靶向多表位转换使CAR T细胞的直接阳性/阴性选择成为可能

嵌合抗原受体(CAR)T细胞技术为治疗癌症患者提供了成功的新概念，在淋巴恶性肿瘤中有很高的缓解率。这种细胞治疗是建立在自体T淋巴细胞的基础上的，这些T淋巴细胞经过基因改造，可以表达一种识别肿瘤相关抗原的CAR，并介导相应肿瘤细胞的消除。目前的限制包括繁琐的制造程序以及严重的免疫副作用对CAR T细胞的使用。为了克服这些限制，我们将rqr 8，一种包含CD 34表位的多表位分子和两个CD 20微表位，与CD 19靶向的CAR结合在一起。CD 52轨迹。利用crispr-ca 9和基于腺相关病毒的供体载体，约60%的基因组编辑T细胞是car。+/CD 20+/CD 34+/CD 52−没有进一步的选择。经CD 34标记阳性选择后，纯度可提高到95%以上。这些表位转换的CAR T细胞保持了对CD 19的杀伤能力。+在补体依赖性细胞毒性试验中，肿瘤细胞对阿利姆图单抗(抗CD 52)耐药，对利妥昔单抗(抗CD 20)敏感.综上所述，基于基因编辑的多表位转换是一种很有前途的研究进展，有可能改善CAR T细胞的制备过程和临床安全性。

近几年，CD 19靶向嵌合抗原受体(CAR)T细胞治疗B细胞急性淋巴细胞白血病(B ALL)的完全缓解率较高，弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和慢性淋巴细胞白血病(CLAL)的应答率均较低[1,2,3]。随后，FDA和EMA批准了新的药物，如体素亮氨酸[4[[]]和轴心缩二烯(Ciloleucel)[5]，用于治疗复发或难治性CD 19+B-ALL和DLBCL，分别[6]。几个研究小组正在开发其他CAR T细胞，以使目标肿瘤类型多样化，包括实体肿瘤[7]。虽然CD 19-CAR T细胞治疗已被证明能成功地减轻肿瘤患者的肿瘤负担，但还需要进一步的工程来提高这种新型细胞免疫治疗的安全性、特异性和有效性。各种临床试验报告了严重的副作用，如神经毒性、靶外肿瘤活动、肿瘤溶解综合征和细胞因子释放综合征(Crs)，其中一些副作用与患者的肿瘤负担成正比。8,9,10]。目前，通过逆转录病毒或慢病毒基因转移将CAR整合在一起，制造CAR T细胞通常是以工程患者来源的自体T细胞为基础的。11, 12[根据良好的制造惯例(GMP)[13]。而逆转录病毒载体在过去一直与插入性癌的发生有关[14]，在CAR T细胞治疗中还没有观察到这种现象。尽管如此，靶向的CAR整合，例如利用基于腺相关病毒(AAV)的载体与设计型核酸酶相结合，可能会提供更安全的解决方案，并提供有益的CAR表达谱[15, 16]。有针对性的基因组编辑的使用已经产生了有希望的方法。特拉克[15, 17, 18], CD 52 [18, 19]，和/或PD-1[20]，产生具有其他特征的CAR T细胞，如无异源反应性，对临床使用的CD 52抗体Alemtuzumab耐药或较高的持久性。设计者核酸酶技术在汽车T细胞领域开辟了更多的机会，包括基因或免疫安全开关的集成，例如iCasp或RQR 8，这些开关允许在制造过程中或在病人输注后对工程细胞进行阳性或阴性选择。RQR 8尤其是由QBEnd 10组成的免疫安全开关[21一个CD 34表位，可用于制造过程中的阳性选择，两个CD 20咪表位可被fda批准的CD 20抗体rituximab[22,23,24,25)，以及用于膜锚定的CD8柄(图1.1A).

