临床和突变信息 用Illumina450K甲基化阵列分析了84例临床散发性原发性PanNET和11例正常邻近胰腺。斯卡帕等人的临床和基因组信息。 2 (补充数据) 1 )用于了解甲基化模式识别的潜在PanNETs亚组。队列中有32名女性和52名男性，34名G1，48名G2，2名G3(世卫组织，2019年)和11名功能性肿瘤。该队列包括9个肿瘤，这些肿瘤中存在体细胞突变。 ATRX 基因，21 达克斯 和31 MEN 1 。也有四个肿瘤 MEN 1 种系变体(补充数据) 1 ).
甲基化亚基 为了确定癌症特异性dna甲基化有可能将PanNET分层，我们选择了位于启动子区域的cpG位点，这些位点没有被甲基化( β -值<0.3)所有11例正常邻近胰腺标本。在通过质量过滤的411,159个CpG位点中，161,299个位点在正常胰腺中没有甲基化( β- 值<0.3，其中111,113位于基因启动子区(TSS 1500，TSS 200，5‘-非翻译区(5’-UTR)，或1 stExon)。在后11113个站点中，共有3378个CPGS有 β -SD值>所有肿瘤DNA甲基化水平的0.20。通过上述探针的选择，我们期望减少来自肿瘤样本中的非肿瘤细胞的潜在混杂信号。对这3378个最可变启动子CpG位点的甲基化水平进行了二分法和无监督聚类，在肿瘤样本中发现了三个不同的聚类，提示了PanNETs(补充图)的潜在亚组。 1 )。在整个基因组中选择探针时，也发现了相似的亚组(补充图)。 2 )
甲基化亚组与常见突变基因的关系 MEN 1 , 达克斯 和 ATRX ，并具有临床特征 三个PanNETs亚组(称为T1，T2和T3)由甲基化模式确定(补充图)。 1 )显示出与临床和基因组特征的潜在联系(见图)。 1A )。T1亚组占队列的26.2%，在PanNET中，三个最常见的突变基因的突变显著减少( ATRX , 达克斯 和 (P-adj≤0.02，图1. 1B )。此亚组为功能性肿瘤(11例功能性肿瘤中有7例，补充数据)。 1 )。T2亚组占队列的42.9%；该亚组的肿瘤因突变而富集。 ATRX 和 达克斯 (P-adj≤0.003. 1C )，明显大于其他两个亚组的肿瘤(p-adj≤0.0003，图1)。 1D )，端粒较长(p-adj≤0.00008，图1)。 1E )并呈现出端粒交替延长的高频率(p-adj≤0.0001，图1). 1A )。T2亚群的肿瘤也有较高的肿瘤突变负担(每mb点突变)(p-adj≤0.03，图1)。 1F )和80%的mTOR通路基因突变(补充数据) 1 )。各亚组患者年龄及性别分布无显着性差异，但T1亚组肿瘤含量略低于其他两个亚组(p-adj=0.018，图1)。 1A 和补充数据 1 MEN 1 (占队列的30.9%)，G1型肿瘤的比例较高(p-adj=0.001，图1)。 1A )和较低频率的胰腺外扩张，神经周围和血管的侵袭(图一)。 1g-i )，提示一组预后较好的肿瘤。
图1：84个原发肿瘤的甲基化特征和无监督分级聚类鉴定的Pannet亚组。 肿瘤(列)以与附图所示的二分法聚类相同的顺序呈现。 1 . a 亚组与基因组和临床特征的关系。 b T1亚群显示野生型肿瘤明显富集。 MEN 1 /Daxx/ATRX 基因(Fisher的精确测试)。 c T2亚型肿瘤因突变而富集。 ATRX 和 达克斯 基因(Fisher的精确测试)。 d T2亚群肿瘤大于其他两个亚组(Wilcoxon秩和检验)。 e T2亚群肿瘤端粒较长(Wilcoxon秩和检验)。 f T2亚型肿瘤每兆位酶(Mb)的突变率高于其他亚组(Wilcoxon秩和检验)。 g T3亚型肿瘤的胰腺外扩散明显低于其他亚组(Fisher‘s精确检验)。 h T3亚型肿瘤有减少神经周浸润的趋势。 i T3亚型肿瘤的血管浸润较其他两个亚组少。丙氨酸转氨酶状态：用C-尾灵qPCR评估端粒的可替代延长 2 ALT+Ve：ALT阳性，ALT−Ve：ALT阴性；端粒比率：端粒重复序列在肿瘤和正常样本中均计数，并用qMotif归一化为样本的平均基因组覆盖率。 2 对于肿瘤和匹配的正常样本和比率给我们一个缩短或延长与正常样本相比的指示。功能性PANETs：过度分泌生物活性激素的肿瘤。方框中的方框表示从第一个到第三个分位数的一系列值，其中的线表示分布的中值。晶须代表分布的最大值和最小值，不包括离群值，星号代表任何离群值。
