抗cfae纳米粒子对主要致病性肠毒素有广泛的交叉保护作用

肠毒素大肠杆菌(ETEC)估计每年在世界各地的零星或流行病爆发期间造成约38万人死亡。由于ETEC菌株的巨大异质性，开发ETEC疫苗具有很大的挑战性。一种有效的疫苗必须是多组分的，才能覆盖10多个具有遗传变异的ETEC菌株。目前还没有获得许可的疫苗来预防ETEC。纳米体是治疗黏膜感染性疾病的一种成功的新生物制剂，因为它们能识别高度可变病原体上的保守表位。与单克隆抗体相比，由多个纳米体组成的鸡尾酒可以以更低的成本提供更广泛的表位覆盖。通过纳米体识别保守的表位，也可以帮助逆向工程制备一种有效的ETEC疫苗。通过从免疫羊驼和天然酵母展示库中筛选克隆因子粘附蛋白的纳米体，我们在体外鉴定了对11个主要致病性ETEC菌株具有交叉保护作用的单个纳米小体。口服纳米体可显著减少细菌在动物体内的定植。此外，与用于预防ETEC所致腹泻的商品高免疫牛初乳产品相比，纳米体-IgA融合在小鼠定植过程中表现出更强的抑制活性。结构分析表明，纳米体在ETEC粘附素的受体结合区识别出高度保守的表位。我们的发现支持进一步合理设计泛ETEC疫苗，以激发针对这一保守表位的强有力的免疫应答。

肠毒素大肠杆菌(ETEC)是五岁以下儿童、发展中国家的成年人和前往流行区的旅行者腹泻的最常见原因之一。根据世卫组织的报告，与ETEC有关的腹泻是发展中国家五岁以下儿童死亡的主要原因之一。即使儿童在etecc感染中幸存下来，也会在一生中产生长期的影响，包括营养不良、认知发展受损、学习障碍和成年后患非传染性疾病的风险增加。1,2,3,4,5。ETEC感染的特点是腹泻、呕吐、胃痉挛，在某些情况下还伴有轻度发烧。据估计，每年有1 000万例病例发生在疫区的旅行者和军事人员中。3。当成年旅行者出现ETEC腹泻时，短期使用抗生素可以减少腹泻的持续时间和体积。然而，ETEC菌株对抗生素的耐药性越来越强。4.

ETEC是一种非侵入性病原体，通过细菌表面结构介导小肠粘附，这种结构被称为定植因子(CFS)。一旦与小肠结合，细菌就会产生毒素，导致肠道细胞的水净流，导致水样腹泻。.开发一种抗ETEC细菌附着和定植的有效疫苗，一直被认为是防治ETEC腹泻的有效途径。CFA/I是最常见的CFS之一，由CfaE，尖端小粘附素亚基和均聚物结构亚基CFAB组成。在人类临床试验中，口服抗cfae牛IgG对60%以上的试验组的强毒株ETEC有保护作用，提示以粘附素为基础的疫苗能够有效地诱导内源性保护性抗体的产生。6。我们实验室最近的研究表明，当口服给小鼠和非人类灵长类动物时，抗cfae人单克隆抗体可抑制细菌在小肠内的定植，并可保护动物免受与ETEC感染有关的腹泻。7,8.

ETEC株在抗原上是多样的，已鉴定出25种以上的CF和Coli表面抗原(Cs)。4,9,10,11。CFA/I代表第5类毛的原型，这是人类最大的一种特定的CFS，导致大多数中到重度ETEC腹泻病例。10,11,12。第5类毛包括3个亚类，5a(CFA/I，CS4，CS 14)，5b(CS1，CS 17，CS 19，PCF 071)和5c(CS2)。其它非5类菌毛也与地方病和旅行者腹泻病有牵连，包括螺旋型cs5、纤维cs3、cs21和非菌毛cs6粘附素。13。因此，研制一种针对所有主要致病性ETEC株的广泛保护性和可能的多组分疫苗仍然是疫苗设计中最重要的挑战之一。14,15。从理论上讲，一种交叉保护疫苗可以由完整的cfs组合而成。16。然而，这种战略可能导致意外的不稳定或安全问题，以及制造生产的高成本。尽管抗ETEC疫苗研究取得了进展，但仍然没有针对ETEC的许可疫苗.

