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蛋白纯化后是否存在活性如何判断

发表时间:2019-07-19 16:52作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com

蛋白纯化后是否存在活性如何判断


根据具体的蛋白性质和需要,可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。

1,凝胶电泳:一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质,或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。

2,光谱学方法:可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱(CD)等,利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测,但一般只用于复性研究中的过程检测。

3,色谱方法:如IEX、RP-HPLC、CE等,由于两种状态的蛋白色谱行为不同,

4,生物学活性及比活测定:一般用细胞方法或生化方法进行测定,较好的反映了复性蛋白的活性,值得注意的是,不同的测活方法测得的结果不同,而且常常不能完全反映体内活性。

5,黏度和浊度测定:复性后的蛋白溶解度增加,变性状态时由于疏水残基暴露,一般水溶性很差,大多形成可见的沉淀析出。

6,免疫学方法:如ELISA、WESTERN等,特别是对结构决定簇的抗体检验,比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。

不可溶、无生物活性的包涵体必须经过变性、复性才能获得天然结构以及生物活性,因此应该选择一个合适的复性过程来实现蛋白质的正确折叠,获得生物活性,近年来的研究可以使复杂的疏水蛋白、多结构域蛋白、寡聚蛋白、含二硫键蛋白在体外成功复性。

在正常的生理条件下,组成蛋白质的多肽链都能以独特的方式进行折叠,形成自己特有的空间结构,以执行某一些生命活动。当外界环境改变时,可能造成基因突变和蛋白质序列改变,错误剪接和运输,错误折叠和异常聚积,形成对机体有害的反应,引起构象病的发生和无生物活性、不可溶的包涵体形成。目前对包涵体形成和复性过程中发生聚集的机制尚不清楚,许多已建立的高效复性方法是在反复实验和优化的基础上建立的,且没有普遍性,但从这许许多多的个例中发现了一些规律:如聚集的发生是由链间的疏水相互作用介导、聚集具有相对特异性、折叠中间体可能具有不同的作用等等,并利用这些知识建立了一些重组蛋白质高效复兴性的方法。相信随着结构生物学、生物信息学、蛋白质工程学及相关新技术和新设备的发展和完善。


文章分类: 蛋白技术资料
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