在这项研究中，我们的目标是通过靶向表位转换来产生CAR T细胞，这些T细胞在两种制造过程中都可以被积极和/或消极地选择，并且在病人输注时具有基于抗体的选择的潜力。为此，我们将CRISPR-Cas9技术与基于AAV的矢量系统相结合[26]将car-rqr 8表达盒定向集成到CD 52原代T细胞位点(图1.1A)。我们证明CD 52位点可以进行高效的基因组编辑以及由此产生的抗原表位转换的car(Ecar)T细胞CD 20。−/CD 34−/CD 52+→CD 20+/CD 34+/CD 52−，可用于简化在制造过程中基因编辑细胞的富集，采用基于磁珠的选择策略。此外，我们还发现，ESCAR T细胞对消耗T淋巴细胞的Alemtuzumab具有抵抗力，同时对B细胞消耗抗体rituximab敏感。因此，在保留对CD 19的强力杀伤能力的同时+肿瘤细胞结合预期细胞因子的分泌对抗原致敏，这些ESCAR T细胞具有有价值的选择特点，可简化制造方案，并有可能在体内特异性耗竭。

抗体

使用了以下抗体：抗人CD 52-fITC(克隆h 186，BioLegend，California，California，cat#316004)，CD 19-car检测试剂(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国，CAT#130-115-965)，抗生物素-PE(克隆REA 746，Miltenyi Biotec，cat#130-110-951)，抗生物素-fITC(Miltenyi Biotec，cat#130-090-857)，抗人CD 34(QbEnd 10-apc，R&D系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国明尼阿波利斯，#cat fb7272a)，抗人-25(cd4克隆)CAT#130-113-282)，Alemtuzumab(美国马萨诸塞州剑桥，GenzyCorporation，NDC 58468-0357-3)，rituximab(罗氏，巴塞尔，瑞士，Pzn#8709904)，抗人IgG山羊F(ab‘)2-PE(南生物技术公司，阿拉巴马州伯明翰，美国，CAT#204209)。7-氨基放线菌素D(7-AAD，Invitrogen，Carlsbad，California，cat#A 1310)和碘化丙啶(PI，Sigma-Aldrich，St.Louis，Misroui，USA，CAT#P 4170)。Dpbs(热费舍尔科学/GIBCO，Waltham，美国马萨诸塞州，CAT#14190250)用于洗涤和制备FACS缓冲液(DPBS，5%FBS，0.1%Na)+-叠氮和2毫米EDTA)。

AAV载体产生

将HDR供体克隆到质粒pSUB 201中。27使用NEBuilderHiFi DNA组装主混合(NEB，Ipswich，马萨诸塞州，美国，#E2621S)。它由左(482 Bp)和右(488 Bp)的同调臂(HA)组成。CD 52CD19-car(FMC 63)[28]、P2A[29和RQR 8[24]。AAV 6矢量粒子如前所述[30，和AAV载体滴度的ddPCR评估[31].

细胞和培养基

所有细胞在37℃下5%CO存在下培养。2。用密度梯度离心法(Ficoll-Paque)从白细胞减少系统室分离外周血单个核细胞(PBMCs)。PBMC和原代T细胞在RPMI 1640培养基(热费雪科学/GIBCO，CAT#61870-010)中添加10%胎牛血清(FBS，PAN-Biotech，Adenbach，德国艾登巴赫，CAT#P40-47500)，1%青霉素-链霉素(P/S，Sigma-Aldrich，CAT#P 0781)，10 mm HEPES(Sigma-Aldrich，CAT#H 3375)和人白细胞介素-2(IL-2)100 U/ml(免疫球蛋白，Friesoythe，德国，CAT#11340027)。人IL-7(Miltenyi Biotec，CAT#130-095-361)25 U/ml，IL-15(Miltenyi Biotec，CAT#130-095-762)50 U/ml。将HEK293T细胞(ATCC，Manassas，Virginia，USA，CRL-3216™)培养于含10%FBS，1%P/S，1%丙酮酸钠(Biochrom，英国剑桥，CAT#L 0473)的高糖GlutaMAX培养基(ThermoFisher Science/GIBCO，CAT#10566016)中。NALM 6(DSMZ，Braunschweg，德国，CAT#ACC 128)和K 562(DSMZ，CAT#ACC 10)细胞在RPMI 1640+10%FBS和1%P/S的培养基中培养。没有定期执行Str分析。