骆驼类重链可变区(vhhs或毫微体)的发现为抗体衍生生物制剂提供了一种新的应用。17。纳米体由一个高度稳定和可溶的单抗原结合可变区(15 KDa)组成，因为它们是由没有关联轻链的重链抗体衍生而来的。18。与传统抗体不同的是，纳米体可以获得不同的抗原位点(例如，酶活性位点、病毒糖蛋白的凹区)，这是因为它具有较小的平行直径和较长的互补决定区3(Cdr 3)，能够形成手指状延伸。17,19。根据其独特的特性，纳米体可以识别高变异病原体上的保守表位，如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒、诺沃克病毒和冠状病毒。20,21,22,23,24。因此，由于纳米体具有良好的溶解性和热稳定性，在临床试验中被广泛应用于全身和口服治疗疾病的临床试验中。25,26,27.

在这项研究中，我们发现了一组纳米粒子，它们对11种主要的致病菌株ETEC表现出广泛的保护作用。口服所选择的纳米体可保护小鼠不被5种不同的ETEC在体内定植。结构分析表明，在ETEC粘附素的受体结合区，纳米小体具有高度保守的表位。由于在本研究中发现的纳米体具有广泛的菌株覆盖范围，可作为预防/治疗多种ETEC菌株所致腹泻的药物。此外，本研究所描述的保守表位可用于泛ETEC疫苗的结构设计。

从免疫羊驼和酵母展示库中鉴定抗ETEC纳米体

为了产生对ETEC粘附素具有广泛交叉反应能力的纳米体，用8种5类ETEC粘附素的N端片段皮下免疫了两只雄性羊驼(见图)。1a)。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清对粘附素的反应，并分离pbmc，生成大小约为10的噬菌体库。8如前所述28。由于克隆因子抗原CS1和CS2的同源性相对较低，因此首次将文库应用于固定化克隆因子抗原CS1和CS2的筛选。这些奶制品的产量用于随后在CfaE上进行的一轮盘问。制备胞浆提取物，并在ELISA中检测其与8种粘附素抗原的结合情况。交叉反应的克隆被送去进行序列测定和进一步的鉴定。从这些选择中，选出了26个候选纳米体。

同时，我们使用了最近开发的一个由合成纳米体组成的库，该库显示在酿酒酵母29。用FITC和AlexaFluor 647标记的CfaE N端片段进行两轮磁激活细胞分选(MACS)，以鉴定CfaE结合克隆(图1)。1b)。用荧光活化细胞分选(Fcs)富集高亲和力的结合剂，降低fITC标记的cfaE的浓度。29,30。从酵母库筛选中获得了大约300个酵母克隆。用流式细胞仪对AlexaFluor 647标记的CfaE进行酵母表面染色，验证所选克隆与抗原的结合。克隆与CfaE(补体图)有一定的结合活性。1)。所有的结合剂都接受了针对另外两种5类粘附素CS1和CS2的交叉反应的筛选(图1和cs2)。1c)。共选择了30个具有交叉反应活性和独特序列的纳米粒子进行进一步的表征。此外，我们还对一种强效的抗cfae全长抗体68-61进行了竞争性fcs筛选，以鉴定cfae受体结合区特有的纳米体。8。一个克隆，2R215，发现与68-61重叠表位(图)。1D，补充数字2).

