相反的表达模式。这些标记大多与中性粒细胞有关，例如CD 177以及CD 64, S100A9和TREM 1在单核细胞和中性粒细胞表面都有高表达。这种现象是可以观察到的。体内由于LPS直接刺激循环中性粒细胞，并从骨髓中吸收新的中性粒细胞。25,29。另外，体外模型主要依赖于外周血，而体内有组织和血液的隔间，对检测到的反应有积极的贡献。但是，对于体外缺乏反馈回路、细胞招募和与组织室沟通的模型。我们的数据还表明，在适应性免疫反应标记中的向下调制CTLA 4、GATA 3、GNLY、IL7和TIM3)与T细胞的功能和激活有关。体内模特。这一有趣的观察可能是由于抗原提呈细胞激活LPS后T细胞的能力降低所致。35.

我们的一个限制是使用不同的大肠杆菌LPs血清型和浓度可能导致两种模型所观察到的宿主反应的差异。然而，我们想要评估体外和体内模型用来捕捉宿主对LPS的反应的复杂性，并以标准化的方式理解它们的局限性。这将有助于提供有关工具捕获此类调制的能力的洞察力和数据，这将使其可与未来的研究和工具用户相比较。另一个限制是使用混合性别的人口。体外模型与全男性人口的比较体内，这可能会影响两种模型在免疫反应方面的差异。韦格纳等人。观察到女性对脂多糖的促炎细胞因子反应高于男性，仅显著高于男性。体内但不是体外36。尽管如此，我们还是对现实主义项目中的健康志愿者群体(n=180)进行了初步分析。37到目前为止，我们还没有观察到包含在IPP工具中的转录标记物(未公布的数据)与性别相关的显著差异。

据我们所知，这是第一次报告直接比较体内和体外用转录免疫标记法建立LPS刺激后4小时的模型。这项研究强调，在解释和推断某些标记的结果时，必须小心谨慎。体外模特。我们的研究还强调了如何使用免疫分析面板来捕捉和描述宿主的免疫反应。体内LPS刺激4h后。使用体内人内毒素血症模型显示基因调控和改变，类似于早期炎症反应所观察到的脓毒症综合征和其他危急情况在ICU。然而，在脓毒症中，免疫反应可能会出现复杂的调节失调，例如早期的免疫抑制，这使得很难预测疾病的发展轨迹或结果。对脓毒症新的免疫治疗方法进行了100多项临床试验，这些试验主要针对急性临床表现患者全身炎症反应的调节。然而，几乎所有这些试验都没有在市场上产生新的治疗方法。这些临床试验可能会失败，因为所有的病人都是以同样的方式治疗的，而且很少采用病人分层的方法。11,38。脓毒症患者有不同的反应，基于免疫生物标记物的病人分层策略可以帮助识别单个患者的功能障碍。11。免疫分析工具可以指导有针对性免疫治疗的使用，并有助于未来临床试验的成功。人体IPP检测体内内毒素血症模型显示了该工具在判断危重病人免疫状态方面的潜在价值。免疫分析面板上只有5分钟，免疫标记是直接从全血中检测出来的，结果可以在不到一个小时内完成。IPP的易用性和快速周转时间表明，与现有技术相比，IPP在床边的应用前景广阔，这些技术提供了关于主机响应的有限信息，并且需要漫长而复杂的技术程序。我们的下一步是评估IPP标记物在一组危重患者中的能力和预测性能，将高危患者分层，并使其能够使用新的免疫疗法和个性化药物。