T细胞基因工程

人CD3/CD 28/CD2 T细胞激活因子(5l/10)解冻活化PBMC的实验研究6干细胞)(干细胞技术，温哥华，加拿大，CAT#10970)。三天后，核糖核酸(RNP)复合物被转移到1×106单元使用EO-115程序(4D-Nucleofector，Lonza，巴塞尔，瑞士)和工具包P3(Lonza，CAT#V4XP-3032)遵循制造商的指示。在电穿孔前，将20 pmol的SpCas9蛋白(PNA Bio，Newbury Park，USA，cat#CP 02)和112.5 pmol的合成gRNA(Synthego，California，California，USA)在RT下孵育10 min。电穿孔后，加入1000 U/ml IL-2的新鲜完整培养基进行细胞恢复。细胞分裂为四口井(0.25×10)。696孔U形底部微板(Falcon，Fisher Science，新罕布什尔州，新罕布什尔州，CAT#08-772-54)的细胞/井)，电穿孔后15分钟用指示量的AAV载体颗粒转导。

基因分型

对T7内切酶1(T7E1)进行了如前所述的分析[32]。简单地说，基因组DNA是用QIAAmDNA微量试剂盒(齐根，德国希尔登，猫#51104)提取的。这个CD 52用引物CD 52(Fwd)5‘-AGTCCTGATCTTATCCCA和CD 52(Rev)5’-GGCACTGCCTCACTTCT对100 ng基因组DNA进行PCR扩增。对于NGS，基因组CD 52如上文所述，扩大了目标区域。用NEBNext Ultra II DNA文库准备试剂盒(NEB，CAT#E7645L)和NEBNext多重寡核苷酸(NEB)进行文库的制备。使用一种用于Illumina TruSeq(Abd serotec Bio-Rad，Hercules，USA，American，cat#186-3040)的ddPCR文库定量工具包来测量库浓度。随后，使用Illumina MiSeq(Illumina，San Diego，California，USA)对库中的4 pmol进行了测序，并使用CRISPResso 2命令行版本对数据进行了分析。33].

目的基因整合是由一对引物，包括5‘或3’连接位点的入外PCR来确认的。CD 52(无花果)1A)：5‘端(Fwd)5’-TGTCAAAGCAGGAAGCAGTC；5‘端(Rev)5’-GCAGCAGCTGGCAGCAGTAGCCGGGGGGGTTCCTC；3‘末端(Fd)5’-AACTCTCGCTGGAAGCAGG；3‘端(Rev)5’-ATGTCCAGGGGGGGGGGGCATC。PCR反应包括10μM dNTP混合液、10μM引物、5倍PHRER反应缓冲液、2 5 ng基因组DNA热启动II DNA聚合酶(ThermoFisher Science，cat#F122S)，PCR条件为：98℃5 min，98°C 30 s，66°C 30 s，72℃72 s(5‘)/42 s(3’)，72°C延伸5 min。

流式细胞术分析

用于染色，1×105用规定的抗体在4°C的FACS缓冲液中洗涤和染色20~30 min。当染色包括CD 19-CAR检测试剂时，在RT黑暗中孵育40 min。采用BD Accuri C6流式细胞仪(BD生物科学，美国加利福尼亚州圣何塞)进行数据采集；用FlowjoV 10(BD生物科学)进行数据分析。

补体依赖性细胞毒性试验

T细胞在1×10下被镀5细胞/井(96平底井，Sarstedt，Nümbrecht，德国，CAT#83.3924.500)，在200升完整的RPMI 1640培养基中，有或没有抗体(Alemtuzumab，10 g/ml；rituximab 50 g/ml)和/或20 l幼兔补体(Abd serotec Bio-Rad，CAT#C12CA)。细胞在37℃下孵育2h，再用7-AAD染色，在BD Accuri C6流式细胞仪上用流式细胞仪检测细胞毒性。