所选择的抗cfae纳米粒子对所有5类定植因子都表现出交叉反应能力。

为了测试交叉反应的宽度，选择的美洲驼和酵母衍生的纳米体被测序，克隆在pet-26b载体上，表达在E.coli，用ELISA法检测与8种5类粘附素的结合情况。根据两个酵母来源克隆(2R215和2R23)和两个牦牛无性系(1D7和1H4)对多种粘附素的广泛反应，筛选出了两个克隆(图1)。2(a-D)然后对四种铅纳米体进行了抑制甘露糖抗性血凝试验(MRHA)对表达CFA/I的ETEC株(H 10407)的抑制作用，该菌株是最常见的5类粘附素。所有纳米粒子均表现出最大抑制浓度(IC)。100)在微摩尔浓度范围内(2.4-8M)。2e)。接下来，我们在MRHA实验中检测了这些纳米体是否对表达其他6种5类粘附素的ETEC菌株具有活性。与酶联免疫吸附试验的数据一致，这四种纳米小体对所有六种菌株都有交叉保护作用。100活动范围为0.4125至13.3微米(补充表)1)。我们接下来检测了纳米粒子对表达其它致病性毛和非毛粘附素的ETEC菌株的MRHA活性，包括螺旋CS5、纤维CS3和非伞CS6粘附素，以及引起粘附素CS 21的另一种常见腹泻。令人惊讶的是，四个纳米体对所有测试菌株都有广泛的保护作用。100范围从0.52至10M(补充表)1).

抗Cfae vhh抑制小鼠小肠ETEC定植

如上文所述，在小鼠ETEC定植模型中进一步评估了铅纳米体。8(无花果)3a)。5只DBA/2小鼠口服灌胃，混合细菌和抗CfaE纳米小体。除2R23外，所有纳米粒子均以100 mg/kg进行测试，2R23由于产量低而在50 mg/kg范围内进行了测试。攻击后24h，对小鼠进行安乐死，计数小肠内的菌落形成单位(CFU)，测定细菌的定植水平。对抗CfaE纳米体的有效性进行了评估，确定与不相关的纳米体控制相比，纳米体是否能防止细菌与小肠的粘附/定植。在抗CfaE纳米体处理组中，与无关的纳米体对照组相比，2R215、2H4、1.7和2R23的CFU分别减少了2.9、2.3、1.7和1.5。P < 0.01 for 2R215 and P < 0.05 for 2R23, 1D7 and 1H4). These results indicate that all four nanobodies showed significant activity in preventing colonization by H10407 strain at a dose of 50 or 100 mg/kg (Fig. 3b)。

该纳米铅体，2r215，然后测试致病性ETEC菌株表达其他粘附素，通常从ETEC相关腹泻疾病，包括cs1，cs3，cs5，cs6和cs21。11,13。2R215对所有被测菌株具有广泛的保护作用。与不相关的对照相比，2R215在100 mg/kg时对表达CS1的ETEC菌株(2.1 log)的CFU显著减少。P < 0.01), CS3 (4.4 log, P < 0.001), CS5 (2.2 log, P < 0.01) and CS6 (2 log, P < 0.01), but not the strain expressing CS21 (1.2 log, P>0.05)。3c)。

多聚化增强2R215的体内外效力

单畴纳米粒子的多聚化可以提高其稳定性和效价。28,31。为了提高已鉴定的交叉保护纳米体的效力，采用3×或6×(G4S)连接剂在N到C串联的末端取向(图1)中构建了2R215作为二聚体或三聚体分子。4a)。多层纳米体在细菌中表达，并用融合的HIS标记进行纯化(图一)。4b)。二聚体和三聚体2R215在Caco 2细胞粘附试验中相对于各自的单体显示出更强的粘附能力。集成电路50单体2R215为10.213μm，二聚体2R215为5.09mM，三聚体2R215为1.06M。(无花果)4c)。用IC技术也提高了MRHA的活性。1006.7M为单体，1.25为二聚体，2.5为三聚体2R215(P < 0.01 and P < 0.05 for dimeric and trimeric forms respectively) (Fig. 4d)。

在小鼠定植模型中进一步研究了2R215的二聚体和三聚体。接种ETEC 10 mg/kg二聚体或三聚体2R215的小鼠在定植过程中，对数下降3.5和2.8。P < 0.0001) compared to the monomeric 2R215 treated group at the same dose (Fig. 4e)。此外，2R 215的二聚体和三聚体在细菌攻击前2h与单体相比仍保持其活性。二聚体和三聚体2R25预处理使总CFU减少1.9 log(P < 0.001) and 2 log (P < 0.01) respectively (Fig. 4f)。这些结果表明，单体纳米体的多聚化可以提高胃内的稳定性和保护能力。应该指出的是，我们目前的多用户化策略(使用G4S链接器)是在前人研究的基础上选择作为概念证明的。28。我们预计，与其他连接物的多聚化可能会提供更大的稳定性或更好的效力，我们将在今后的研究中进行研究。