甲基化亚组与体细胞拷贝数变化的关系 以前的研究报告了与拷贝数变化相关的PanNET亚组。 2 ,5 。为了研究拷贝数的改变与甲基化亚组(T1-T3)的关系，我们比较了由斯卡帕等人产生的拷贝数数据。 2 甲基化数据(如图所示)。 2 )。亚组t1具有拷贝数的异质型，主要为野生型。 ATRX /达克斯 /MEN 1 。T2亚组在第1、2、3、6、8、10、11、15、16、21和22染色体上重复LOH。T3亚型肿瘤以二倍体基因组为主，第11号染色体反复缺失。接下来我们研究了肿瘤甲基化的聚类是否会受到各组间观察到的不同拷贝数的影响，更确切地说，如果拷贝数的丢失会导致甲基化的丧失。我们评估了6861个(411,159个CpG位点中)大多数可变CpG位点的甲基化水平( β -SD≥值为0.20，位于T2亚组染色体启动子区，表现为反复LOH(补充图)。 3 )。我们还评估了7316个变量最多的探针( β -sd≥0.2值跨肿瘤)位于基因体内(补充图)。 4 )。与其他亚组(T1和T3)相比，T2亚型肿瘤CpG位点甲基化水平较低，多数肿瘤在11条染色体上反复丢失或LOH。
图2：甲基化亚基与基因组特征的关联。 肿瘤(列)以与附图所示的二分法聚类相同的顺序表示。 1 . a 突变 ATRX , 达克斯 和 MEN 1 基因，端粒的交替延长(ALT)和端粒长度。 b 染色体臂受LOH影响的比例。 c 染色体臂之间的中位logr比率，作为拷贝数变化的参考(通过提供等位基因比率的估计)。采用欧氏距离法和Ward聚类法对染色体臂拷贝数和LOH(行)进行聚类。
亚组间差异甲基化基因及其与基因表达的相关性 接下来，我们比较了三个亚组(由3378个在正常邻近胰腺中未甲基化的肿瘤中发现的大多数可变探针)，以确定整个基因组中不同的甲基化位点，并获得一些可能区分这些基因群的生物学方面的潜在洞察力。在411,159个GPG位点中，我们发现了至少一对不同的亚组之间甲基化的11,042个GPG位点。其中3603个定位于基因启动子区域，7439个定位于基因组其他区域。在T1和T2亚组中，共有6185个CpG位点被甲基化( q < 0.05 and a difference of average β -≥值0.20)，其中1884个位于基因启动子区域(补充数据) 2 )。CPG位点(4044)在T1和T3之间存在差异甲基化(1563个CPGS位于启动子区域，补充数据) 3 和3586在T2和T3之间(启动子区域有1113个CPGS，补充数据) 4 )。在评价受差异甲基化CpG位点影响的基因数目时，有2630个基因在T1和T2亚组之间存在CpG位点差异甲基化，有1401个基因存在差异甲基化，启动子区域差异甲基化。当比较T1和T3甲基化时，1907个基因与1025个基因存在差异甲基化CpG位点，启动子差异甲基化。在T2和T3之间，1731个基因与CpG“CpG位点”启动子区的834个位点发生了差异甲基化(补充数据) 5 ).
然后，我们对有RNA测序(RNAseq)数据的47例病例进行了甲基化水平和基因表达的相关性分析。CPG位点定位于基因，并在至少一对亚组之间被甲基化，目的是了解可能受到异常甲基化影响的潜在生物学机制。在11,042个CpG位点中，7303个CpG位点定位于4317个基因(TSS 1500、TSS 200、5‘-UTR、第一外显子、基因体或3’-UTR)。在这些基因中，987个基因被认为低于检测极限(876个基因的每百万计数(CPM)<3,111个在RNAseq数据中没有记录)，被排除在相关估计之外。共有1573个CpG位点的甲基化水平与910个基因的基因表达呈显著相关(补充数据)。 5 )。共有35个基因有5个或更多的差异甲基化CpG位点，与该基因的表达显著相关，其中12个基因是转录调节因子(补充数据)。 6 )。相关性为正相关和负相关性，这取决于基因中差异甲基化探针的位置和基因。每个亚组的基因表达和甲基化的详细信息汇编在补充数据中。 6 。在35条基因中，有3条基因表达与甲基化之间存在显著的相关性，此前有报道称，在PanNET的亚组中，O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶( MGMT )21 、胰十二指肠室1( PDX 1 )4 和Caspase 8( Casp8 )12 ,14
基因体甲基化 MGMT T2亚组肿瘤明显低于其他组(T1和T3)。T2肿瘤还表现为染色体10q臂的反复缺失，包括 MGMT (无花果) 3A )。在我们的队列中，46个CpG站点映射到 MGMT 基因(45个基因体和1个到启动子区域)在各亚组间存在差异甲基化，并与基因表达呈正相关(补充数据)。 5 还有无花果。 3B )。只有一个cpG位点(Cg 24420981)位于 MGMT 至少有一对亚组之间存在差异甲基化，而且出乎意料地也与表达呈正相关。基因体甲基化及其表达 MGMT T2亚组肿瘤低于T1和T3组肿瘤 MGMT 甲基化在这些亚组之间没有不同程度的甲基化(如图所示)。 3C，d )。基因体的低甲基化加上LOH可能导致低表达 MGMT 在T2子群内。我们研究了这两个基因的甲基化水平。 MGMT ，E型蛋白酪氨酸磷酸酶受体( PTPRE )和EBF转录因子3( EBF 3 )，也没有观察到T2亚组肿瘤中基因体甲基化的缺失(补充数据)。 6 )，提示基因特异性缺失的基因体甲基化 MGMT .