CAR T细胞介导的细胞毒性和细胞因子释放

共计1×104效应细胞ESCAR T细胞和1×104靶细胞(NALM 6-gfp，k 562-gfp)在无细胞因子的完整培养基中，在rpmi 1640的rpmi 1640培养基中，按1：1的效靶比(E：t)共培养。1天和2天后，收集细胞，加入pi排除死亡细胞，并加入活的gfp细胞数。+在BD Accuri C6流式细胞仪上用流式细胞仪检测细胞。在指定的时间点采集细胞上清液，用细胞计量学珠阵列(CBA、BD生物科学)测定IFN-γ、GM-CSF和颗粒酶B的释放程度。采用BD FACSCanto II型流式细胞仪(BD生物科学，美国加利福尼亚州圣何塞)进行数据采集；用FlowJoV 10进行数据分析。

ESCAR T细胞磁珠的选择

用CD 34微珠试剂盒超纯人(Miltenyi Biotec，CAT#130-100-453)纯化ESCAR T细胞，采用Macs-LD柱(Miltenyi Biotec，CAT#130-042-901)。在BD Accuri C6流式细胞仪上用流式细胞仪检测其富集程度。

统计

除了在无花果中的实验外，所有的实验都被复制了至少三次作为独立的实验。4C-f和S3c-e，表示单个实验的三个技术复制的数据(N=1)。除非另有说明，否则进行方差分析(双向，等方差)，用Tukey的多重比较来确定统计学上的显着性差异。用于统计分析，如图所示。3E学生的t采用不成对、等方差、双尾检验。*、**和*表示P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001, respectively. The center values reported are the mean and error bars represent standard deviation of at least three independent experiments, if not indicated otherwise. All data meet the assumptions of the tests used. No data were excluded from analysis due to outlying data points. GraphPad 8.4.3 (GraphPad, San Diego, California, USA) was used for data analysis and creation of graphs.

原代T细胞高效靶向基因的研究

为了目标CD 52，设计了几个gRNAs，将Cas9核酸酶定向到该位点的第2外显子(数据未显示)。用电穿孔法将CRISPR-Cas核酸酶的RNP复合物转移到原代PBMCs的T细胞中。T7E1基因分型证实了靶位点插入/缺失(Indel)突变的有效形成(图1)。1B)，并通过新一代靶向序列分析验证了该方法的有效性。1C)。80%以上的等位基因含有突变，其中+1和−2位点是最常见的等位基因。S1a)，这可能是T7E1和NGS数据不一致的原因。同时，第二代CD 19靶向CAR(FMC 63)通过P2A序列连接到RQR 8，被克隆到AAV主干中，包装成AAV血清型6(AAV 6)载体。这位AAV 6供体长约500 bp，对CD 52目标区域。CAR-P2A-RQR8盒在短伸长因子1α启动子的控制下，保证了结构的稳定表达。1A)。将CAR-P2A-RQR 8集成到CD 52，1×106用RNPs电穿孔活化的T细胞，然后随AAV 6颗粒(1×10)的增加而立即转导。4至5×104每个单元格的矢量副本)。培养22天，进行基因分型分析。用T7E1法测定编辑频率CD 52所有样本(≈45%的indels)的目标位点与AAV的数量无关(图1)。1B)。进行了5‘和3’连接的PCR反应，证实了car-P2A-rqr 8结构与car-P2A-rqr 8结构的定向整合。CD 52轨迹(图)1D)。从凝胶中提取PCR扩增产物，序列分析证实了结构的正确整合(数据未显示)。