IGAFC融合增强2R215和1D7的体内效力

为了获得效应功能和改善黏膜稳定性，可以将IgA fc结构域作为iafc融合体(vhh-IgA)进行口服给药。32。为了构建vhh-IgA fc融合体，将2r215和1d7作为二价vhh-fc融合体嫁接到IgA 1和IgA 2的fc结构域(vhh-iga 1和vhh-ig A2)上。33(无花果)5a)。2R215和1D7 VHH-IgA 1和VHH-IgA 2融合体在Expi 293细胞中表达，经聚丙烯酰胺凝胶电泳证实融合蛋白大小。5b)。酶联免疫吸附试验(ELISA)中，与单聚纳米体2R215和1D7相比，融合体与粘附素的结合活性提高。5c，D)。2R215和1D7融合体用ETEC H10407株进行小鼠定植试验。单体2R15和1D7在100 mg/kg时抑制定植。3B)在低剂量10 mg/kg时，IgA融合体表现出较强的抑制活性。6(a-D)其次，最有效的融合体，1D7 VHH-IgA1(3.5log减少CFU，P < 0.001) and 2R215 VHH-IgA2 (5 log reduction in CFU, P < 0.001), were examined in a pre-treatment model. Animals were orally inoculated with fusionbodies 1 h prior to ETEC challenge. Fusionbody treatment resulted in reduction of CFUs by 1.2 log for 2R215 VHH-IgA2 (P < 0.01) and 2.7 log for 1D7 VHH-IgA1 (P < 0.0001) (Fig. 6c，D)。此外，1D7VHH-IgA1融合体在预处理时间延长至2h时仍保持活性，1D7VHH-IgA1处理组与不相关对照组相比，总CFU下降1.7个对数。P < 0.0001) (Fig. 6e)。我们还比较了1D7 VHH-IgA 1融合体与用于预防ETEC所致腹泻的商品高免疫牛初乳(HBS)-Travelan的活性。当使用40 mg/kg时，Travelan在处理前1h显示出活性(补充图)。3)，预处理2h后不抑制定植(见图)。6e)。

铅抗ETEC VHHs的表位定位

为了阐明抗ETEC纳米体与粘附素相互作用的分子基础，我们进行了计算分析和实验诱变，绘制了纳米体结合的决定因素图。通过侧链表面暴露分析、序列保存和对接模拟(BioLumate，Schr dinger Release-2018-3，Schr dinger，LLC，New，NY，2016)，确定了CfaE上感兴趣的残基，并通过酶联免疫吸附试验(ELISA)将其突变为丙氨酸，对纳米体结合的影响进行了实验测试。选择突变的大部分残基位于假定的受体结合口袋中，而该区域以外的其他保守和表面暴露位点也被检测。

实验结合亲和力测试表明，在假定的受体结合口袋中的几个高度保守的残基是纳米体结合的关键决定因素(补充表)。2)。图中显示了残基取代对铅纳米粒子2R215和1D7的CfaE结构的结合作用。7。高度保守的受体结合口袋残基R67和R 181是2R215和1D7结合的共同决定簇，此外还有R182和Y 183，后者在CfaE表面暴露得很好(见图)。7B、E)。值得注意的是，cfae的r 181在体外器官培养中对ETEC的结合至关重要。34。R181A取代对纳米体1D7结合的影响有限(<20%破坏)，表明该残基相对于R67、R182和Y 183等其他区域的结合较少。其他残基，包括L64和Y65，对丙氨酸的取代作用表现出不同的2R215和1D7结合作用，表明在纳米体-粘附素识别方面存在细微差异。在推测的受体结合区以外的保守残基中，丙氨酸的替代也被测试，P46A对结合没有影响，而Y156A则意外地导致了纳米体结合的中度丧失。由于Y156A与可能的纳米体结合位点的距离，Y156A的取代可能对CfaE有变构效应，从而导致假定的受体结合口袋的结构或动力学发生变化。为了观察2R215和1D7纳米体与cfae接触的可能模式，我们使用zdoCK对模拟的纳米体进行了全球对接模拟。35CfaE的非结合结构(PDB编码2HB0)。基于聚类分析，我们确定了与表位映射数据相一致的模型，2R215和1D7模型针对CfaE上的关键结合残基。7C、f)。