图3： MGMT 基因。 肿瘤(列)以与附图所示的二分法聚类相同的顺序表示。 1 . a MGMT 通过过滤器的基因。探针由5‘到3’方向的基因组坐标绘制。位于左侧的46个cpgs位点在肿瘤亚组间差异甲基化，并与 MGMT 用RNAseq数据评估47例患者的基因表达。正常邻近胰腺CpG位点的甲基化水平 MGMT 基因出现在右边。 b 44个CpG位点甲基化中位数的相关性 MGMT 基因体和 MGMT 用RNAseq数据表达47例。 c 平均甲基化水平 MGMT T2亚组肿瘤基因体CpG位点( n =36)vs.T_1和T_3子群( n =48)。 d 基因表达水平 MGMT 用RNAseq数据分析47例基因(T2) n =17、T1和T3 n =30)。方框中的方框表示从第一个到第三个分位数的一系列值，其中的线表示分布的中值。晶须代表分布的最大值和最小值，不包括离群值，星号代表任何离群值。
这个 PDX 1 3个亚组间有19个CpG位点差异甲基化，其中6个与基因表达呈显著负相关(补充数据)。 5 和补充图。 7A n =2)，在身体内( n =2)和3‘-UTR( n =2)的基因(补充图)。 7b，c )。在我们的队列中， PDX 1 基因在T2和T3(突变体)的肿瘤中表现出高甲基化的CpG位点。 ATRX /达克斯 /MEN 1 )与T1亚组中的肿瘤相比，这些基因主要是野生型的，这一亚组对于功能性肿瘤来说是丰富的(补充图1)。 7D，e )。只有一种更高的基因表达的趋势 PDX 1 在亚组T1中(附图)。 7F )。这些结果需要谨慎对待，因为我们只有47例(T1亚组中的8例)有基因表达。Chan等人 4 提出了两个分化的基因 ATRX /达克斯 /MEN 1 野生型PanNET突变体，与Aristaless相关的同源盒( ARX )和 PDX 1 。如 ARX 基因位于X染色体上，通常从甲基化分析中删除，我们对此进行了评估。 ARX 甲基化模式。我们观察到各组间甲基化水平没有差异(补充图)。 8 )甚至在分别评估男性和女性时(补充数据) 7 )。然而，我们观察到T2和T3的基因表达高于T1(野生型肿瘤)。这与以前的研究是一致的。 4 ,22 的甲基化状态 ARX 可能不会影响基因的表达。 PDX 1 低表达和高甲基化 ATRX /达克斯 /MEN 1 突变型肿瘤(T2和T3)高于野生型肿瘤(T1)。此外，大多数样品具有强烈的低甲基化 PDX 1 T1亚组为功能性肿瘤(附图)。 7A ). PDX 1 表达被认为是胰腺β-细胞的标志。 23 。我们利用Muraro等人描述的标记基因研究了胰腺α-和β-细胞类型的基因表达谱。 23 (补充图。 9 )。尽管病例数量不多，但我们的数据表明T1亚组肿瘤有更高的与β-细胞相关的标记物的表达，这支持了先前的报道，即这些肿瘤可能起源于胰腺β-细胞。
鉴定起源细胞不是本研究的主要目的，而是最近研究的一个组成部分。 15 ,16 ,17 已经确定了PANET与α-或β-胰岛细胞和肿瘤发生途径的相似之处。考虑到这一点，我们比较了五个胰岛细胞(两个α-和三个β-胰岛细胞)。 24 我们的小组。补充图 10 结果表明，α-和β-胰岛细胞之间甲基化程度最高的一组探针表明T1肿瘤为β样肿瘤，T2和T3肿瘤为α样肿瘤，这与47个肿瘤的基因表达谱与RNAseq和最近的文献一致。