流式细胞仪对基因编辑的T细胞进行表型分析并没有显示我们的治疗条件有任何实质性的毒性，即使AAV 6颗粒含量最高(图一)。2A)。存活率从第6天的>60%提高到第10天的80%-90%。对CD 52表达的评估证实了CD 52基因编辑的有效性和稳定性，多达90%的T细胞是CD 52。–至少22天(图1)。2B)。此外，cd19-car/rqr 8基因稳定表达，其中75%的T细胞为car。+/CD 52−(无花果)2C)和高达60%的淋巴细胞RQR 8+/CD 52−(无花果)二维空间)至少22天。CAR/RQR 8双染证明几乎所有RQR 8+T细胞表达CD 19-CAR。S1b)。实验证实，一个单一的生产步骤可以产生高达80%的ESCAR T细胞，而无需进一步的选择。

ESCAR T细胞对阿利姆图单抗耐药和利妥昔单抗敏感

工程ESCAR T细胞表型(CD 52)−/RQR 8+)应产生CD 19-靶向T细胞，这些T细胞同时具有抗阿利姆珠单抗和利妥昔单抗敏感性。CDC检查证实了这些特征。在补体存在的情况下，无论是抗体介导的杀伤细胞，表达相应的表位(图)。3A，b)。经7-AAD染色，Alemtuzumab诱导90~95%的T细胞死亡，未处理(UT)细胞和AAV 6供体在不存在RNP(AAV)的情况下均可诱导T细胞死亡。相反，CRISPR-CA介导的CD 52基因敲除(RNP)或靶向整合的CAR-RQR8盒(RNP+AAV)分别对约60%-70%的T细胞产生抗性。3A和S2A)。无论是“培养基”(N)，“只补体”(C)，还是“单抗”(AB)，均未观察到明显的细胞杀伤作用。以证实细胞杀伤是CD 52所特有的+T细胞，流式细胞术在疾病预防控制中心(CDC前)和治疗后(如图所示)进行.S2B)。实验证实CD 52+但不是CD 52–细胞对Alemtuzumab介导的CDC敏感，使编辑后的T细胞群体的富集几乎达到100%。

应用CD 20靶向利妥昔单抗在CDC检测中，诱导表达RQR 8的ESCAR T细胞死亡。3B)。对照组标本中未检出死细胞。同样，流式细胞仪对前、后rituximab-cdc样本的分析证实了rqr 8的特异性消除。+T细胞(图1.S2C)。结论表明，ESCAR T细胞对阿利姆图单抗耐药，对利妥昔单抗敏感。

ESCAR T细胞有效杀伤CD 19+肿瘤细胞

为了证明所构建的ESCAR T细胞仍有功能，我们将ESCAR T细胞与CD 19共培养。+NALM 6细胞和CD 19–K 562细胞为了便于细胞毒性试验的读出，这些细胞株组成地表达gfp，从而使我们能够通过追踪gfp的耗竭来量化CD 19靶向细胞的杀伤作用。+随着时间的推移细胞。对照组T细胞(UT)和ESCAR T细胞分别与NALM6-GFP和K 562-GFP细胞按1：1E：T比例共培养，分别于24和48h后进行靶向杀伤。同时收集上清液进行IFN-γ、GM-CSF和颗粒酶B分泌的分析。ESCAR T细胞有效地消除NALM 6细胞，达到≈90%的GFP耗竭。+细胞培养48h后(见图)。3C)。相反，当ESCAR T细胞与K 562细胞共培养时，gfp的数量也随之增加。+细胞保持不变(图)。三维空间)。上清液分析显示，ESCAR T细胞释放干扰素γ、颗粒酶B和GM-CSF，但未见UT对照细胞释放。3E).