序列比对显示，在至少8个5类粘附素中，这些残基大部分高度保守。36，这与我们观察到的这些纳米粒子对多种ETEC菌株具有广泛的交叉保护作用是一致的(图一)。7g)。

ETEC菌株具有高度的抗原多样性，表达25种以上的黏附因子。研制一种对引起腹泻病的不同菌株具有广泛覆盖范围的泛ETEC疫苗一直是非常具有挑战性的。在本研究中，我们使用牦牛免疫和合成酵母库筛选来识别高可变粘附素上高度保守的表位的一组纳米体，并对其进行了表征。在50个分离的纳米体中，4个铅纳米体对11个致病性ETEC菌株和受保护的动物表现出广泛的覆盖范围。

纳米体的多聚化和IgA fc融合已成为提高肌力和粘膜半衰期的有效途径。28。最近的研究表明，在植物和微生物中生产各种形式的纳米体是可行的。高水平的VHH-IgA融合体能有效地在酵母和大豆中产生，并已被证明对仔猪肠上皮细胞有有效的黏膜保护作用。33,37。此外，酵母和大米中产生的抗轮状病毒vhh(Arp 1)也能保护小鼠幼犬免受轮状病毒引起的腹泻。38,39。口服酵母产生的ARP 1对减轻严重轮状病毒相关性腹泻的男婴腹泻是安全有效的。40.

在缺乏泛ETEC疫苗的情况下，我们的研究提供了第一个概念的证明，即在感染前或感染期间口服纳米体可以对各种ETEC菌株提供广泛的保护。本研究中所描述的纳米小体在HAI试验中显示出对导致ETEC株的11种主要疾病的广泛交叉保护，并且当被测试的6株ETEC中有5株受到攻击时，阻止了在体内的定植。

此外，为了进一步扩大纳米体对ETEC菌株的覆盖范围，可以使用由两个或更多个纳米体组成的混合物。

与用于预防ETEC所致腹泻的商业HBC产品Travelan相比，1D7 VHH-IgA 1融合体在小鼠定植模型(在CFU中减少1.7log)中，在ETEC攻击前2小时似乎具有活性，在低剂量(10 mg/kg融合体与40 mg/kg Travelan)时有效。

纳米体对修饰和优化的适宜性，以及在植物和微生物中大规模制造生物蛋白的技术进步，将使基于纳米身体的免疫疗法成为ETEC的一种有效和成本效益高的预防或治疗方法。

我们先前描述了cfaE N端结构域的一个带正电荷的结合口袋，它对ETEC与宿主上皮细胞上带负电荷的唾液酸的相互作用很重要。8。该结合袋是由三个精氨酸残基，R67，R 181和R 182，以及一簇周围的残基组成，这些残基都高度保守在第5类毛状虫粘附素中。精氨酸残基的突变导致ETEC与宿主细胞的结合活性完全丧失。34。在本研究中发现的交叉保护纳米体被发现集中在这个关键的位置，为合理的疫苗设计提供了一个目标来集中于这个区域的免疫反应。最近的工作强调了基于结构的抗原设计的成功，以激发对关键保守表位的反应，包括复杂的表位结构。41。这些纳米体中的一个或多个与具有代表性的绒毛粘附素结合的实验结构测定可以确定基于映射的结合模型，并作为合理的ETEC疫苗设计的基础，以产生免疫原，从而激发针对这一保守位点的强有力的反应。