筛选和富集的ESCAR T细胞保持其特性和功能

值得注意的是，CD 19-CAR和RQR 8阳性的ESCAR T细胞的比例似乎有10%-20%的发散。2C，d和S1b)，这与我们从与本研究无关的γ逆转录病毒转导实验中得到的结果是一致的。在这种情况下，RQR 8/dLNGFR结构的逆转录病毒传递显示这两种蛋白的表达水平有更高的差异(图一)。S3A)。因此，我们推测这种差异主要是由于不同的抗体染色效率所致，但我们不能排除T细胞活化状态可能与观察到的差异有关。因此，我们通过连续的抗原暴露来挑战ESCAR T细胞，通过与照射的NALM 6细胞连续共培养长达9天。在不同的时间点，我们追踪了ESCAR T细胞CD 25、CD 19-CAR和RQR 8的表达水平。CD 25染色显示ESCAR T细胞有较强的活化作用(图1)。S3b与RQR 8表达增强有关，CD 19-CAR和RQR 8双阳性率>80%。3F)。重要的是，ESCAR T细胞与CD 19连续共培养。+靶细胞既不影响对阿利姆图单抗的耐药性，也不影响利妥昔单抗的敏感性(见图)。S3c，d).

RQR 8提供的ESCAR T细胞表位谱有助于利用商业选择系统富集基因编辑的T细胞。使用基于QBEnd 10的系统选择CD 34+细胞产生近90%的纯cd19-car。+/RQR 8+ESCAR T细胞群(图1.4A，b)。为验证选择对ESCAR T细胞的敏感性、耐药特性和功能均无影响，采用CDC法和细胞毒性试验对ESCAR T细胞在选择前后进行比较。CDC试验证明，ESCAR T细胞对阿仑图单抗的抗性或对利妥昔单抗的敏感性与其对应的预先选择相似(图一)。4C，d)。然而，正如预期的那样，与预选相比，ESCAR T细胞对alemtuzumab的敏感性略低，反映了CD 52的减少。+细胞(图1.4C)。相反，在后选ESCAR T细胞中死亡细胞的频率越高，rituximab敏感的rqr 8的比例越高。+ESCAR T细胞(图1.4D)。预先选择的ESCAR T细胞与后选的ESCAR T细胞的细胞毒活性无显着性差异。这两个群体对CD 19都有较高的效应器活性。+肿瘤细胞4E)但不是CD 19–细胞(图1.S3e)，强调CD 34表位选择保留了ESCAR T细胞的功能。通过测定细胞因子的释放，证实了效应物的活性。双双ESCAR T预和ESCAR T岗细胞在接触CD 19时释放出类似量的干扰素γ、颗粒酶B和GM-CSF。+肿瘤细胞4F)。因此，QBEnd 10磁珠选择是一种简单有效的纯化ESCAR T细胞的方法，既不影响其功能，也不影响其免疫原性。

虽然CAR T细胞疗法已成功地引入临床治疗各种血液恶性肿瘤[4, 5它仍与影响患者整体预后的免疫副作用有关。9, 10]。例如，CRS是一种常见且严重的免疫副作用，其基础是活化的CAR T细胞释放高浓度的细胞因子。为了减轻或控制这些症状，人们做出了许多努力来改造汽车T细胞。在本研究中，我们对CD 19-靶向的CAR T细胞进行了基因编辑，引入免疫安全开关，使患者在制造过程中和给药后体内均能在体外进行阳性或阴性选择。而一些团体则证明CD 52授予对alemtuzumab[18, 19]，其他实验室已证明RQR 8对利妥昔单抗在体外和体内选择性清除CAR T细胞有帮助。18, 24]。本文首次将CRISPR-Cas9与AAV载体技术相结合，首次证明了RQR 8多表位安全开关可以一次性替代CD 52。我们证实，由此产生的ESCAR T细胞维持其杀伤CD 19的能力。+靶细胞和用RQR 8替代CD 52使ESCAR T细胞对利妥昔单抗敏感，对阿利姆图单抗耐药。

CD 52存在于成熟淋巴细胞表面。CD 52抗体Alemtuzumab与淋巴细胞的结合可通过补体介导的细胞毒性促进其清除。34]。在临床实践中，使用alemtuzumab，例如，诱导造血干细胞移植受者的淋巴耗竭，以防止移植排斥[35, 36]，或作为治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)的一种方法[37]。另一方面，用嵌合单克隆CD 20抗体rituximab治疗某些自身免疫性疾病和以B细胞为基础的恶性肿瘤，如非霍奇金淋巴瘤和B-CLL，通过诱导B淋巴细胞的耗竭来治疗。38, 39]。在CD 19靶向的CAR T细胞中用RQR 8替代CD 52，将在持续的阿利姆图单抗治疗中保护ESCAR T细胞，如干细胞移植后所表明的那样。另一方面，对利妥昔单抗的敏感性提供了一个有用的安全特性。如果出现以CAR T细胞为基础的严重副作用的迹象，通过注射利妥昔单抗可以有效地消除工程T淋巴细胞。以前的一项临床研究发现，当使用CD 19-car T细胞共同表达rqr 8安全开关时，患者体内注入的所有CAR T细胞都会遇到问题，表明系统存在“泄漏”[18]。其他种类的自杀开关也显示出这样逃避预期的整车T细胞损耗[40]。进一步的研究需要阐明ESCAR T细胞的靶向整合原理在体内是否表现得更好，并产生更高的消耗效率。在这个体外研究中，几乎所有的RQR 8+T细胞经利妥昔单抗处理后可清除。我们将这一观察归功于我们的car-P2A-rqr 8盒式磁带的设计，它允许我们为qben 10进行富集，从而产生高度富集的rituximab敏感的rqr 8。+细胞。我们假设，几乎完全耗尽CAR T细胞将显著减轻潜在的副作用。值得注意的是，利妥昔单抗诱导的B细胞耗竭不会影响记忆B细胞和血浆细胞，从而确保在停止抗体治疗后B细胞谱系的恢复[38, 41].

虽然CAR和RQR 8的表达是遗传相关的，但我们观察到CD19-CAR和RQR 8在细胞表面的表达水平存在差异。使用类似的结构，其他人在此之前已经表明RQR 8的表达低于基因连锁的CAR表达[18]。虽然我们不能排除使用的抗体结合这些标记具有不同的亲和力/亲和力，但我们推测RQR 8不能很好地传递到细胞表面或不稳定。如图所示，暴露于含抗原细胞后激活ESCAR T细胞似乎既提高了rqr 8的表达水平，又增加了rqr 8的比例。+提示T细胞活化对RQR 8转运或稳定性有有利作用。

AAV载体是一种特别好的基因组编辑模板，其目的是针对原始T细胞中的特定位点进行CAR整合。15, 17, 42]。转化基因的半随机整合，如与逆转录病毒或慢病毒载体的整合，可能会产生不可预测的基因型和异常表型的不良结果[14]。据我们所知，设计核酸酶介导的靶向整合与AAV载体尚未与插入癌的发生相联系，但仍然能够进行高效的基因编辑。在本研究中，我们达到的基因靶向频率高达70%，细胞毒性最小，并在选择之前。CAR转基因表达稳定至少1个月。新的CAR T细胞制造策略，即从白细胞置换产物中预先选择CD4/CD8，通过提高转导效率，提高CAR T细胞产品的制造可行性，促进了CAR T细胞的产生。43]。未来的研究将不得不研究这一原则在我们的ESCAR T细胞策略中的可转移性。进一步的发展可能包括将cd19-car/rqr 8结构的集成与“通用”的汽车T细胞的概念结合起来，即通过将cd19-car/rqr 8结构集成到特拉克轨迹。

以前曾报道过原发性T淋巴细胞的高基因靶向频率。特拉克和CCR 5 [15, 17, 42)，表明我们在这里观察到的高效率与CD 52定位于支持HDR的细胞环境。另一方面，我们的数据显示随机集成的CAR-RQR8盒式磁带，虽然在低频率(1-3%)。这与我们和其他人以前的报道是一致的，这些报告表明aAV载体可以通过非同源的末端连接途径整合到dna双链断裂中。44,45,46,47]。我们不认为这一事实会影响ESCAR T细胞在体内的整体功能和安全性，因为利妥昔单抗治疗也会耗尽CD 52。+汽车T细胞。